CC BY
75
© е. В. Кузенко
УДК 612. 014. 46:616. 314. 28-073 С. В. Кузенко
ЗМШИ ДНК ТКАНИН ПАРОДОНТУ ПРИ ЗАПАЛЕНН
Медичний шститут СумДУ (м. Суми)
Дана робота виконана в рамках науково-дослщ-но! роботи «Морфогенез загальнопатолопчних про-цеЫв», № держ. реeстрацiI 013U003315.
Вступ. Людство обтяжено рiзними мута^я-ми, як накопичувались пiд час еволюцп. Постiйний мутацiйний процес надае новi мутацiI в генофонд людства, внаслщок чого штучний вiдбiр зберiгае або примножуе чи приводить до зникнення окре-мих генiв. У людини описанi наступнi види мутацiй: мюенс, нонсенс, здвиг рамки зчитування, деле^я, iнверсiя, порушення сплайсингу, збiльшення числа експреси тринуклешових повторiв.
Рiзнi ендогенн та екзогеннi причиннi фактори захворювань пародонту грають роль довготрива-лих стресових аген^в, якi викликають зрив клггинно! адаптацiI, внаслiдок чого виникае пригычення бю-логiчноI активностi субстра^в, зокрема ферментiв дихання, та порушення морфогенетичних структур пов'язаних з ними [2].
Запалення тканин пародонту невщ'емно пов'я-зано з загально-соматичним станом хворого [12]. Одним з механiзмiв такого взаемозв'язку е поява продук^в, як спричиняють утворення алкiлуючих аген^в. Сучаснi дослiдники [1, 3, 4] стверджують, що перекисне окислення лтщв та бiлкiв сприяе прогресуванню запально-дистрофiчних процесiв у тканинах пародонта i е ключовим патогенетичним механiзмом його розвитку. Втьы радикали спричиняють пошкодження лiпiдiв та бiлкiв мембран та часткового окислення азотистих основ ДНК.
Накопичення супероксид- юыв е широко визна-ним джерелом окисного пошкодження в патогенезi iнтоксикацiI свинцем. Фукс та ш. [8] також отрима-ли свiдчення генотоксичного ефекту солей важких металiв. Вони показали, що юнцевий продукт окислення 5-dioxovaleric е алкiлуючим агентом залишюв гуанiну ДНК. Дослiдники повiдомили про пщвищен-ня рiвня 7-, 8-окЫгуаына, 8-дигiдродезоксигуанiна i 5-гiдроксидезоксiцитозина в ДНК.
На нашу думку бтьш небезпечним е пошкодження ДНК пародонту яке спричинено алкшуванням.Ен-догенн алкiлувальнi речовини в невеликiй ктькост утворюються в органiзмi у нормк Збiльшення !х кть-костi спричиняе рiзнi соматично-патологiчнi стани [13].
Хроычне запалення тканин, яке викликане Campylobacter rectus та Helicobacter pylori, призводить до посилення метилування промотора Igf2, hMLH1.
Аналiз даних, отриманих дослщниками, свiдчить про зменшення експреси гена COX-2, PTGS2 (циклоок-сигенази-2 або постогландин-ендопероксщсинте-тази-2) внаслiдок метилування [5].
Експериментально створен радикулярнi кюти та гранульоми у щурiв мали патолопчне алюлуван-ня гена IFNG епiтелiальноI вистилки [10]. Подiбни-ми дослщженнями, щодо гена IFNG [9], доведена наявнють патологiчного метилування при гострих пнпвтах. Мiшель Батiз та ш. [11] на 34 зразках тканин пародонта пюля кюретажу показали патологiчне метилування гуанiну гена IL-10 у позицiях 373, -352, -350, -320 та -185. Етгенетичы змши (фiзiологiчне метилування) у генах е природнiм для соматичних кгмтин. Зняття метильних груп з промоторно! д^ лянки спричиняе його експресю Гостре запалення пародонта призводить до деметилування гена IL-6 та веде до збтьшення бткового продукту [7]. П-перметилування азотистих основ геыв E-Cadherin та COX- 2 у хворих на пародонтити показано у робот ВЫг Лу [6].
Мета дослiдження. За допомогою метода шф-рачервоно! спектрофотометрiI дослiдити змiни метилування ДНК тканин пародонту померлих вщ за-гальносоматичних захворювань.
