CC BY
17
проведено путём трансфекции ВВ-МСК синтетическими олигонуклеотидами. Эффект от применения ВВ-МСК оценивали с использованием in vitro модели дедифференци-ровки миофибробластов человека (ИЦХ, вестерн-блот-тинг, ОТ-ПЦР, модель контракции коллагенового диска) и in vivo модели индуцированного блеомицином фиброза лёгких у мышей C57BI/6, с интратрахеальным введением ВВ-МСК через 14 дней после введения блеомицина.
Мы показали, что у животных в группе с введением ВВ-МСК площадь депонированного коллагена и выраженность фиброза легких по шкале Эшкрофта значительно уменьшились, а площадь функциональной легочной ткани увеличилась на 40-45% по сравнению с контрольными группами. Мы предположили, что такое влияние ВВ-МСК на прогрессирование фиброза основано на их способности регулировать трансдифференцировку стромальных клеток в активированные фибробласты и миофибробла-сты — основные драйверы фиброза. Мы показали, что in vitro ВВ-МСК стимулировали дедифференцировку ми-офибробластов на морфологическом и функциональном уровнях за счет переноса специфических микроРНК. Мы продемонстрировали, что не одна микроРНК, а комплекс, состоящий из микроРНК-129 и -29c, оказал решающее влияние на наблюдаемые эффекты in vitro и in vóc. Данные микроРНК подавляют синтетическую активность клеток, уменьшая синтез коллагена I типа, а также способствуют дедифференцировке клеток, снижая количество компонентов фокальных контактов — винкулина, альфа-актинина 1 и 4 типа. Подавление микроРНК-129 и -29c в ВВ-МСК значительно снизило их антифибротический эффект in vivo, что привело к увеличению количества активированных фибробластов, миофибробластов и фиброти-ческих очагов в легких.
Таким образом мы показали, что комплекс специфических микроРНК, состоящий из микроРНК-29с и -129 и переносимый в составе ВВ-МСК, способен стимулировать дедифференцировку миофибробластов in vitro и in vivo, тем самым способствуя подавлению прогрессирования фиброза. Работа поддержана РФФИ (№ 20-04-60487 и № 20-315-90120).
РЕГУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ ЛЕНТИВИРУСНЫМИ ВЕКТОРАМИ, КОДИРУЮЩИМИ КОРОТКИЕ ШПИЛЕЧНЫЕ РНК
Л.С. Басович1, А.Б. Малашичева2
1 Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Санкт-Петербург, Россия
2 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: L.Basovich@Yandex.com
Ключевые слова: РНК-интерференция, короткие шпилечные РНК, лентивирусный вектор, трансдукция, трансфекция, сайленсинг генов.
РНК-интерференция представляет собой механизм посттранскрипционного геноспецифического сайлен-синга, обусловленного деградацией мРНК в эукарио-тических клетках посредством ее узнавания комплементарной малой интерферирующей РНК (миРНК), находящейся в комплексе RISC с белком AGO-2, обладающим эндонуклеазной активностью.
Применение метода трансфекции миРНК неэффективно в связи с непродолжительным нокдауном гена. Другая
форма РНК-интерференции включает использование коротких шпилечных РНК (кшРНК), доставляемых трансдук-цией лентивирусными векторами, что позволяет получить клеточную линию со стабильным нокдауном гена.
Целью исследования являлось выявление наиболее эффективного сочетания введения шпилечных конструкций для подавления оверэкспрессии гена.
Для реализации РНК-интерференции были сконструированы лентивирусные частицы, кодирующие ген комплементарной кшРНК. Регулирование экспрессии рассматривалось в двух сочетаниях: трансдукцией кшРНК через 24 часа после активации гена интереса и реализацией РНК-интерференции за 24 часа до оверэкспрессии. В качестве генов интереса выступал ген GFP, ген ZBTB-16 и гены сигнального пути Notch (рецепторы Notchl, 3, 4).
Результаты эффективности применения метода РНК-интерференции были оценены методами ПЦР в реальном времени через 48 часов, проточной цитометрией через 72 часа и иммунофлуоресцентной окраской клеток через 96 часов после трансдукции.
