CC BY
8
клеток (МСК) представляют интерес как терапевтический инструмент для бесклеточной терапии онкологических заболеваний, поскольку описана иммуномодулиру-ющая активность генетически модифицированных МСК, синтезирующих различные цитокины.
МСК были выделены из жировой ткани человека и генетически модифицированы лентивирусом, кодирующим ген интерлейкина 2 (IL2). Для получения индуцированных мембранных везикул (иМВ) МСК обрабатывали цитохалазином B. Для оценки иммуномодулирующих свойств иМВ МСК мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из периферической крови человека и культивировали совместно с иМВ (50 мкг/ мл) в течение 72 часов. Активацию МКПК определяли путем окрашивания антителами, специфичными для поверхностных маркеров различных популяций иммунных клеток человека. Для анализа противоопухолевой активности МКПК активированные иммунные клетки добавляли к клеткам трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231. Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали с помощью RTCA xCelligence (ACEA Biosciences, США) в течение 72 часов. Жизнеспособность опухолевых клеток оценивали через 24 часа после культивирования с МКПК с использованием Annexin V Apoptosis Detection Kit (Biolegend, США).
Количество активированных Т-киллеров было в 2 раза увеличено после инкубации с иМВ-^2 по сравнению с нативными МКПК и МКПК, инкубировавшимися с нативными иМВ. Через 24 часа после добавления активированных иМВ-^2 МКПК пролиферация клеток MDA-MB-231 снизилась в 4 раза по сравнению с нативными MDA-MB-231 и MDA-MB-231 инкубировавшихся с нативными МКПК и МКПК после нативных иМВ. Такое снижение пролиферации, вероятно, связано с тем, что часть опухолевых клеток подверглась апоп-тозу, что подтверждается анализом жизнеспособности клеток MDA-MB-231 после 24 часов культивирования с МКПК, активированных иМВ-^2.
Использование иМВ-^2 может быть эффективным для лечения трижды негативного рака молочной железы, поскольку иМВ-^2 способны активировать и стимулировать пролиферацию Т-киллеров, которые, в свою очередь, способны индуцировать апоптоз клеток рака молочной железы. Однако необходимы дальнейшие исследования эффективности иМВ на моделях опухолей in vivo. Работа выполнена за счет средств программы стратегического академического лидерства КФУ (ПРИ0РИТЕТ-2030).
ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОСТНОГО АУТОРЕГЕНЕРАТА
Г.П. Чупрынин, И.В. Супрун, Е.А. Солоп, А.А. Фоменко, А.А. Веревкин, М.Л. Муханов
ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России, Краснодар, Россия
e-mail: chupryningp@ksma.ru
Ключевые слова: репаративный остеогенез, ауторегене-рат, иммуногистохимия.Нарушение сращения переломов, особенно на фоне дефекта костной ткани, остаётся существенной проблемой травматологии и ортопедии. Среди факторов, влияющих на темпы консолидации, можно назвать состояние микроциркуляторного русла, а также наличие таких веществ, как костные морфогенетические белки (ВМР), остеопонтин и остеокальцин.
Перспективным методом заживления кости выступает использование костного ауторегенерата — организующейся гематомы из области искусственно созданного перелома, богатой необходимыми для регенерации биологически активными веществами.
Целью исследования была оценка экспрессии специфических маркеров костной ткани в процессе консолидации перелома с применением ауторегенерата.
Модель травмы создавали на 12 баранах. В экспериментальной группе (п=7) для консолидации перелома использовали остеосинтез и ауторегенерат. В контрольной группе (п=5) ауторегенерат не применяли. Приготовили гистологические препараты из фрагмента регенерировавшей кости. Провели иммуногистохимическую реакцию с антителами к остеокальцину, остеопонтину, ВМР-7 и макросиалину (0068).
Гистологические препараты из экспериментальной группы характеризовались эффективным репаративным остеогенезом. Было выявлено большое количество костных трабекул с выраженным клеточным компонентом. Аналогичные препараты контрольной группы отличались тонкими трабекулами с малым количеством клеток. Существенных различий в строении и плотности микро-циркуляторного русла не выявлено.
