CC BY
6
в настоящее время не существует эффективного лечения БА. Одним из характерных патологических признаков является нарушение регуляции Ca2+ в нейронах [1], которое приводит к сокращению синаптических контактов в нейронах гиппокампа.
Белки Bcl-2 являются важными модуляторами динамики внутриклеточного Са2+. Bcl-2 ингибирует высвобождение Ca2+ из эндоплазматического ре-тикулума (ЭР) посредством ингибирования инозитол-1,4,5-трифосфатного (IP3Rs) и рианодинового (RyR2) рецепторов. Связывание Bcl-2 с IP3R подавляет проа-поптотическую передачу сигналов Ca2+, указывая на то, что комплекс Bcl-2-IP3R может представлять собой потенциальную терапевтическую мишень при лечении БА и некоторых видов рака.
В данном проекте мы оценили синаптопротекторные свойства белка Bcl-2 в 5FAD мышиной модели БА. Для этого мыши были проинжектированы аденоассоции-рованными вирусами, кодирующими белки Bcl-2 и Bcl-2K17D, в котором мутация K17D нарушает функцию связывания с IP3R1. Результаты показали, что гиперэкспрессия Bcl-2 способствует предотвращению синап-тотоксического эффекта на нейроны, гиперэкспрессия Bcl-2K17D также уменьшает потерю синаптических контактов, но в меньшей степени, чем Bcl-2.
Так же была оценена ко-локализация Bcl-2 и IP3R в гип-покампальных нейронах. Было обнаружено, что оба белка находятся в соме нейронов, преимущественно в виде кластеров, при этом окрашивание срезов мозга на митохон-дриальный маркер Tom20 показал, что белок Bcl-2 преимущественно локализуется в митохондриях. Результаты исследований показали, что Bcl-2 и IP3R характеризуются низким уровнем совместной локализации как в нейронах гиппокампа дикого типа, так и в линии 5xFAD. С помощью экспансионной микроскопии [2], было показано, что некоторые кластеры Bcl-2 контактируют с кластерами IP3R, таким образом, контактируя с кластерами IP3R1. Это подтверждает предположение о том, что эти белки расположены в разных клеточных органеллах, IP3R1 — в ЭР, а Bcl-2 — в митохондриях, где он кластеризуется в местах контакта с ЭР, в так называемых митохондриально-ассоциирован-ных мембранах. Поддержано РНФ № 20-45-01004.
Литература:
1. I. Bezprozvanny et al. Trends Neurosci. 31 (2008) 454-463.
2. Деревцова К.З. и др. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 107 (2021) 4-5.
ИЗУЧЕНИЕ NOTCH — ОПОСРЕДОВАННОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ЛЁГОЧНЫХ РЕЗИДЕНТНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
И.В. Чистякова1, Н.И. Бакаленко1, М.А. Атюков2, А.Б. Малашичева1
1 Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
2 Санкт-Петербургское государственное бюджетное учреждение здравоохранения
«Городская многопрофильная больница № 2», Санкт-Петербург, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: Notch, лёгочные фибробласты, миофи-бробласты, дифференцировка.
Миофибробласты участвуют в репарации/ремодели-ровании поврежденной ткани путём синтеза внутриклеточного матрикса. Однако, при нарушении репаративного
процесса, избыточная продукция матрикса персистирую-щими миофибробластами может привести к развитию фиброза. Миофибробласты имеют множественное происхождение и включают резидентные фибробласты, фиброциты, эпителиальные клетки, подвергающиеся эпителиально-ме-зенхимальному переходу (ЭМП) [1]. Известно, что сигнальный путь Notch, представленный у млекопитающих четырьмя типами рецепторов (Notch1-4), участвует в регуляции дифференцировки миофибробластов в развитии фиброза различных органов и тканей [2, 3, 4]. В ряде исследований было показано, что Notch1 и Notch3 опосредуют миофи-бробластную дифференцировку клеток легких [2, 3].
Цель исследования — оценить влияние активации 4-х рецепторов Notch на резидентные лёгочные фибро-бласты человека.