Анализ экспрессии гена GFP показал эффективное сочетание трансдукции вирусом, кодирующим кшРНК, за 24 часа до оверактивации.
Анализ экспрессии гена HEY1 методом количественной ПЦР указал на наибольшую эффективность сай-ленсинга при запуске механизма РНК-интерференции за 24 часа до оверэкспрессии генов рецепторов сигнального пути Notch.
Подавление экспрессии транскрипционного фактора ZBTB-16, напротив, эффективнее при трансдукции ленти-вирусными частицами, кодирующими соответствующую кшРНК, через 24 часа после активации целевого гена.
Таким образом, последовательность введения генетических конструкций при помощи лентивирусной трансдукции должна быть подобрана индивидуально для каждой пары ген-кшРНК. Исследование проведено при поддержке гранта РНФ 18-14-00152.
ЖИВАЯ ТРЕХМЕРНАЯ МОДЕЛЬ АДРЕНОКОРТИКАЛЬНОГО РАКА ДЛЯ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ И ТЕСТИРОВАНИЯ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ И МЕТОДОВ ТЕРАПИИ
А.Н. Бастрич1, Д.А. Петрова1, Б.Я. Алексеев2, А.А. Рослякова1, Д.Г. Бельцевич1, П.А. Никифорович1, Н.С. Кузнецов1, Е.В. Бондаренко1, С.А. Сергиенко3, Г.Д. Ефремов3, Л.С. Урусова1
1 НЦМУ Национальный центр персонализированной медицины эндокринных заболеваний, ФГБУ НМИЦ эндокринологии Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, Москва, Россия
3 НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина — филиал ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: Bastrich.Asya@endocrincentr.ru
Ключевые слова: раковые органоиды, трехмерная модель опухолевой ткани, адренокортикальный рак, злокачественное новообразование коры надпочечника, органоподобные культуры.
Адренокортикальный рак (АКР) представляет собой редкое злокачественное новообразование коры
надпочечников, отличающееся, как правило, крайне агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом. Общая, неранжированная по стадиям заболевания, пятилетняя выживаемость колеблется от 16 до 38% [1].
Персонифицированная терапия позволяет существенно повысить эффективность лечения онкоболь-ных [2]. Трехмерные раковые органоподобные культуры (органоиды) можно получать из биопсий или резекций опухоли, размножать ин витро и хранить в замороженном виде с возможностью разморозить живую культуру в любое время [3]. Органоиды сохраняют генетическую и клеточную гетерогенность исходной опухоли и позволяют определять индивидуальный ответ опухоли на лекарственную терапию/метод с наивысшей для ин витро моделей предсказательной силой [4]. На сегодняшний момент, вероятность получения персонифицированной самоподдерживающейся линии органоидов может достигать 95% и зависит от вида рака. Разработаны методики получения органоидов рака молочной железы, рака яичников, рака легкого, рака кишечника, рака предстательной железы и др. [5], но нет ни одной публикации об успешном культивировании органоидов АКР.
Критически важными компонентами системы культивирования раковых органоидов являются: среда культивирования, внеклеточный матрикс для культивирования и метод предподготовки образца опухоли перед началом культивирования. Образцы АКР были получены в результате хирургического удаления опухолей, проведенных в НМИЦ эндокринологии. Применение стандартной системы культивирования, успешно опробованной ранее для получения линий органоидов рака прямой кишки, не привело к росту органоидов АКР ин витро. В результате анализа опубликованных данных по биологии развития и составам сред для первичных культур, был определен фактор Х, который критически важен для роста тканей здорового надпочечника человека ин виво и ин витро. Добавление фактора Х в среду для культивирования органоидов привело к росту трехмерных клеточных структур АКР, имеющих характерную для органоидов морфологию, и, впервые в мире, позволило получить самоподдерживающуюся линию органоидов классического морфологического варианта АКР. Иммуногистохимический анализ подтвердил злокачественную природу органоид-ных структур. Источник финансирования — грант НЦМУ 075-15-2020-310.
