CC BY
11
РЕКОНСТРУКЦИЯ ТРАХЕИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТКАНЕИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ НА ОСНОВЕ МИКРОПЕРФОРИРОВАННОГО ХРЯЩА ТРАХЕИ ЧЕЛОВЕКА И НАЗАЛЬНЫХ ХОНДРОЦИТОВ
Д.С. Барановский1, 2, Я. Демнер3, С. Нюрнбергер4, А.В. Люндуп2, Х. Редл4, М. Хилпберт5, М.Е. Крашенинников2, О.А. Красильникова1, И.Д. Клабуков1, 2, И. Мартин3, 5, А. Барберо5
1 НМИЦ радиологии Минздрава России, Обнинск, Россия
2 Российский Университет Дружбы Народов, Москва, Россия
3 Университет Базеля, Базель, Швейцария
4 Институт экспериментальной и клинической травматологии им. Людвига Больцмана, Вена, Австрия
5 Университетский госпиталь Базеля, Базель, Швейцария
e-mail: doc.baranovskY@gmail.com
Ключевые слова: девитализация, лазерная перфорация, назальные хондроциты, ортотопическая имплантация, тканевая инженерия, тканеинженерная трахея.
Применение тканеинженерных имплантатов трахеи представляет собой перспективную стратегию ее реконструкции и может стать последним шансом радикального лечения для пациентов с обширными поражениями трахеи. Использование кадаверной хрящевой ткани ранее позволило получить биосовместимые матриксы-но-сители с оптимальными механическими свойствами [1]. Однако, повышенная плотность такого материала препятствовала его заселению клетками и последующему постимплантационному ремоделированию.
В исследовании мы предложили использовать лазерную перфорацию хрящевой ткани человека для ее эффективной колонизации назальными хондроцитами, а также исследовали биосовместимость и эффективность полученной тканеинженерной конструкции при восстановлении обширного дефекта трахеи в эксперименте.
Образцы нативной трахеи человека подверглись де-витализации и высокоточной лазерной микроперфорации инфракрасным лазером. Девитализация позволяла получить матрикс-носитель с сохранной архитектоникой [1,2]. Лазерная перфорация полностью покрыла поверхность матрикса микропорами диаметром 100200 мкм с плотностью 4-6 микропор/мм2.
Назальные хондроциты культивировались на микро-перфорированной хрящевой ткани в течение 1 недели, эффективно колонизируя микропоры. Полученные тка-неинженерные конструкции имплантировали подкожно бестимусным гипоимунным мышам. Глубина колонизации существенно улучшились через 8 недель после эктопической имплантации конструкций. Отмечалось заполнение микропор новообразованным хрящевым ма-триксом, при этом синтез коллагенов I и II типов и аггре-кана был подтвержден ОТ-ПЦР.
Конструкции также были имплантированы ортотопи-чески в дефекты стенки трахеи кроликам на срок 8 недель. Через 4 недели после имплантации выполнялась компьютерная томография (КТ) шеи для промежуточной оценки состояния просвета трахеи и положения конструкции. Было показано, что имплантация не приводила к дислокации конструкции или стенозу трахеи. Матриксы-носители и тканеинженерные конструкции
трахеи анализировались до и после имплантации с помощью СЭМ, микротомографии, иммуногистохимических исследований и цифровой ПЦР.
Микротомография высокого разрешения, выполненная через 8 недель после операции, выявила полную интеграцию конструкции в стенку органа. Отмечалось восстановление слизистой оболочки трахеи на всей внутренней поверхности тканеинженерной конструкции, подтверждаемое иммуногистохимическим исследованием [2]. Иммунологическая оценка реакции реципиента на ксеногенный донорский материал, заселенный алло-генными клетками, не выявила признаков отторжения имплантата.
Имплантация биопротезов, основанных на микро-перфорированных хрящевых тканях, представляет собой перспективную стратегию восстановления трахеи в клинических исследованиях.
Литература:
1. Барановский Д.С., Демченко А.Г., Оганесян Р.В. и др. Вестник РАМН 2017, Т. 72. № 4. С. 254-260.
