CC BY
6
надпочечников, отличающееся, как правило, крайне агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом. Общая, неранжированная по стадиям заболевания, пятилетняя выживаемость колеблется от 16 до 38% [1].
Персонифицированная терапия позволяет существенно повысить эффективность лечения онкоболь-ных [2]. Трехмерные раковые органоподобные культуры (органоиды) можно получать из биопсий или резекций опухоли, размножать ин витро и хранить в замороженном виде с возможностью разморозить живую культуру в любое время [3]. Органоиды сохраняют генетическую и клеточную гетерогенность исходной опухоли и позволяют определять индивидуальный ответ опухоли на лекарственную терапию/метод с наивысшей для ин витро моделей предсказательной силой [4]. На сегодняшний момент, вероятность получения персонифицированной самоподдерживающейся линии органоидов может достигать 95% и зависит от вида рака. Разработаны методики получения органоидов рака молочной железы, рака яичников, рака легкого, рака кишечника, рака предстательной железы и др. [5], но нет ни одной публикации об успешном культивировании органоидов АКР.
Критически важными компонентами системы культивирования раковых органоидов являются: среда культивирования, внеклеточный матрикс для культивирования и метод предподготовки образца опухоли перед началом культивирования. Образцы АКР были получены в результате хирургического удаления опухолей, проведенных в НМИЦ эндокринологии. Применение стандартной системы культивирования, успешно опробованной ранее для получения линий органоидов рака прямой кишки, не привело к росту органоидов АКР ин витро. В результате анализа опубликованных данных по биологии развития и составам сред для первичных культур, был определен фактор Х, который критически важен для роста тканей здорового надпочечника человека ин виво и ин витро. Добавление фактора Х в среду для культивирования органоидов привело к росту трехмерных клеточных структур АКР, имеющих характерную для органоидов морфологию, и, впервые в мире, позволило получить самоподдерживающуюся линию органоидов классического морфологического варианта АКР. Иммуногистохимический анализ подтвердил злокачественную природу органоид-ных структур. Источник финансирования — грант НЦМУ 075-15-2020-310.
Литература:
1. Мельниченко Г.А., Алексеев Б.Я., Бельцевич Д.Г. и др. Проблемы эндокринологии. 2014. 60 (2): 51-67.
2. Jackson S., Chester J. Int. J. Cancer. 2015. V. 127. P. 262.
3. Drost J., Clevers H. Nat. Rev. Cancer. 2018. V. 18. P. 407.
4. Kretzschmar K.J. Mol. Med. 2021. V. 99. P. 501.
5. Driehuis E., Kretzschmar K., Clevers H. Nature Protocols.
2020. V. 15. P. 3380.
РОЛЬ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ В ДИНАМИКЕ ПЛЮРИПОТЕНТНОСТИ
Е.И. Бахмет1, М.Н. Гордеев1, А.С. Зиновьева1, 2, Е.Е. Петренко1, 2, А.Н. Томилин1
1 ФГБНУ Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБОУ ВО Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: e.bakhmet@incras.ru
Ключевые слова: Nanog, Oct4, Sox2, ЭСК
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) отличаются способностью к самообновлению и к дифференциров-ке во все типы соматических, а также в половые клетки, то есть являются плюрипотентными. В последнее время, принято выделять несколько типов плюрипотентных стволовых клеток, в зависимости от стадии эмбриогенеза, работающих сигнальных путей и факторов роста, необходимых для поддержания таких клеток в культуре. Наличие такой динамики плюрипотентных состояний ставит новые задачи в изучении транскрипционных факторов, необходимых для функционирования ЭСК. Кроме того, появляются свидетельства роли некоторых факторов плюрипотентности в определении судьбы клетки — её спецификации в том или ином направлении.
В ходе наших исследований, мы показали, что полиЦ-связывающий белок РсЬр1 необходим для правильного перехода из наивного (раннего) плюрипотентного состояния в праймированное (позднее). Этот белок участвует в тонкой настройке МАРК-сигнального пути, и препятствует дифференцировке в направлении первичной энтодермы. При нокауте РсЬр1 в ЭСК, в начале указанного перехода, помимо активации генов «праймированной» плюрипотентности, происходит запуск экспрессии генов первичной энтодермы, что приводит к апоптозу и замедлению созревания ЭСК.