Об'ект i методи дослiдження. Робота фунту-еться на класичному методологiчному тдход^ що ви-користовуеться у сучасних доотдженнях. Нами були використанi тканини пародонту 56 померлих вщ соматично! патологи, яким пстолопчно встанов-лювався стоматолопчний дiагноз пародонтит рiзно-го ступеню тяжкостi. Всi бiоптати були подтеы на двi групи з Ытактним пародонтом N = 9 та парадонт з ознаками запалення рiзного ступеню тяжкост N = 47.
ДНК видтялась з тканин пародонту з викорис-танням лiзуючого буферу (30 mM Tris CI; 10 mM EDTA; 1 % SDS; протешаза-К). Очищення ДНК проводили стандартним фенольно-хлороформним методом з подальшим осадженням у абсолютному етанолг Отриманий ДНК-продукт перетирали з KBr та укладали в таблетки з наступною 1Ч (шфрачерво-ною) спектрофотометрiею за Фур'е на спектрометрi Spectrum One (PerkinEImer).
Аналiз спекав проводили у Origin Version 8. Для статистично! обробки отриманих результатв вико-ристовували програму Statistika 8. 0 з урахуванням критерт Стюдента та перевiркою на нормальнiсть.
Таблиця
Вщсоток штенсивност за шкалою пропускання i4 випромiнювання СН3 та CH2 груп ДНК
2953 (vasOI-13) 2870 (vsOM3) 2922 (vasCH2) 2853 (vsOM2) 1465 (SsCH2) 1450 (5asOM3) 1375 (SsCH3) 724 (рCH2)
1нтактний пародонт N = 9
Валентш коливання 48,05 ± 4,3 0,37 ± 0,01 3,17 ± 0,16 18,97 ± 3,77
Деформацмш коливання 0,24 ± 0,03 8,88 ± 1,36 7,18 ± 0,74
Маятникове коливання 3,08 ± 1,07
Пародонт з ознаками запалення (р1зн1 морфолопчш форми та ступень тяжкост1) N = 47
Валентш коливання 42,71 ± 7,54* 0,36 ± 0,05 3,05 ± 0,66 16,67 ± 6,04
Деформацмш коливання 0,32 ± 0,06 *** 11,14 ± 2,24 *** 10,39 ± 2,44 ***
Маятникове коливання 5,42 ± 3,30
Примггка: критерiй Стьюдента для незалежних BM6ipoK *P = 0. 05, **P = 0. 01, ***P = 0. 001.
Результати дослщжень та Ух обговорення. 1Ч-
спектри ДНК смуг поглинання умовно можна под1ли на три области перша - 4000-2000 см-1 - коливання азотистих основ, друга - 1700-1500 см-1 - коливання дезоксирибози ДНК, третя - 1300- 1000см-1 - ко-ливанння дезоксирибози та фосфатних груп у скелет! молекули ДНК. Смуги спектру в залежност1 вщ штенсивност поглинання шфрачервоного випром1-нювання можна подтити на: сильн1 - <20 %; середн1 - 20 % -5 % та слабк - 5 % >. У зв'язку з1 складню-тю будови молекули ДНК виникае накладання п1юв аден1ну, тим1ну, гуан1ну, цитозину, дезоксирибози та фосфорного залишку на групи СН3, СН2.
Найб1льш важливим е диференц1ац1я СН3 груп, патолог1чно приеднаних до азотистих основ, вщ СН2 груп дезоксирибози. Валентн1 коливання зв'язку С- Н алктьних фрагмент1в груп СН3, СН2 виявляються в област 3000-2840 см-1. В д1лянц1 спектру3000-2840 см-1 виникае часткове накладання пшв аден1ну, тим-!ну, гуан1ну, цитозину. Для диференцювання груп СН3, СН2 слщ пам'ятати, що валентн1 коливання зв'язюв Свр3 - Н, як правило, спостер1гаються нижче 3000 см-1, тод1 як валентн1 коливання зв'язюв Свр2 -Н i Сер -Н лежать вище 3000 см-1
Валентн коливання метильних груп (СН3) спо-стер1гаються у вигляд1 двох смуг поглинання при 2962 i 2872 см-1.
