CC BY
6
белок Contactin 6 отвечает за рост аксонов, детритогенез и формирование синапсов. Однако его роль в нейрогенезе человека до сих пор остается мало изученной.
Одной из главных проблем изучения патологий, проявляющихся в нарушении умственного развития, является отсутствие модели для реконструкции заболевания. Несмотря на консервативность ранних этапов нейроге-неза у млекопитающих, многие аспекты и клинические проявления невозможно воспроизвести на лабораторных животных. К настоящему моменту, разработаны технологии получения пациент-специфических индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) и их направленной дифференцировки в церебральные органоиды [2], которые позволяют преодолеть подобные ограничения.
Для изучения ранних этапов нейрогенеза были получены церебральные органоиды человека из линий ИПСК, мутантных по гену CNTN6. В AAVS локус этих линий ИПСК внесена генетическая конструкция, позволяющая активировать оверэкспрессию Contactin 6. Обнаружено, что оверэкспрессия белка Contactin 6 в нокаутных по гену CNTN6 органоидах обеспечивает частичное восстановление фенотипа, которое проявляется в виде увеличения количества нейроэпителиальных структур. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 19-2904067 мк) и Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (проект № 075-15-2021-1063). Культивирование линий ИПСК проводили на базе ЦКП «Коллекция плюрипотентных культур клеток человека и млекопитающих общебиологического и биомедицинского направления» ИЦиГ СО РАН. Микроскопический анализ проведен на базе ЦКП микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН.
Литература:
1. Kashevarova A. et al. Mol Cytogenet. 2014 Dec 31;7(1):97.
2. Lancaster M., Rennen M., Martin CA. et al. Nature 501, 373379 (2013).
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ У ПАЦИЕНТОВ С ОЖИРЕНИЕМ
В.И. Чечехин, Н.И. Калинина, В.Ю. Сысоева, К.Ю. Кулебякин, П.А. Тюрин-Кузьмин
Кафедра биохимии и молекулярной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: v-chech@mail.ru
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимные стро-мальные клетки, мезенхимные стволовые клетки, норадре-налин, ожирение, артериальная гипертензия, анализ транс-криптома одиночных клеток.
Артериальная гипертензия является одним из самых распространенных сердечно-сосудистых заболеваний в мире и выступает в качестве фактора риска развития множества заболеваний. При этом порядка 60-70% случаев артериальной гипертензии ассоциировано с ожирением. Ожирение приводит к усилению симпатической иннервации, что приводит к повышению артериального давления. Однако не все случаи ожирения приводят к развитию артериальной гипертензии. Контроль функций жировой ткани и ее сосудов осуществляют мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (МСК), популяция которых включает перициты. В качестве модели усиления симпатической
стимуляции мы использовали двукратное добавление но-радреналина с интервалом в 6 часов. Ранее мы показали, что стимуляция МСК в этих условиях приводит к усилению чувствительности клеток к норадреналину. В данной работе мы изучали, как влияет норадреналин на функциональную активность МСК и их способность к контракции.
Используя иммуногистохимическое окрашивание жировой ткани, мы определили, что а1А-АР локализуются не в ГМК и не в эндотелии, а в МСК, располагающихся рядом с симпатическими нервными волокнами. Далее мы показали, что способность к повышению в ответ на действие норадреналина чувствительности клеток к контрактильным сигналам коррелирует с уровнем артериального давления у пациентов с ожирением. Используя анализ транскриптома одиночных клеток, мы показали, что после двукратной стимуляции норадреналином происходит увеличение количества муральных и фибробла-стоподобных клеток. Функциональность наблюдаемых изменений клеток проверяли с помощью модели контракции коллагеновых дисков. При двукратном действии норадре-налина происходит значительное усиление контракции МСК коллагеновых дисков. Используя вестерн-блоттинг, мы установили, что через 6 часов после стимуляции норадреналином в МСК повышается уровень а1А-АР. Используя ПЦР и ингибиторы трансляции и транскрипции, мы показали, что при действии норадреналина происходит увеличение трансляции а1А-АР, но не изменяется уровень мРНК данного белка. Используя ингибиторный анализ, мы показали, что норадреналин повышает а1А-АР через каскад ßS-АР/аденилатциклаза/цАМФ/РКА. При этом иммуноферментный анализ показал, что РКА при действии норадреналина не входит в ядро клетки, а, вероятно, действует на цитоплазматические мишени.