Также нам удалось выяснить, что экспрессия 1\1апод необходима для корректной спецификации ЭСК в направлении дефинитивной энтодермы. Уровень этого фактора падает при переходе в «праймированное» состояние. При этом, с началом энтодермальной дифференциров-ки, экспрессия 1\1апод ре-активируется, что согласуется с данными, полученными при изучении эмбрионального развития мыши. Мы показали, что элиминация этого фактора не влияет непосредственно на запуск этой спецификации, т. к. наблюдается активация типичных маркеров Бох17 и Роха2. Однако количество энтодермальных клеток в отсутствии 1\1апод снижается в пять раз.
Нами также получены новые данные о ключевых аминокислотах 0й4, участвующих в опосредовании контакта с его партнёром — Бох2. Замены этих аминокислот на те, что представлены у его паралогов, привели к тому, что этот фактор стал функционировать как индуктор ней-роэктодермальной спецификации. В настоящий момент мы работаем над выявлением роли 0й4 и Бох2 в ме-зодермальной и эктодермальной дифференцировке, соответственно.
НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА 2D МОДЕЛИ
АНГИОГЕНЕЗА IN VITRO
И.Б. Белоглазова1, Е.С. Зубкова1, К.В. Дергилев1,
Ю.Д. Василец1, Е.В. Парфенова1, 2
1 ФГБУ НМИЦК им. ак. Е.И. Чазова Минздрава России, Москва, Россия.
2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Факультет фундаментальной медицины, Москва, Россия
e-mail: irina.beloglazova@cardio.ru
Ключевые слова: внеклеточный матрикс, ангиогенез,
Notch, EndoMT
Модель ангиогенеза на Матригеле является самой известной и простой 2D моделью in vitro. В ней эндоте-лиальные клетки (ЭК) формируют капилляро-подобные структуры (КПС) только за счет взаимодействия с ростовыми факторами и белками внеклеточного матрикса (ВМ), входящими в состав Матригеля.
Другая 2D модель ангиогенеза — сокультивирование ЭК с клетками стабилизаторами — мезенхимными стро-мальными (МСК) на пластике, предварительно не покрытом белками ВМ. В данной модели источниками ВМ и ростовых факторов являются МСК. Помимо этого, и сами межклеточные взаимодействия ЭК и МСК могут вносить вклад в формирование КПС ЭК.
Целью работы было сравнительное изучение профилей экспрессии ряда генов в ЭК, вовлеченных в процесс ангиогенеза в разных моделях: ЭК, формирующие КПС на Матригеле, ЭК в ко-культуре с МСК, ЭК в конфлюэнт-ном монослое и делящиеся/мигрирующие ЭК.
Нормировку полученных данных проводили к ЭК в конфлюэнтном монослое.
Мы обнаружили, что:
1) Анализ экспрессионного профиля ЭК с помощью программы Heatmapper показал, что в ЭК на Матригеле по отношению к ЭК в ко-культуре и делящимся/мигрирующим ЭК активировались разные кластеры генов. Данные различия затрагивают гены межклеточных контактов, в том числе Notch и эфриновую сигнализацию.
2) В ЭК на модели Матригеля, в кокультуре и делящимися/мигрирующими ЭК апрегулировалось 4 общих гена: PLAU, PLAUR, JAG1 and NOTCH2.
3) Гены, ассоциированные с EndMT апрегулирова-лись как на Матригеле, так и в ко-культуре, причем в ко-культуре апрегуляция являлась более выраженной.
4) В ко-культуре происходила активная экспрессия белков ВМ, причем это происходило и в ЭК и в МСК. Более того, экспрессия коллагена1 в ЭК при этом возрастала более чем в 77 тысяч раз.
5) На Матригеле повышалась экспрессия эфри-новых лигандов EFNA3, EFNA5, EFNB2, EFNB3 и рецепторов EPHB4, EPHB6. В делящихся/мигрирующих ЭК происходила даунрегуляция генов почти всех ли-гандов и рецепторов, а увеличение отмечалось только для рецептора EPHA2. В ЭК в ко-культуре происходила даунрегуляция генов лигандов EFNA1, EFNB1, EFNB2, EFNB3 и рецептора EPHB4, а также апрегуляция генов рецепторов EPHA2, EPHB1.
