CC BY
20
24
МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ
проведено путём трансфекции ВВ-МСК синтетическими олигонуклеотидами. Эффект от применения ВВ-МСК оценивали с использованием in vitro модели дедифференци-ровки миофибробластов человека (ИЦХ, вестерн-блот-тинг, ОТ-ПЦР, модель контракции коллагенового диска) и in vivo модели индуцированного блеомицином фиброза лёгких у мышей C57BI/6, с интратрахеальным введением ВВ-МСК через 14 дней после введения блеомицина.
Мы показали, что у животных в группе с введением ВВ-МСК площадь депонированного коллагена и выраженность фиброза легких по шкале Эшкрофта значительно уменьшились, а площадь функциональной легочной ткани увеличилась на 40-45% по сравнению с контрольными группами. Мы предположили, что такое влияние ВВ-МСК на прогрессирование фиброза основано на их способности регулировать трансдифференцировку стромальных клеток в активированные фибробласты и миофибробла-сты — основные драйверы фиброза. Мы показали, что in vitro ВВ-МСК стимулировали дедифференцировку ми-офибробластов на морфологическом и функциональном уровнях за счет переноса специфических микроРНК. Мы продемонстрировали, что не одна микроРНК, а комплекс, состоящий из микроРНК-129 и -29c, оказал решающее влияние на наблюдаемые эффекты in vitro и in vóc. Данные микроРНК подавляют синтетическую активность клеток, уменьшая синтез коллагена I типа, а также способствуют дедифференцировке клеток, снижая количество компонентов фокальных контактов — винкулина, альфа-актинина 1 и 4 типа. Подавление микроРНК-129 и -29c в ВВ-МСК значительно снизило их антифибротический эффект in vivo, что привело к увеличению количества активированных фибробластов, миофибробластов и фиброти-ческих очагов в легких.
Таким образом мы показали, что комплекс специфических микроРНК, состоящий из микроРНК-29с и -129 и переносимый в составе ВВ-МСК, способен стимулировать дедифференцировку миофибробластов in vitro и in vivo, тем самым способствуя подавлению прогрессирования фиброза. Работа поддержана РФФИ (№ 20-04-60487 и № 20-315-90120).
РЕГУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ ЛЕНТИВИРУСНЫМИ ВЕКТОРАМИ, КОДИРУЮЩИМИ КОРОТКИЕ ШПИЛЕЧНЫЕ РНК
Л.С. Басович1, А.Б. Малашичева2
1 Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Санкт-Петербург, Россия
2 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: РНК-интерференция, короткие шпилечные РНК, лентивирусный вектор, трансдукция, трансфекция, сайленсинг генов.
РНК-интерференция представляет собой механизм посттранскрипционного геноспецифического сайлен-синга, обусловленного деградацией мРНК в эукарио-тических клетках посредством ее узнавания комплементарной малой интерферирующей РНК (миРНК), находящейся в комплексе RISC с белком AGO-2, обладающим эндонуклеазной активностью.
Применение метода трансфекции миРНК неэффективно в связи с непродолжительным нокдауном гена. Другая
форма РНК-интерференции включает использование коротких шпилечных РНК (кшРНК), доставляемых трансдук-цией лентивирусными векторами, что позволяет получить клеточную линию со стабильным нокдауном гена.
Целью исследования являлось выявление наиболее эффективного сочетания введения шпилечных конструкций для подавления оверэкспрессии гена.
Для реализации РНК-интерференции были сконструированы лентивирусные частицы, кодирующие ген комплементарной кшРНК. Регулирование экспрессии рассматривалось в двух сочетаниях: трансдукцией кшРНК через 24 часа после активации гена интереса и реализацией РНК-интерференции за 24 часа до оверэкспрессии. В качестве генов интереса выступал ген GFP, ген ZBTB-16 и гены сигнального пути Notch (рецепторы Notchl, 3, 4).
Результаты эффективности применения метода РНК-интерференции были оценены методами ПЦР в реальном времени через 48 часов, проточной цитометрией через 72 часа и иммунофлуоресцентной окраской клеток через 96 часов после трансдукции.
Анализ экспрессии гена GFP показал эффективное сочетание трансдукции вирусом, кодирующим кшРНК, за 24 часа до оверактивации.
Анализ экспрессии гена HEY1 методом количественной ПЦР указал на наибольшую эффективность сай-ленсинга при запуске механизма РНК-интерференции за 24 часа до оверэкспрессии генов рецепторов сигнального пути Notch.
Подавление экспрессии транскрипционного фактора ZBTB-16, напротив, эффективнее при трансдукции ленти-вирусными частицами, кодирующими соответствующую кшРНК, через 24 часа после активации целевого гена.
Таким образом, последовательность введения генетических конструкций при помощи лентивирусной трансдукции должна быть подобрана индивидуально для каждой пары ген-кшРНК. Исследование проведено при поддержке гранта РНФ 18-14-00152.
ЖИВАЯ ТРЕХМЕРНАЯ МОДЕЛЬ АДРЕНОКОРТИКАЛЬНОГО РАКА ДЛЯ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ И ТЕСТИРОВАНИЯ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ И МЕТОДОВ ТЕРАПИИ
А.Н. Бастрич1, Д.А. Петрова1, Б.Я. Алексеев2, А.А. Рослякова1, Д.Г. Бельцевич1, П.А. Никифорович1, Н.С. Кузнецов1, Е.В. Бондаренко1, С.А. Сергиенко3, Г.Д. Ефремов3, Л.С. Урусова1
1 НЦМУ Национальный центр персонализированной медицины эндокринных заболеваний, ФГБУ НМИЦ эндокринологии Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, Москва, Россия
3 НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина — филиал ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: раковые органоиды, трехмерная модель опухолевой ткани, адренокортикальный рак, злокачественное новообразование коры надпочечника, органоподобные культуры.
Адренокортикальный рак (АКР) представляет собой редкое злокачественное новообразование коры
Гены & Клетки XVII, №3, 2022
