CC BY
10
6М2-ганглиозидозы представляют собой группу ау-тосомно-рецессивных лизосомных болезней накопления. Эти заболевания возникают в результате дефицита лизосомного фермента ß-гексозаминидазы А (HexA). Дефицит HexA вызывает накопление 6М2-ганглиозидов преимущественно в клетках нервной системы, что приводит к тяжелой нейродегенерации и нейровоспалению. В настоящем исследовании была оценена способность генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток (МСК) восстанавливать дефицит HexA в клетках пациента с болезнью Тея-Сакса (БТС) in vitro, а также показана функциональность полученных клеток in vivo.
МСК были генетически модифицированы рекомби-нантными аденоассоциированными вирусами, кодирующими кодон-оптимизированные гены а- и ß-субъединиц фермента HexA (МСК-HEXA-HEXB). МСК-HEXA-HEXB культивировали с МСК пациента с БТС (мутМСК) в системе Трансвелл, после чего изучали эффективность перекрестной коррекции дефицита HexA. Крысам внутривенно вводили 4 х 106 МСК-HEXA-HEXB, контрольным группам вводили нативные МСК или физраствор.
После доставки HexA путем перекрестной коррекции в системе Трансвелл мутМСК содержали кодон-оптими-зированные копии генов HEXA и HEXB. Как а*-, так и ß-субъединицы HexA были обнаружены в мутМСК после перекрестной коррекции. Показано, что после введения МСК-HEXA-HEXB активность HexA значительно повышалась в плазме и органах крыс. В органах крыс обнаружены кодон-оптимизированные копии генов HEXA и HEXB. Введение МСК-HEXA-HEXB не влияло на процент живых клеток в органах иммунной системы, лейко-формулу и уровень воспалительных цитокинов по сравнению с контрольными группами. Гистопатологический анализ не выявил существенных различий между опытной и контрольными группами.
Таким образом, эффективность кросс-коррекции дефицита HexA была показана в мутМСК после взаимодействии с МСК-HEXA-HEXB. Показано, что МСК-HEXA-HEXB экспрессируют функционально активный фермент HexA, выявляемый in vivo, а внутривенное введение клеток не вызывает иммунного ответа у животных. Эти данные позволяют предположить безопасность и функциональность разработанного способа клеточно-опосредованной генной терапии. Работа выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания № 0671-2020-0058 в сфере научной деятельности.
АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ НА ОСНОВЕ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫХ ВИРУСОВ ПОСЛЕ ФОРМИРОВАНИЯ ВЕКТОРНОГО ИММУНИТЕТА
A.А. Шаймарданова, А.И. Муллагулова,
B.В. Соловьева, Я.О. Мухамедшина, А.А. Костенников, А.А. Ризванов
Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: метахроматическая лейкодистрофия, лизосомные болезни накопления, генная терапия, рекомби-нантный аденоассоциированный вирус, векторный иммунитет, ААВ9, AABrh10, арилсульфатаза А.
Метахроматическая лейкодистрофия (МЛД) — ауто-сомно-рецессивное наследственное нейродегенератив-ное заболевание, характеризующееся поражением мие-линовой оболочки, покрывающей большинство нервных волокон центральной (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС). МЛД возникает вследствие дефицита лизосомного фермента арилсульфатазы А (АРБА), из-за различных мутаций в гене АПБА. Клинически МЛД проявляется прогрессирующей двигательной и когнитивной недостаточностью у пациентов. Цель исследования — проанализировать эффект последовательных внутривенных и интратекальных инъекций ААВ9-соАП8А или ААВгМО-соАРБА и оценить их функциональную активность и биобезопасность. Мы разработали 9 и 10 се-ротипы ААВ, кодирующих ген АПБА. Мини-пигам внутривенно вводили ААВ9. Через 2 месяца животные были разделены на 2 группы. Первой группе интратекально вводили ААБ9-АПБА, второй — ААБЮ-АЯБА. Через месяц мы проанализировали эффективность трансдукции с помощью иммуногистохимического анализа (ИГХ), количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР), анализа ферментативной активности АПБА и биохимического анализа крови свиней.