Подавляющее большинство клеток в препаратах из экспериментальной группы демонстрировало осте-огенную дифференцировку. Об этом говорила резко положительная реакция на остеокальцин (85% всех клеток) и остеопонтин (80% клеток). ВМР-7 был выявлен в костной ткани и в прилегающей надкостнице и окружающих мягких тканях. В то же время, темпы остеокла-стической резорбции новообразованной кости были невысокими, о чем говорит низкое количество 0068-позитивных клеток. В препаратах контрольной группы экспрессия остеокальцина отмечалась в 60%, а остеопонтин — в 50% клеток. Экспрессия ВМР-7 отмечена на границе зоны репарации.
Морфологическая картина репаративного остеогене-за существенно различается в зависимости от применения костного ауторегенерата. Полноценное восстановление костной ткани, о котором свидетельствуют высокие уровни экспрессии специфических маркеров кости, можно связать с действием ростовых факторов и других биологически активных веществ, привнесённых в область регенерации.
КРОСС-КОРРЕКЦИЯ ДЕФИЦИТА (З-ГЕКСОЗАМИНИДАЗЫ А В МУТАНТНЫХ КЛЕТКАХ ПАЦИЕНТА С БОЛЕЗНЬЮ ТЕЯ-САКСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
A.А. Шаймарданова, Д.С. Чулпанова,
B.В. Соловьева, Ш.С. Исса, А.И. Муллагулова, А.А. Титова, Я.О. Мухамедшина, А.А. Костенников, А.В. Тимофеева, А.М. Аймалетдинов,
И.Р. Нигметзянов, А.А. Ризванов
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: aliceshaimardanova@mail.ru
Ключевые слова: GM2-ганглиозидоз, болезнь Тея-Сакса, болезнь Сандхоффа, лизосомные болезни накопления, генная терапия, клеточно-опосредованная генная терапия, ме-зенхимные стволовые клетки, рекомбинантные аденоассо-циированные вирусы.
6М2-ганглиозидозы представляют собой группу ау-тосомно-рецессивных лизосомных болезней накопления. Эти заболевания возникают в результате дефицита лизосомного фермента ß-гексозаминидазы А (HexA). Дефицит HexA вызывает накопление 6М2-ганглиозидов преимущественно в клетках нервной системы, что приводит к тяжелой нейродегенерации и нейровоспалению. В настоящем исследовании была оценена способность генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток (МСК) восстанавливать дефицит HexA в клетках пациента с болезнью Тея-Сакса (БТС) in vitro, а также показана функциональность полученных клеток in vivo.
МСК были генетически модифицированы рекомби-нантными аденоассоциированными вирусами, кодирующими кодон-оптимизированные гены а- и ß-субъединиц фермента HexA (МСК-HEXA-HEXB). МСК-HEXA-HEXB культивировали с МСК пациента с БТС (мутМСК) в системе Трансвелл, после чего изучали эффективность перекрестной коррекции дефицита HexA. Крысам внутривенно вводили 4 х 106 МСК-HEXA-HEXB, контрольным группам вводили нативные МСК или физраствор.
После доставки HexA путем перекрестной коррекции в системе Трансвелл мутМСК содержали кодон-оптими-зированные копии генов HEXA и HEXB. Как а*-, так и ß-субъединицы HexA были обнаружены в мутМСК после перекрестной коррекции. Показано, что после введения МСК-HEXA-HEXB активность HexA значительно повышалась в плазме и органах крыс. В органах крыс обнаружены кодон-оптимизированные копии генов HEXA и HEXB. Введение МСК-HEXA-HEXB не влияло на процент живых клеток в органах иммунной системы, лейко-формулу и уровень воспалительных цитокинов по сравнению с контрольными группами. Гистопатологический анализ не выявил существенных различий между опытной и контрольными группами.