Перша - результат антисиметричного валентного коливання, в якому двое зв'язюв С-Н метильно! групи розтягуються, в той час як третм звязок стис-каеться (vas CH3).
Друга смуга зумовлена симетричними валент-ними коливаннями (vs СН3), коли вс1 три зв'язки С- Н розтягуються або стискаються в фаз1. Наявн1сть де-к1лькох метильних груп призводить до збтьшення штенсивност в1дпов1дних смуг.
Валентн1 коливання метиленових груп (СН2) також спостер1гаються у вигляд1 двох смуг поглинання (2962 i 2853 см-1), обумовлених антисиметрични-ми (vas CH2) i симетричними (vs CH2) валентними коливаннями.
У метильнм груп1 можуть проявлятися два де-формац1йн1 коливання : симетричне деформацмне коливання (Ss СН3), що виявляеться близько 1375 см-1, i антисиметричне деформац1йне коливання (Sas СН3) - в област1 1450 см-1.
Поглинання при 1375 см-1 е важливим критер1ем (Ss СН3) групи. Смуга поглинання незначна у спектр! ДНК, та притаманна компартизованм 1нтактн1й ДНК. Метильна группа мае чотири типи деформацмних коливань (ножичы, в1ялопод1бн1, маятников!, кру-тильн1). При цьому найбтыш 1нформативним е поглинання в област1 1465 см-1, обумовлене ножичним деформацмним коливанням (Ss CH2). Тому пор1в-няння СН3 та CH2 груп ДНК у штактному пародонт1 та
Рис.1нфрачервонойспенор ДНК ¡нтактногопаро донту.
пародонт з запаленням ми аналiзуемо у вищезазна-чених смугах поглинання.
Значн змiни смуг поглинання 1Ч спостерталися у - 5sСН3 групi азотистих основ. В штактному пародон-т у -СН3 1Ч смуги були без змш (рис.). Центр смуги коливання - SsO^ групи знаходився на 1375 ± 1 см-1. Вщсоток iнтенсивностi за шкалою пропускання 1Ч випромiнювання склав 7,18 ± 0,74 %. Вiдсоток 1Ч поглинання смуги 1375 ± 1 см-1 з запаленням пародон-ту дорiвнював 10,39 ± 2,44 % (***P = 0. 001).
Змши смуг поглинання 1Ч випромiнювання спо-стерiгалися у SsCH2 групi. У штактному пародонт SsCH2 смуга наступна - центр смуги коливання -1464 см-1, вщсоток штенсивност за шкалою пропускання 1Ч випромшювання - 0,24 ± 0,03 %. Вщсоток 1Ч поглинання смуги - 1464 см-1 у друпй груп склав 0,32 ± 0,06 % (***P = 0. 001). Вщсотки iнтенсивностi
за шкалою пропускання валентних, деформацiйних та маятникових коливань СН3 та СН2 груп ДНК на-веденi у табл.
Висновки. На пiдставi проведених дослiджень з упевненютю можна стверджувати, що запальнi змши у клiтинах призводять до пщвищення вмiсту метильних груп у ДНК.
Отриман данi дозволяють зробити припушення, що однieю з ланок патогенезу пародонтиту е пато-логiчне ендо- та екзогенне метилування ДНК кл^ тин пародонта при рiзних морфолопчних формах запалення.
Перспективи подальших дослiджень. В по-
дальшому плануеться дослiдити морфолопчы змiни в ядерному апаратi тканин пародонту методом лю-мiнесцентноI мiкроскопiI.
Л1тература
1. Грудянов А. И. Соотношение между перекисным окислением липидов слюны и местное лечение пародонтита гелем ди-Клорана / А. И. Грудянов, В. В. Овчинникова, Л. Е. Серебрякова // Стоматология. - 2002. - № 4. - С. 31 -34.
2. Ипполитов Ю. А. Комплексное лечение хронического генерализованного пародонтита с применением аппликационной В-терапии : дис. на соискание ученой степени канд. мед. наук : спец. 14. 01. 14 «Стоматология» / Ипполитов Юрий Анатолиевич. - Воронеж, 1996. - 276 с.
3. Карпенко И. Н. Современные представления об этиологии и патогенезе быстропрогрессирующего пародонтита / И. Н. Карпенко, Н. В. Булкина, Е. В. Понукалина // Архив патологии. - 2009. - № 1. - С. 57-59.