мРНК кодон-оптимизированного гена АПБА была обнаружена в затылочной доле коры головного мозга, мозжечке, шейном, спинном и поясничном отделах спинного мозга и ганглиях тех же отделов свиней после введения вирусов. Достоверных изменений биохимических показателей после введения препаратов не наблюдалось. При исследовании тканей ЦНС с помощью ИГХ выявлена сверхэкспрессия АПБА. После повторного введения ААБЮ-АПБА, количество трансдуцированных нейронов в мозжечке, спинном мозге и спинномозговых ганглиях было значительно выше, чем после введения ААВ9-АПБА. Тем не менее, способность ААВ10-АПБА транс-дуцировать нейроны спинного мозга на уровне шейного утолщения и спинномозговых ганглиев шейного и поясничного отделов спинного мозга значительно выше по сравнению с ААВ9-АПБА. Повторное введение ААВ9-АПБА приводит к наиболее эффективной трансдукции нейронов мозжечка и серого вещества спинного мозга на уровне поясничного утолщения. Работа выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства Казанского (Приволжского) федерального университета (ПРИ0РИТЕТ-2030) и за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания № 0671-2020-0058 в сфере научной деятельности.
МАКРОФАГИ КАК КОМПОНЕНТ РЕГЕНЕРАТИВНОГО ГИСТИОНА НА ФОНЕ ЗАКРЫТИЯ ИШЕМИЗИРОВАННОГО КОЖНОГО ДЕФЕКТА ТКАНЕИНЖЕНЕРНЫМ КОНСТРУКТОМ ИЗ КОЛЛАГЕНА И ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ
Е.Ю. Шаповалова, Ю.Г. Барановский, С.В. Харченко, И.А. Лугин, А.Г. Барановский
ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В.И. Вернадского», Симферополь, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: кожный дефект, дермальный эквивалент, раневой процесс, макрофаг, фибробласт.
Целью исследования было изучение присутствия макрофагов (М) в тканях модельной
кожной ишемизированной раны на этапах заживления после трансплантации дермального эквивалента с фибробластами.
В работе использовали 56 мышей линии С57/В1 в возрасте 5-7 месяцев. Операционным путем формировали ишемизированную рану [1]. Из кожи ферментативным путем выделяли фибробласты в условиях стерильного бокса. Их соединяли с коллагеном I типа для формирования дермального эквивалента [2]. Присутствие М определяли им-муногистохимическим методом в парафиновых срезах био-птатов на 4, 7, 10, 12, 15, 19, 23 и 26 сутки после операции по наличию в клетках антигена CD68. Первичными антителами были CD68 фирмы Gene Tex Inc (США) в разведении 1:100. Обзорные срезы биоптатов окрашивали гематоксилином и эозином. Статистическую обработку цифровых данных проводили с использованием аналитического пакета приложения STATISTICA Enterprise (StatSoft Inc., США).
На 4-е сутки в срезах биоптатов среди клеток грануляционной ткани идентифицируются активные тканевые М. Индекс CD68-положительных клеток составляет 20,43 ± 0,08%. На 7-е сутки индекс клеток, имеющих антиген CD68, уменьшился на 8,37 ± 0,01% по сравнению с 4-ми сутками. На 10-е сутки репарации индекс макрофагов (Им) составляет 13,25 ± 0,01% (сократился статистически достоверно на 29,22 ± 0,04% по отношению к 7-м суткам). На 12-е сутки прослеживается увеличение индекса CD68-положительных клеток статистически достоверно на 11,19 ± 0,01% по отношению к 10-му дню регенерации. В последующие изученные периоды заживления ишемизированной модельной раны на 15-е, 19-е, 23-и и 26-е сутки ИМ последовательно статистически достоверно снижается на 32,17 ± 0,03%, 38,93±%, 36,41 ± 0,02% и 43,23 ± 0,01% соответственно.
Таким образом, ИМ был самым высоким на 4-е сутки заживления раны. В последующие до 26-х суток сроки индекс CD68+ клеток неуклонно снижается, за исключением периода времени от 10-х до 12-х суток, когда он увеличивается, возможно, из-за способности М тормозить активность фибробластов, выделяя медиаторы воспаления и другие протеазы [3].
Литература:
1. Барановский Ю.Г., Ильченко Ф.Н., Шаповалова Е.Ю. Вестник неотложной и восстановительной хирургии. 2016. Т. 1. № 2. С. 259-261.