Литература:
1. Мельниченко Г.А., Алексеев Б.Я., Бельцевич Д.Г. и др. Проблемы эндокринологии. 2014. 60 (2): 51-67.
2. Jackson S., Chester J. Int. J. Cancer. 2015. V. 127. P. 262.
3. Drost J., Clevers H. Nat. Rev. Cancer. 2018. V. 18. P. 407.
4. Kretzschmar K.J. Mol. Med. 2021. V. 99. P. 501.
5. Driehuis E., Kretzschmar K., Clevers H. Nature Protocols.
2020. V. 15. P. 3380.
РОЛЬ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В ДИНАМИКЕ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ
Е.И. Бахмет1, М.Н. Гордеев1, А.С. Зиновьева1, 2, Е.Е. Петренко1, 2, А.Н. Томилин1
1 ФГБНУ Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: e.bakhmet@incras.ru
Ключевые слова: Nanog, Oct4, Sox2, ЭСК
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) отличаются способностью к самообновлению и к дифференциров-ке во все типы соматических, а также в половые клетки, то есть являются плюрипотентными. В последнее время, принято выделять несколько типов плюрипотентных стволовых клеток, в зависимости от стадии эмбриогенеза, работающих сигнальных путей и факторов роста, необходимых для поддержания таких клеток в культуре. Наличие такой динамики плюрипотентных состояний ставит новые задачи в изучении транскрипционных факторов, необходимых для функционирования ЭСК. Кроме того, появляются свидетельства роли некоторых факторов плюрипотентности в определении судьбы клетки — её спецификации в том или ином направлении.
В ходе наших исследований, мы показали, что полиЦ-связывающий белок РсЬр1 необходим для правильного перехода из наивного (раннего) плюрипотентного состояния в праймированное (позднее). Этот белок участвует в тонкой настройке МАРК-сигнального пути, и препятствует дифференцировке в направлении первичной энтодермы. При нокауте РсЬр1 в ЭСК, в начале указанного перехода, помимо активации генов «праймированной» плюрипотентности, происходит запуск экспрессии генов первичной энтодермы, что приводит к апоптозу и замедлению созревания ЭСК.
Также нам удалось выяснить, что экспрессия 1\1апод необходима для корректной спецификации ЭСК в направлении дефинитивной энтодермы. Уровень этого фактора падает при переходе в «праймированное» состояние. При этом, с началом энтодермальной дифференциров-ки, экспрессия 1\1апод ре-активируется, что согласуется с данными, полученными при изучении эмбрионального развития мыши. Мы показали, что элиминация этого фактора не влияет непосредственно на запуск этой спецификации, т. к. наблюдается активация типичных маркеров Бох17 и Роха2. Однако количество энтодермальных клеток в отсутствии 1\1апод снижается в пять раз.
Нами также получены новые данные о ключевых аминокислотах 0й4, участвующих в опосредовании контакта с его партнёром — Бох2. Замены этих аминокислот на те, что представлены у его паралогов, привели к тому, что этот фактор стал функционировать как индуктор ней-роэктодермальной спецификации. В настоящий момент мы работаем над выявлением роли 0й4 и Бох2 в ме-зодермальной и эктодермальной дифференцировке, соответственно.
НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА 2D МОДЕЛИ
АНГИОГЕНЕЗА IN VITRO
И.Б. Белоглазова1, Е.С. Зубкова1, К.В. Дергилев1,
Ю.Д. Василец1, Е.В. Парфенова1, 2
1 ФГБУ НМИЦК им. ак. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия.
2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Факультет фундаментальной медицины, Москва, Россия
e-mail: irina.beloglazova@cardio.ru
Ключевые слова: внеклеточный матрикс, ангиогенез,
Notch, EndoMT
Модель ангиогенеза на Матригеле является самой известной и простой 2D моделью in vitro. В ней эндоте-лиальные клетки (ЭК) формируют капилляро-подобные структуры (КПС) только за счет взаимодействия с ростовыми факторами и белками внеклеточного матрикса (ВМ), входящими в состав Матригеля.