4. Окислительный стресс и комплексная антиоксидантная энергокоррекция в лечении пародонтита / И. А. Омаров, С. Б. Болевич, Т. Н. Саватеева-Любимова [и др.] // Стоматология. - 2011. - № 1. - С. 10-17.
5. Alteration of PTGS2 Promoter Methylation in ChronicPeriodontitis / S. Zhang, S. P. Barros, M. D. Niculescu [et al.] // J. Dent. Res. - 2010. - Vol. 89(2). - P. 133-137.
6. Epigenetic change in E-Cardherin and COX-2 to predict chronic periodontitis / Wings T. Y Loo, Lijian Jin, Mary N. B. Cheung, [et al.] // Journal of Translational Medicine. - 2010. - № 8. - P. 110-116.
7. Expression, polymorphism and methylation pattern of interleukin-6 in periodontal tissues Florenc / S. Abdanur, M. B. Vianaa, A. C. Dupim [et al.] // Immunobiology. - 2013. - Vol. 7. - P. 2-5.
8. Fuchs J. Genotoxic potential of porphyrin type photosensitizers with particular emphasis on 5-aminolevulinic acid: implications for clinical photodynamic therapy / J. Fuchs, S. Weber, R. Kaufmann. // Free Radical Biol. Med. - 2000. - № 28. -P. 37-48.
9. Interferongamma promoter hypomethylation and increased expression in chronic periodontitis / S. Zhang, A. Crivello, S. Offenbacher [et al.] // J. Clin. Periodontol. current. - 2010. - № 37. - P. 953-961.
10. Kelma C. Methylation Pattern of IFNG in Periapical Granulomas and Radicular Cysts Basic Research / C. Kelma, C. G. Carolina, J. F. Correia-Silva // Biology. - 2013. - Vol. 39. - № 4. - P. 493-796.
11. Methylation pattern of IFN and IL-10 genes in periodontal tissues / M. B. Viana, F. P. Cardoso, M. G. Diniz [et al] // Immunobiology. - 2011. - № 216. - P. 936- 941.
12. Propylene oxide and epichlorohydrin induce DNA strand breaks in huimn diploid fibioblasti / A. Kolman, M. Duiinsha, В. Ceder-vall [et al.] // Mol. Mutagen. - 1997. - Vol. 30. - P. 40-46.
13. Propylene oxide and epichlorohydrin induce DNA strand breaks in huimn diploid fibioblast / A. Kolman, M. Duiinsha, В. Ceder-vall [et al.] // Mol. Mutagen. - 1997. - Vol. 30. - P. 40-46.
УДК 612. 014. 46:616. 314. 28-073
ЗМШИ ДНК ТКАНИН ПАРОДОНТУ ПРИ ЗАПАЛЕНШ
Кузенко 6. В.
Резюме. Об'ектом даного дослщження явилось метилування ДНК при запалены пародонту не залежно вщ морфолопчно! форми та ступеню тяжкостг
Аналiз шфрачервоних спекав ДНК проводили у Origin Version 8. Для статистично! обробки отриманих результатв використовували програму Statistika 8. 0 з урахуванням критерю Стюдента та перевiркою на нормальнють.
Значн змши смуг поглинання шфрачервоного випромшювання спостерталися у - SsC^ груп азотистих основ. У хворих з штактним пародонтом у -СН3 шфрачервонм смузi змш не спостерталось. Центр смуги коливання - SsC^ групи знаходився на 1375 ± 1 см-1. Вщсоток штенсивност за шкалою пропускання шфрачер-воного випромшювання склав 7,18 ± 0,74 %. Вщсоток 1Ч поглинання смуги 1375 ± 1 см-1у хворих з запаленням пародонту дорiвнював 10,39 ± 2,44 % (***P = 0. 001).
Висновки. На пiдставi проведених дослщжень з упевнютю можна стверджувати, що запальн змiни у кгм-тинах призводять до пщвищення вмiсту метильних груп у ДНК.
Ключовi слова: алкiлування, iнфрачервона спектрофотометрiя, метилування ДНК, перюдонт, запалення.