В работе использовали культуру лёгочных фибро-бластов человека, полученную в результате частичной резекции лёгкого. Notch-зависимую активацию клеток осуществляли путем введения лентивирусного вектора, несущего внутренний домен Notch-рецепторов (NICD1-4). После трансдукции культивирование клеток проводили в течении 8 дней. С помощью методов ПЦР в реальном времени и иммуноцитохимии анализировали изменения экспрессии маркеров ЭПМ (SNAIL, SLUG) и миофибробластов (a-SMA).
Нами было установлено, что активация NICD1-4 приводит к усилению экспрессии маркеров ЭМП SNAIL, SLUG, и a-SMA. Интересно, что в нашем случае наиболее выраженный эффект наблюдался в легочных фибробла-стах, трансдуцированных конструкцией NICD4. Участие этого рецептора раннее не было показано в профиброти-ческих процессах как в легких, так и в других тканях.
Таким образом, NICD2/NICD4-зависимая активация способствует дифференцировке фибробластов в мио-фибробласты, наряду с NICD1/NICD3, являющимися одними из ключевых факторов, участвующих в развитии фиброза. Исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (грантовое соглашение № 075-15-2021-1075).
Литература:
1. Micallef L., Vedrenne N., Billet F. et al. Fibrogen. Tis. Rep. 2012.
V.5. S.1.S5.
2. Liu T., Hu B. et al. Am.J. Pathol. 2009. V. 174. № 5. P.1745- 1755.
3. Vera L., Garcia-Olloqui P. et al. Am.J. Respir. Cell. Mol. Biol.
2021. V. 64. № 4. P. 465-476.
4. Hu B., Phan S.H. Pharmacol Res. 2016. V. 108. P. 57-64.
ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЕ СВОЙСТВА МЕМБРАННЫХ ВЕЗИКУЛ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА СО СВЕРХЭКСПРЕССИЕЙ ИНТЕРЛЕЙКИНА 2
Д.С. Чулпанова, Т.В. Пухальская, А.А. Ризванов, В.В. Соловьева
Казанский федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: интерлейкин 2, мезенхимные стволовые клетки, внеклеточные везикулы, иммунотерапия.
Почти все клетки человека выделяют внеклеточные везикулы (ВВ), которые способны переносить содержимое цитоплазмы родительских клеток и участвуют в межклеточной коммуникации. ВВ мезенхимных стволовых
клеток (МСК) представляют интерес как терапевтический инструмент для бесклеточной терапии онкологических заболеваний, поскольку описана иммуномодулиру-ющая активность генетически модифицированных МСК, синтезирующих различные цитокины.
МСК были выделены из жировой ткани человека и генетически модифицированы лентивирусом, кодирующим ген интерлейкина 2 (IL2). Для получения индуцированных мембранных везикул (иМВ) МСК обрабатывали цитохалазином B. Для оценки иммуномодулирующих свойств иМВ МСК мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из периферической крови человека и культивировали совместно с иМВ (50 мкг/ мл) в течение 72 часов. Активацию МКПК определяли путем окрашивания антителами, специфичными для поверхностных маркеров различных популяций иммунных клеток человека. Для анализа противоопухолевой активности МКПК активированные иммунные клетки добавляли к клеткам трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231. Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали с помощью RTCA xCelligence (ACEA Biosciences, США) в течение 72 часов. Жизнеспособность опухолевых клеток оценивали через 24 часа после культивирования с МКПК с использованием Annexin V Apoptosis Detection Kit (Biolegend, США).
Количество активированных Т-киллеров было в 2 раза увеличено после инкубации с иМВ-^2 по сравнению с нативными МКПК и МКПК, инкубировавшимися с нативными иМВ. Через 24 часа после добавления активированных иМВ-^2 МКПК пролиферация клеток MDA-MB-231 снизилась в 4 раза по сравнению с нативными MDA-MB-231 и MDA-MB-231 инкубировавшихся с нативными МКПК и МКПК после нативных иМВ. Такое снижение пролиферации, вероятно, связано с тем, что часть опухолевых клеток подверглась апоп-тозу, что подтверждается анализом жизнеспособности клеток MDA-MB-231 после 24 часов культивирования с МКПК, активированных иМВ-^2.