Таким образом, сенситизация а1А-АР в МСК при действии норадреналина запускается сигнальным каскадом ßß-АР/аденилатциклаза/цАМФ/РКА и активацией трансляции, но не транскрипции. При двукратном воздействии норадреналином в МСК увеличивается доля контрактильных муральных и фибробластоподобных клеток. Финансирование: Исследование выполнено при поддержке РНФ в рамках проекта № 21-15-00311.
АНТИАПОПТОТИЧЕСКИЙ БЕЛОК BCL-2 ВЗАИМОЕЙСТВУЕТ С РЕЦЕПТОРОМ IP3R И ВОССТАНАВЛИВАЕТ ЧИСЛО СИНАПТИЧЕСКИХ КОНТАКТОВ В ГИППОКАМПЕ 5FAD МЫШЕЙ С БОЛЕЗНЬЮ АЛЬЦГЕЙМЕРА
М.Е. Чигряй1, А.В. Раковская1,
Д.П. Чернюк1, А.Б. Гордеев1, Е.И. Пчицкая1,
Г. Балтынк2, И.Б. Безпрозванный1, 3
1 Лаборатория молекулярной нейродегенерации, Санкт-Петербургский политехнический Университет Петра Великого, Санкт-Петербург, Россия
2 Лаборатория молекулярной и клеточной сигнализации, КУ Левена, Левен, Бельгия
3 Отделение физиологии, Юго-Западный медицинский центр штата Юта, Даллас, США
e-mail: margarita075@gmail.com
Ключевые слова: болезнь Альцгеймера, апоптоз, рак, аде-ноассоциированные вирусы, Bcl-2, IP3R.
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой самую распространенную форму деменции. Несмотря на широкую распространенность данного заболевания,
в настоящее время не существует эффективного лечения БА. Одним из характерных патологических признаков является нарушение регуляции Ca2+ в нейронах [1], которое приводит к сокращению синаптических контактов в нейронах гиппокампа.
Белки Bcl-2 являются важными модуляторами динамики внутриклеточного Са2+. Bcl-2 ингибирует высвобождение Ca2+ из эндоплазматического ре-тикулума (ЭР) посредством ингибирования инозитол-1,4,5-трифосфатного (IP3Rs) и рианодинового (RyR2) рецепторов. Связывание Bcl-2 с IP3R подавляет проа-поптотическую передачу сигналов Ca2+, указывая на то, что комплекс Bcl-2-IP3R может представлять собой потенциальную терапевтическую мишень при лечении БА и некоторых видов рака.
В данном проекте мы оценили синаптопротекторные свойства белка Bcl-2 в 5FAD мышиной модели БА. Для этого мыши были проинжектированы аденоассоции-рованными вирусами, кодирующими белки Bcl-2 и Bcl-2K17D, в котором мутация K17D нарушает функцию связывания с IP3R1. Результаты показали, что гиперэкспрессия Bcl-2 способствует предотвращению синап-тотоксического эффекта на нейроны, гиперэкспрессия Bcl-2K17D также уменьшает потерю синаптических контактов, но в меньшей степени, чем Bcl-2.
Так же была оценена ко-локализация Bcl-2 и IP3R в гип-покампальных нейронах. Было обнаружено, что оба белка находятся в соме нейронов, преимущественно в виде кластеров, при этом окрашивание срезов мозга на митохон-дриальный маркер Tom20 показал, что белок Bcl-2 преимущественно локализуется в митохондриях. Результаты исследований показали, что Bcl-2 и IP3R характеризуются низким уровнем совместной локализации как в нейронах гиппокампа дикого типа, так и в линии 5xFAD. С помощью экспансионной микроскопии [2], было показано, что некоторые кластеры Bcl-2 контактируют с кластерами IP3R, таким образом, контактируя с кластерами IP3R1. Это подтверждает предположение о том, что эти белки расположены в разных клеточных органеллах, IP3R1 — в ЭР, а Bcl-2 — в митохондриях, где он кластеризуется в местах контакта с ЭР, в так называемых митохондриально-ассоциирован-ных мембранах. Поддержано РНФ № 20-45-01004.