УДК 612. 014. 46:616. 314. 28-073
ИЗМЕНЕНИЯ ДНК ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА ПРИ ВОСПАЛЕНИИ
Кузенко Е. В.
Резюме. Объектом данного исследования является метилирование ДНК при воспалении пародонта независимо от морфологической формы и степени тяжести.
Анализ инфракрасных спектров ДНК проводили в Опдт Version8. Для статистической обработки полученных результатов использовали программу Statistika 8. 0 с учетом критерия Стюдента и проверкой на нормальность.
Значительные изменения полос поглощения ИК наблюдались в - 5sСН3 группе азотистых оснований. При интактном пародонте полосы СН3 груп были без особеностей. Центр полосы колебания - 5sСН3 группы находился на 1375 ± 1 см-1. Процент интенсивности по шкале пропускания ИК составил 7,18 ± 0,74 %. Процент ИК поглощения полосы 1375 ± 1 см-1 больных с воспалением пародонта составил 10,39 ± 2,44 % (*** Р = 0. 001).
Выводы. На основании проведенных исследований можно утверждать, что воспалительные изменения в клетках приводят к повышению содержания метительных групп в ДНК.
Ключевые слова: алкилирование, инфракрасная спектрофотомерия, метилирование ДНК, периодонт, воспаление.
UDC 612. 014. 46:616. 314. 28-073
DNA Changes of Periodontal Tissues during Inflammation
Kuzenko Ye. V.
Abstract. The object of this study was to analyze of DNA alkylation by infrared spectroscopy.
The infrared spectroscopy is widely used for gathering structural information on biological systems, but not used in periodontitis inflammation researchers. The study of DNA by infrared spectroscopy requires peeled DNA samples. The infrared spectrs of DNA show many characteristic: denaturation, alkylation, dehydration and conformational transition.
Further studies of DNA by infrared spectroscopy are needed to determine the functional relevance of these alterations and the accomplishment of epigenetic investigations could have a future impact on diagnos-tic and/or therapeutic tools in treating periodontitis
The study population included 56 patients with marginal periodontitis. Only patients with available tissue represent a subset of the overall study cohorts. Recorded with a DNA IR spectrometer (SPECTRUM ONE (PerkinElmer)) with using KBr beam splitter. Inter ferograms were accumulated over the spectral range 450-400° Cm The infrared spectr a of DNA analyzed in OriginPro 8
Results. IR spectra of the DNA bands can be roughly divides into three areas : first - 4000-200° Cm-1 - variations of bases, the second - 1700-150° Cm-1 - DNA deoxyribose vibrations, third - 1300- 1000cm-1 - deoxyribose and phosphate groups in the skeleton of the DNA molecule. The bands of the spectrum depending on the absorption of infrared radiation can be divided into: strong - < 20 % average - 20 % -5 % and weak - 5 % >. Due to the complexity of the structure of DNA arises imposition peaks of adenine, thymine, guanine, cytosine, deoxyribose and phosphorus balance in the group CH3, CH2.
Significant changes were observed infrared spectroscopy absorption bands at - SsSN3 group. In patients with intact periodontium features in CH3 - IR bands were observed. Center band oscillations - SsSN3 group was at 1375 ± 1 cm -1. Percentage intensity on a scale infrared spectroscopy transmittance was 7,18 ± 0,74 %. Percentage of infrared absorption bands 1375 ± 1 cm- first patients with periodontal inflammation equal to 10,39 ± 2,44 % (P = 0. 001). Changes in IR absorption bands observed in SsCH2 group. In intact periodontal SsCH2 next strip center strip vibrations 1464 cm-1, the percentage of intensity on a scale transmission of infrared radiation - 0,24 ± 0,03 %. Percentage of infrared spectroscopy absorption band 1464 cm-1 in the second group was 0,32 ± 0,06 % (P = 0. 001).
Conclusion. On the basis of studies pevninistyu can be argued that inflammatory changes in the cells leads to an increase in the content of a methyl group to DNA. These data suggest prypushennya that one of the pathogenesis of periodontitis is abnormal endogenous and exogenous DNA methylation periodontal cells with different morphologic forms of inflammation.
Key words: alkylation by infrared spectroscopy, DNA methylation, periodontitis inflammation.
Рецензент - проф. Скрипншов П. М.
Стаття надшшла 10. 01. 2014 р.