2. Андреев Д.Ю., Абрамова Н.В., Блинова М.И. и др. Вестник хирургии им. И.И. Грекова. 2013. Т.172. № 1. С. 104-107.
3. Одинцова И.А., Данилов Р.К., Гололобов В.Г. и др. Морфология. 2014. Т. 145. № 3. С. 147-147а.
МИТОХОНДРИАЛЬНО-АДРЕСОВАННЫЙ АНТИОКСИДАНТ ПОЛИОЛМЕТАНОФУЛЛЕРЕН СНИЖАЕТ ВЫЖИВАЕМОСТЬ КЛЕТОК ГЛИОБЛАСТОМЫ IN VITRO
Г.Р. Шарапова1, Н.В. Калачева1, Г.М. Фазлеева2, Л.Н. Исламова2
1 Институт фундаментальной медицины и биологии, Казанский федеральный университет, Казань, Россия
2 Институт органической и физической химии
им. А.Е. Арбузова ФИЦ Казанский научный центр РАН, Казань, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: полиолметанофуллерен, противоопухолевый антиоксидант, глиобластома, астроцитома, OXPHOS, гликолиз.
Энергетический метаболизм в опухолевых клетках изменен по сравнению с нормальными клетками и, следовательно, может служить мишенью в противоопухолевой терапии. Биоэнергетический фенотип опухоли варьирует от гликолитического до окислительного и зависит от типа раковой опухоли, стадии рака и микроокружения опухолевых клеток. Наиболее агрессивные опухолевые клетки, в их числе клетки глиобластомы, характеризуются выраженным окислительно-восстановительным дисбалансом из-за повышенного гликолитического и митохондриаль-ного окислительного метаболизма. Окислительная активность раковых клеток и тканей обусловлена аномально высокими уровнями свободных радикалов [1]. Поэтому антиоксиданты могут играть ведущую роль в противоопухолевой терапии, подавляя трансдукцию сигналов, зависящую от свободных радикалов. В своей работе мы проанализировали энергетические профили 8 различных клеточных линий глиом, используя технологию Seahorse. Исследованные клеточные линии глиом проявляли энергетическую гетерогенность и имели разные уровни OXPHOS и гликолиза. Нами были отобраны две клеточные линии с различными энергетическими профилями — глиобластома A172 (высокие уровни OXPHOS и гликолиза) и астроцитома U251 (низкий уровень OXPHOS и высокий уровень гликолиза). Изучено действие водорастворимого производного фуллерена С60 — полиолметанофуллерена C60[C9H10O4(OH)4]6 на выживаемость клеток этих линий (Crystal Violet method). Ранее нами было установлено, что полиолметанофуллерен проявляет свойства мягкого разобщителя OXPHOS [2] и избирательно снижает мито-хондриальный потенциал в клетках с гиперполяризован-ными митохондриями, включая опухолевые [3]. Кроме того, мы показали впервые, что это производное сохраняет антирадикальные свойства исходного фуллерена С60 (в реакции Фентона), то есть может быть ловушкой для свободных радикалов в клетке. Инкубация клеточных линий глиом с полиолметанофуллереном (100 и 200 |jM) в течение 72 часов снижала выживаемость клеток гли-областомы в среднем на 38%, в то время как снижение выживаемости клеток астроцитомы не превышала 10%. Полученные результаты обосновывают дальнейшее изучение полиолметанофуллерена как перспективного анти-оксиданта при опухолях с повышенным уровнем OXPHOS.
Литература:
1. Hayes J., Dinkova-Kostova A., Tew K. Cancer Cell. 2020. V.
38(2). P. 167-197.
2. Kalacheva N.V. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2018. V. 28(6).
P. 1097-1100.
3. Tarasova G.R. et al. J. Human gene therapy. 2019. V. 30. A. 65.
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ВОЛОКНИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ СПИДРОИНОВ ДЛЯ БИОМЕДИЦИНЫ
Р.В. Шариков1, Д.Р. Стрельцов1, 2,
С.Н. Малахов1, Т.Х. Тенчурин1, Л.И. Давыдова1,
В.Г. Богуш1, С.Н. Чвалун1, 2
1 НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 ФГБУН Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: рекомбинантный спидроин, биополимеры, волокнистые материалы, структурные особенности, механические характеристики.