Литература:
1. I. Bezprozvanny et al. Trends Neurosci. 31 (2008) 454-463.
2. Деревцова К.З. и др. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 107 (2021) 4-5.
ИЗУЧЕНИЕ NOTCH — ОПОСРЕДОВАННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЛЁГОЧНЫХ РЕЗИДЕНТНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
И.В. Чистякова1, Н.И. Бакаленко1, М.А. Атюков2, А.Б. Малашичева1
1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения
«Городская многопрофильная больница № 2», Санкт-Петербург, Россия
e-mail: itjerena7@gmail.com
Ключевые слова: Notch, лёгочные фибробласты, миофи-бробласты, дифференцировка.
Миофибробласты участвуют в репарации/ремодели-ровании поврежденной ткани путём синтеза внутриклеточного матрикса. Однако, при нарушении репаративного
процесса, избыточная продукция матрикса персистирую-щими миофибробластами может привести к развитию фиброза. Миофибробласты имеют множественное происхождение и включают резидентные фибробласты, фиброциты, эпителиальные клетки, подвергающиеся эпителиально-ме-зенхимальному переходу (ЭМП) [1]. Известно, что сигнальный путь Notch, представленный у млекопитающих четырьмя типами рецепторов (Notch1-4), участвует в регуляции дифференцировки миофибробластов в развитии фиброза различных органов и тканей [2, 3, 4]. В ряде исследований было показано, что Notch1 и Notch3 опосредуют миофи-бробластную дифференцировку клеток легких [2, 3].
Цель исследования — оценить влияние активации 4-х рецепторов Notch на резидентные лёгочные фибро-бласты человека.
В работе использовали культуру лёгочных фибро-бластов человека, полученную в результате частичной резекции лёгкого. Notch-зависимую активацию клеток осуществляли путем введения лентивирусного вектора, несущего внутренний домен Notch-рецепторов (NICD1-4). После трансдукции культивирование клеток проводили в течении 8 дней. С помощью методов ПЦР в реальном времени и иммуноцитохимии анализировали изменения экспрессии маркеров ЭПМ (SNAIL, SLUG) и миофибробластов (a-SMA).
Нами было установлено, что активация NICD1-4 приводит к усилению экспрессии маркеров ЭМП SNAIL, SLUG, и a-SMA. Интересно, что в нашем случае наиболее выраженный эффект наблюдался в легочных фибробла-стах, трансдуцированных конструкцией NICD4. Участие этого рецептора раннее не было показано в профиброти-ческих процессах как в легких, так и в других тканях.
Таким образом, NICD2/NICD4-зависимая активация способствует дифференцировке фибробластов в мио-фибробласты, наряду с NICD1/NICD3, являющимися одними из ключевых факторов, участвующих в развитии фиброза. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грантовое соглашение № 075-15-2021-1075).
Литература:
1. Micallef L., Vedrenne N., Billet F. et al. Fibrogen. Tis. Rep. 2012.
V.5. S.1.S5.
2. Liu T., Hu B. et al. Am.J. Pathol. 2009. V. 174. № 5. P.1745- 1755.
3. Vera L., Garcia-Olloqui P. et al. Am.J. Respir. Cell. Mol. Biol.
2021. V. 64. № 4. P. 465-476.
4. Hu B., Phan S.H. Pharmacol Res. 2016. V. 108. P. 57-64.
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА МЕМБРАННЫХ ВЕЗИКУЛ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА СО СВЕРХЭКСПРЕССИЕЙ ИНТЕРЛЕЙКИНА 2
Д.С. Чулпанова, Т.В. Пухальская, А.А. Ризванов, В.В. Соловьева
Казанский федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: darYachulpanova@gmail.com
Ключевые слова: интерлейкин 2, мезенхимные стволовые клетки, внеклеточные везикулы, иммунотерапия.
Почти все клетки человека выделяют внеклеточные везикулы (ВВ), которые способны переносить содержимое цитоплазмы родительских клеток и участвуют в межклеточной коммуникации. ВВ мезенхимных стволовых