Использование иМВ-^2 может быть эффективным для лечения трижды негативного рака молочной железы, поскольку иМВ-^2 способны активировать и стимулировать пролиферацию Т-киллеров, которые, в свою очередь, способны индуцировать апоптоз клеток рака молочной железы. Однако необходимы дальнейшие исследования эффективности иМВ на моделях опухолей in vivo. Работа выполнена за счет средств программы стратегического академического лидерства КФУ (ПРИ0РИТЕТ-2030).
ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОСТНОГО АУТОРЕГЕНЕРАТА
Г.П. Чупрынин, И.В. Супрун, Е.А. Солоп, А.А. Фоменко, А.А. Веревкин, М.Л. Муханов
ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России, Краснодар, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: репаративный остеогенез, ауторегене-рат, иммуногистохимия.Нарушение сращения переломов, особенно на фоне дефекта костной ткани, остаётся существенной проблемой травматологии и ортопедии. Среди факторов, влияющих на темпы консолидации, можно назвать состояние микроциркуляторного русла, а также наличие таких веществ, как костные морфогенетические белки (ВМР), остеопонтин и остеокальцин.
Перспективным методом заживления кости выступает использование костного ауторегенерата — организующейся гематомы из области искусственно созданного перелома, богатой необходимыми для регенерации биологически активными веществами.
Целью исследования была оценка экспрессии специфических маркеров костной ткани в процессе консолидации перелома с применением ауторегенерата.
Модель травмы создавали на 12 баранах. В экспериментальной группе (п=7) для консолидации перелома использовали остеосинтез и ауторегенерат. В контрольной группе (п=5) ауторегенерат не применяли. Приготовили гистологические препараты из фрагмента регенерировавшей кости. Провели иммуногистохимическую реакцию с антителами к остеокальцину, остеопонтину, ВМР-7 и макросиалину (0068).
Гистологические препараты из экспериментальной группы характеризовались эффективным репаративным остеогенезом. Было выявлено большое количество костных трабекул с выраженным клеточным компонентом. Аналогичные препараты контрольной группы отличались тонкими трабекулами с малым количеством клеток. Существенных различий в строении и плотности микро-циркуляторного русла не выявлено.
Подавляющее большинство клеток в препаратах из экспериментальной группы демонстрировало осте-огенную дифференцировку. Об этом говорила резко положительная реакция на остеокальцин (85% всех клеток) и остеопонтин (80% клеток). ВМР-7 был выявлен в костной ткани и в прилегающей надкостнице и окружающих мягких тканях. В то же время, темпы остеокла-стической резорбции новообразованной кости были невысокими, о чем говорит низкое количество 0068-позитивных клеток. В препаратах контрольной группы экспрессия остеокальцина отмечалась в 60%, а остеопонтин — в 50% клеток. Экспрессия ВМР-7 отмечена на границе зоны репарации.
Морфологическая картина репаративного остеогене-за существенно различается в зависимости от применения костного ауторегенерата. Полноценное восстановление костной ткани, о котором свидетельствуют высокие уровни экспрессии специфических маркеров кости, можно связать с действием ростовых факторов и других биологически активных веществ, привнесённых в область регенерации.
КРОСС-КОРРЕКЦИЯ ДЕФИЦИТА (З-ГЕКСОЗАМИНИДАЗЫ А В МУТАНТНЫХ КЛЕТКАХ ПАЦИЕНТА С БОЛЕЗНЬЮ ТЕЯ-САКСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
A.А. Шаймарданова, Д.С. Чулпанова,
B.В. Соловьева, Ш.С. Исса, А.И. Муллагулова, А.А. Титова, Я.О. Мухамедшина, А.А. Костенников, А.В. Тимофеева, А.М. Аймалетдинов,
И.Р. Нигметзянов, А.А. Ризванов
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: GM2-ганглиозидоз, болезнь Тея-Сакса, болезнь Сандхоффа, лизосомные болезни накопления, генная терапия, клеточно-опосредованная генная терапия, ме-зенхимные стволовые клетки, рекомбинантные аденоассо-циированные вирусы.