6) Даунрегуляция генов CCN1 и CCN2 в ЭК на Матригеле говорит об активации сигнального пути Hippo, в то время как в делящихся/мигрирующих ЭК данный путь не активен.
7) В ЭК на Маригеле происходила апрегуляция всех лигандов и рецепторов Notch, и активация сигнализации Notch. В кокультуре происходила апрегуляция JAG1, JAG2, NOTCH2 и даунрегуляция DLL1 и DLL2 и подавление сигнализации.
Мы можем заключить, что 2Д модели ангиогенеза in vitro на Матригеле и в ко-культуре отражают различные стадии ангиогенеза.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ № 21-15-00327.
СИНТЕЗ И ОФОРМЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНОВОГО ВОЛОКНА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ КРЫС
М.Б. Белякова, Н.В. Костюк, М.В. Черноруцкий, Д.В. Лещенко, М.В. Миняев
ФГБОУ ВО Тверской государственный медицинский университет Минздрава РФ, Тверь, Россия
e-mail: mayabe@yandex.ru
Ключевые слова: жировая ткань, мезенхимные стромаль-ные клетки, коллагеновые волокна в культуре.
Сборка коллагена определяется контактами фибрилл с поверхностью фибробласта, и пространственное расположение клетки является обуславливающим в ориентации пучков, что, несомненно, сказывается на особенностях коллагенового матрикса, получаемого при культивировании фибробластов различного происхождения. В данной работе изучалась динамика формирования коллагена, создаваемого в донной культуре клетками жировой ткани, при стимуляции коллагеногенеза бычьей сывороткой и аскорбатом. Целью работы было выявить возможности фибриллогенеза клетками жировой ткани при донном культивировании различной длительности в условиях, предпочтительных для фибробластов.
В эксперименте использовались клетки жировых экс-плантов крыс, культивированные в среде ОМЕМ с высокой глюкозой, аскорбатом и 10%-й бычьей сывороткой без пересева в течении 4-16 недель. Контрольные чашки в первую неделю культивирования стимулировались фетальной сывороткой и/или содержались без аскор-бата. Фотодокументирование формирования коллагена проводилось при фазовой микроскопии живых культур и с окраской по Ван-Гизону или Маллори.
Фибробластоподобная морфология культур мезенхим-ных стромальных клеток достаточно легко возникает при пересевах, и при уплотнении застила такие клетки не удается снять с помощью трипсина, однако это становится возможным благодаря применению коллагеназы. Если клетки не пассировались больше двух недель, многие из них при такой дезагрегации сохраняли вытянутую форму и сходили с подложки с элементами созданного ими матрикса. При старении культуры без пересева до 101 6 недель наблюдался апоптоз клеток, с сохранением визуализировавшихся при фазово-контрастном микро-скопировании и гистологически окрашивавшихся колла-геновых волокон. Необходимо отметить, что аскорбат без какой-либо иной стимуляции столь значительно усиливал коллагеногенез и фибриллогенез, что за 60 дней появлялись оформленные волокна длиной 300-500 мкм.
При использовании бычьей сыворотки и стеклянного культурального сосуда возможно целевое получение кол-лагенового матрикса слоистой архитектуры, образованного культурой мезенхимных клеток.
ЭКСПРЕССИЯ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ АЛЬФА КОНСТИТУТИВНО УВЕЛИЧИВАЕТСЯ В КОСТЯХ СУБЛЕТАЛЬНО ОБЛУЧЕННЫХ МЫШЕЙ
А.Е. Бигильдеев1, Д.М. Карпенко1, А.В. Садовская1, 2, А.И. Дорофеева1
1 ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, Москва, Россия
2 Биологический факультет, Кафедра иммунологии МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: bigildeev.ae@gmail.com
Ключевые слова: ФНОа, ИЛ-1 ß, облучение, фактор роста стромы, NF-kB, кости, индукция экспрессии.
Облучение мышей в сублетальной дозе радиации приводит к повышенному уровню интерлейкина-1 бета (ИЛ-1 ß) в крови, который остается повышенным не только в острую фазу после облучения, но и позднее, неопределенно долго. Мы также установили, что ИЛ-1 ß — ростовой фактор для стромальных клеток-предшественниц костного мозга. При сингенной имплантации костного мозга под капсулу почки облученных мышей в месте операции образуется очаг