Таким образом, эффективность кросс-коррекции дефицита HexA была показана в мутМСК после взаимодействии с МСК-HEXA-HEXB. Показано, что МСК-HEXA-HEXB экспрессируют функционально активный фермент HexA, выявляемый in vivo, а внутривенное введение клеток не вызывает иммунного ответа у животных. Эти данные позволяют предположить безопасность и функциональность разработанного способа клеточно-опосредованной генной терапии. Работа выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания № 0671-2020-0058 в сфере научной деятельности.
АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ ПОСЛЕ ФОРМИРОВАНИЯ ВЕКТОРНОГО ИММУНИТЕТА
A.А. Шаймарданова, А.И. Муллагулова,
B.В. Соловьева, Я.О. Мухамедшина, А.А. Костенников, А.А. Ризванов
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: aliceshaimardanova@mail.ru
Ключевые слова: метахроматическая лейкодистрофия, лизосомные болезни накопления, генная терапия, рекомби-нантный аденоассоциированный вирус, векторный иммунитет, ААВ9, AABrh10, арилсульфатаза А.
Метахроматическая лейкодистрофия (МЛД) — ауто-сомно-рецессивное наследственное нейродегенератив-ное заболевание, характеризующееся поражением мие-линовой оболочки, покрывающей большинство нервных волокон центральной (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС). МЛД возникает вследствие дефицита лизосомного фермента арилсульфатазы А (АРБА), из-за различных мутаций в гене АПБА. Клинически МЛД проявляется прогрессирующей двигательной и когнитивной недостаточностью у пациентов. Цель исследования — проанализировать эффект последовательных внутривенных и интратекальных инъекций ААВ9-соАП8А или ААВгМО-соАРБА и оценить их функциональную активность и биобезопасность. Мы разработали 9 и 10 се-ротипы ААВ, кодирующих ген АПБА. Мини-пигам внутривенно вводили ААВ9. Через 2 месяца животные были разделены на 2 группы. Первой группе интратекально вводили ААБ9-АПБА, второй — ААБЮ-АЯБА. Через месяц мы проанализировали эффективность трансдукции с помощью иммуногистохимического анализа (ИГХ), количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), анализа ферментативной активности АПБА и биохимического анализа крови свиней.
мРНК кодон-оптимизированного гена АПБА была обнаружена в затылочной доле коры головного мозга, мозжечке, шейном, спинном и поясничном отделах спинного мозга и ганглиях тех же отделов свиней после введения вирусов. Достоверных изменений биохимических показателей после введения препаратов не наблюдалось. При исследовании тканей ЦНС с помощью ИГХ выявлена сверхэкспрессия АПБА. После повторного введения ААБЮ-АПБА, количество трансдуцированных нейронов в мозжечке, спинном мозге и спинномозговых ганглиях было значительно выше, чем после введения ААВ9-АПБА. Тем не менее, способность ААВ10-АПБА транс-дуцировать нейроны спинного мозга на уровне шейного утолщения и спинномозговых ганглиев шейного и поясничного отделов спинного мозга значительно выше по сравнению с ААВ9-АПБА. Повторное введение ААВ9-АПБА приводит к наиболее эффективной трансдукции нейронов мозжечка и серого вещества спинного мозга на уровне поясничного утолщения. Работа выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания № 0671-2020-0058 в сфере научной деятельности.
МАКРОФАГИ КАК КОМПОНЕНТ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ГИСТИОНА НА ФОНЕ ЗАКРЫТИЯ ИШЕМИЗИРОВАННОГО КОЖНОГО ДЕФЕКТА ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫМ КОНСТРУКТОМ ИЗ КОЛЛАГЕНА И ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ
Е.Ю. Шаповалова, Ю.Г. Барановский, С.В. Харченко, И.А. Лугин, А.Г. Барановский
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», Симферополь, Россия
e-mail: Shapovalova_L@mail.ru
Ключевые слова: кожный дефект, дермальный эквивалент, раневой процесс, макрофаг, фибробласт.
Целью исследования было изучение присутствия макрофагов (М) в тканях модельной