2. Baranovskii D., Demner J., Nürnberger S. et al. Cartilage 2022.
V. 13. № 1. P. 19476035221075951.
МИКРОРНК-29С И 129 В СОСТАВЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ВЕЗИКУЛ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК СПОСОБСТВУЮТ РАЗРЕШЕНИЮ ФИБРОЗА ЛЁГКИХ ЧЕРЕЗ УПРАВЛЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКОЙ МИОФИБРОБЛАСТОВ И ИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ
Н.А. Басалова1, М.А. Виговский1, 2, М.С. Арбатский2, О.А. Григорьева1,
A.Е. Толстолужинская2, У.Д. Дьячкова2,
B.С. Попов1, 2, М.Н. Карагяур1, 2, Н.И. Калинина2, Ж.А. Акопян1, 2, А.Ю. Ефименко1, 2
1 Институт регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: natalia_ba@mail.ru
Ключевые слова: фиброз, микроРНК, внеклеточные везикулы, мезенхимные стромальные клетки, миофибробласты, дифференцировка
Фиброз лёгких представляет собой прогрессирующее замещение функциональной ткани на стромальную, что может приводить к дисфункции органа. Мезенхимные стромальные клетки (МСК) обладают способностью к регуляции фиброза, однако молекулярные механизмы данного эффекта остаются малоизученными. Известно, что ряд подходов к подавлению фиброза основан на подавлении активности миофибробластов и стимулировании их дифференцировки в нормальные тканеспецифичные клетки. Одними из ключевых молекул, регулирующих эти процессы, являются микроРНК, которые транспортируются преимущественно в составе внеклеточных везикул (ВВ-МСК). Поэтому в данной работе было исследовано влияние микроРНК в составе ВВ-МСК на дифференци-ровку миофибробластов в процессе развития фиброза in vitro и in vivo.
ВВ были выделены из кондиционированной среды МСК человека и охарактеризованы стандартными методами. Ингибирование исследуемых микроРНК было
проведено путём трансфекции ВВ-МСК синтетическими олигонуклеотидами. Эффект от применения ВВ-МСК оценивали с использованием in vitro модели дедифференци-ровки миофибробластов человека (ИЦХ, вестерн-блот-тинг, ОТ-ПЦР, модель контракции коллагенового диска) и in vivo модели индуцированного блеомицином фиброза лёгких у мышей C57BI/6, с интратрахеальным введением ВВ-МСК через 14 дней после введения блеомицина.
Мы показали, что у животных в группе с введением ВВ-МСК площадь депонированного коллагена и выраженность фиброза легких по шкале Эшкрофта значительно уменьшились, а площадь функциональной легочной ткани увеличилась на 40-45% по сравнению с контрольными группами. Мы предположили, что такое влияние ВВ-МСК на прогрессирование фиброза основано на их способности регулировать трансдифференцировку стромальных клеток в активированные фибробласты и миофибробла-сты — основные драйверы фиброза. Мы показали, что in vitro ВВ-МСК стимулировали дедифференцировку ми-офибробластов на морфологическом и функциональном уровнях за счет переноса специфических микроРНК. Мы продемонстрировали, что не одна микроРНК, а комплекс, состоящий из микроРНК-129 и -29c, оказал решающее влияние на наблюдаемые эффекты in vitro и in vóc. Данные микроРНК подавляют синтетическую активность клеток, уменьшая синтез коллагена I типа, а также способствуют дедифференцировке клеток, снижая количество компонентов фокальных контактов — винкулина, альфа-актинина 1 и 4 типа. Подавление микроРНК-129 и -29c в ВВ-МСК значительно снизило их антифибротический эффект in vivo, что привело к увеличению количества активированных фибробластов, миофибробластов и фиброти-ческих очагов в легких.
Таким образом мы показали, что комплекс специфических микроРНК, состоящий из микроРНК-29с и -129 и переносимый в составе ВВ-МСК, способен стимулировать дедифференцировку миофибробластов in vitro и in vivo, тем самым способствуя подавлению прогрессирования фиброза. Работа поддержана РФФИ (№ 20-04-60487 и № 20-315-90120).
РЕГУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИИ ЛЕНТИВИРУСНЫМИ ВЕКТОРАМИ, КОДИРУЮЩИМИ КОРОТКИЕ ШПИЛЕЧНЫЕ РНК
Л.С. Басович1, А.Б. Малашичева2
1 Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Санкт-Петербург, Россия
2 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
e-mail: L.Basovich@Yandex.com
Ключевые слова: РНК-интерференция, короткие шпилечные РНК, лентивирусный вектор, трансдукция, трансфекция, сайленсинг генов.
РНК-интерференция представляет собой механизм посттранскрипционного геноспецифического сайлен-синга, обусловленного деградацией мРНК в эукарио-тических клетках посредством ее узнавания комплементарной малой интерферирующей РНК (миРНК), находящейся в комплексе RISC с белком AGO-2, обладающим эндонуклеазной активностью.
Применение метода трансфекции миРНК неэффективно в связи с непродолжительным нокдауном гена. Другая
форма РНК-интерференции включает использование коротких шпилечных РНК (кшРНК), доставляемых трансдук-цией лентивирусными векторами, что позволяет получить клеточную линию со стабильным нокдауном гена.
Целью исследования являлось выявление наиболее эффективного сочетания введения шпилечных конструкций для подавления оверэкспрессии гена.
Для реализации РНК-интерференции были сконструированы лентивирусные частицы, кодирующие ген комплементарной кшРНК. Регулирование экспрессии рассматривалось в двух сочетаниях: трансдукцией кшРНК через 24 часа после активации гена интереса и реализацией РНК-интерференции за 24 часа до оверэкспрессии. В качестве генов интереса выступал ген GFP, ген ZBTB-16 и гены сигнального пути Notch (рецепторы Notchl, 3, 4).
Результаты эффективности применения метода РНК-интерференции были оценены методами ПЦР в реальном времени через 48 часов, проточной цитометрией через 72 часа и иммунофлуоресцентной окраской клеток через 96 часов после трансдукции.
Анализ экспрессии гена GFP показал эффективное сочетание трансдукции вирусом, кодирующим кшРНК, за 24 часа до оверактивации.
Анализ экспрессии гена HEY1 методом количественной ПЦР указал на наибольшую эффективность сай-ленсинга при запуске механизма РНК-интерференции за 24 часа до оверэкспрессии генов рецепторов сигнального пути Notch.
Подавление экспрессии транскрипционного фактора ZBTB-16, напротив, эффективнее при трансдукции ленти-вирусными частицами, кодирующими соответствующую кшРНК, через 24 часа после активации целевого гена.
Таким образом, последовательность введения генетических конструкций при помощи лентивирусной трансдукции должна быть подобрана индивидуально для каждой пары ген-кшРНК. Исследование проведено при поддержке гранта РНФ 18-14-00152.
ЖИВАЯ ТРЕХМЕРНАЯ МОДЕЛЬ АДРЕНОКОРТИКАЛЬНОГО РАКА ДЛЯ ПЕРСОНИФИЦИРОВАННОЙ МЕДИЦИНЫ И ТЕСТИРОВАНИЯ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ И МЕТОДОВ ТЕРАПИИ
А.Н. Бастрич1, Д.А. Петрова1, Б.Я. Алексеев2, А.А. Рослякова1, Д.Г. Бельцевич1, П.А. Никифорович1, Н.С. Кузнецов1, Е.В. Бондаренко1, С.А. Сергиенко3, Г.Д. Ефремов3, Л.С. Урусова1
1 НЦМУ Национальный центр персонализированной медицины эндокринных заболеваний, ФГБУ НМИЦ эндокринологии Минздрава России, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, Москва, Россия
3 НИИ урологии и интервенционной радиологии им. Н.А. Лопаткина — филиал ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: Bastrich.Asya@endocrincentr.ru
Ключевые слова: раковые органоиды, трехмерная модель опухолевой ткани, адренокортикальный рак, злокачественное новообразование коры надпочечника, органоподобные культуры.
Адренокортикальный рак (АКР) представляет собой редкое злокачественное новообразование коры
