CC BY
118
Известия ТИНРО
2013 Том 175
ТЕХНОЛОГИЯ ОБРАБОТКИ ГИДРОБИОНТОВ
УДК 664.951.014:577.15 Ю.М. Позднякова1, Н.Н. Ковалев2, А.И. Чепкасова1*
1 Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный центр,
690091, г. Владивосток, пер. Шевченко, 4;
2 Дальневосточный государственный технический рыбохозяйственный
университет, 690087, г. Владивосток, ул. Луговая, 52б
зависимость сорбции протеолитических ферментов от вязкости хитозанов различного происхождения
Определены физико-химические параметры (показатели ионного эквивалента, удельной поверхности, кинематической вязкости) хитозанов из различных источников и их ферментативных гидролизатов. Исследованы процессы сорбции препарата химопсина и ферментов из гепатопанкреаса краба на хитозанах различного происхождения с различной кинематической вязкостью. Отмечено сходство сорбции протеолитических ферментов препарата химопсин и смеси ферментов печени краба на хитозанах из панциря краба и креветки. Определены рациональные параметры сорбции протеиназ гепатопанкреаса краба на хитозанах из панциря креветки и краба с различной кинематической вязкостью.
Ключевые слова: протеолитические ферменты, гидролизаты хитозанов, сорбция, краб, креветка.
Pozdnyakova Yu.M., Kovalev N.N., Chepkasova A.I. Dependence of proteolytic enzymes sorption on viscosity of chitosans of different origin // Izv. TINRO. — 2013. — Vol. 175. — P. 291-298.
Chemical and physical parameters (ion equivalent, specific surface, kinematic viscosity) are determined for chitosans of different origin and their hydrolyzates. Absorption of the chimopsin preparation and enzymes of crab hepatopancreas on chitosan of different origin with different kinematic viscosity is investigated. The enzymes and chimopsin preparation have similar sorption on the chitosan extracted from shells of crabs and shrimps. Rational parameters of the sorption process are determined for the chitosan with certain kinematic viscosity.
Key words: proteolytic enzyme, hydrolyzate of chitosan, absorption, crab, shrimp.
Введение
Научные разработки в области иммобилизации протеолитических ферментов на носителях различной природы не теряют своей актуальности на протяжении многих лет. Метод иммобилизации широко применяется в производстве лекарственных средств, в пищевой промышленности, в производстве косметических средств, в химическом анализе и многих других областях. Например, разработанные материалы с иммобилизован-
* Позднякова Юлия Михайловна, кандидат технических наук, старший научный сотрудник, е-mail: [email protected]; Ковалев Николай Николаевич, доктор биологических наук, е-mail: [email protected]; Чепкасова Анна Ивановна, младший научный сотрудник, е-mail: [email protected].
Pozdnyakova Julia M., Ph.D., senior researcher, е-mail: [email protected]; Kovalev Nikolai N., D.Sc., е-mail: [email protected]; Chepkasova Anna I., junior researcher, е-mail: [email protected].
ными на тканевой основе различными ферментными препаратами (лизоцим, коллитин, протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба и др.) используют для лечения гнойно-некротических ран различной этиологии (Белов и др., 2003) и в косметологии (Лютова и др., 1999). Повышенное внимание к подобным препаратам объясняется их доступностью, простотой выделения и относительно небольшой стоимостью.
Протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба представляет собой набор эндо- и экзопротеиназ и применяется в медицине в виде растворов и различных мазей (Лютова и др., 1999). Природные полисахариды наиболее часто используют для формирования нековалентных комплексов биокатализатор—полимер. Повышенный интерес к этому типу полиэлектролитов обусловлен их высокой биологической активностью, проявляющейся в биоцидном действии на патогенные организмы, в способности образовывать интерполиэлектролитные комплексы с белками. Среди всех изученных полисахаридов и их производных наибольшую стабильность и активность иммобилизованного препарата обеспечивает хитозан (Веселова и др., 2009), который обладает высокой химической и биологической стойкостью, большой механической прочностью, характеризуется высокой гидрофильностью и малой растворимостью, легко активируется для ковалентного связывания с БАВ (Белов и др., 2009). В последнее время широкое применение находят и олигомеры хитозана. Низкомолекулярные хитозаны, обладая большинством биологических свойств нативного полимера, в то же время приобретают новые — проявляют антимикробную, противоопухолевую, иммуностимулирующую активность (Горбач, 2001). Известно, что хитозан, полученный из разных источников, различается по составу и сорбционным свойствам.
Наиболее распространенными способами получения хитозана являются щелочной и кислотный гидролиз хитина. Однако в последнее время для гидролиза хитозана все шире применяются ферментные препараты (Ильина и др., 2009).
В связи с вышеизложенным представляло интерес провести сравнительное исследование свойств хитозанов с различной кинематической вязкостью, выделенных из разных источников. Цель настоящей работы — исследовать физико-химические характеристики хитозанов и их гидролизатов из панциря креветки, краба и их сорбирующую способность в отношении протеолитических ферментов.
Материалы и методы
В работе использовали гепатопанкреас камчатского краба, заготовленный и замороженный в экспедиционных условиях на месте промысла. Гепатопанкреас хранили при температуре минус 18 оС. Хитозан из карапакса камчатского краба и панциря углохвостой креветки получали согласно ТУ 9283-174-00472012-03 «Крусхитозан. БАД к пище».
Ионный эквивалент определяли по иону меди (II) (Леваньков, Якуш, 2001а).
Определение показателя «Удельная поверхность» проводили по количеству красителя метиленового синего, сорбирующегося на поверхности твердого материала, коррелирующего с величиной поверхности, занимаемой им в результате адсорбции (Леваньков, Якуш, 2001б).
Кинематическую вязкость измеряли вискозиметром Ubbelohde по стандартной методике (Косой, 2007).
Определение протеолитической активности проводили по методу Е.Д. Каверзневой (1971).
Для постановки модельных опытов в качестве протеолитического фермента использовали препарат «Химопсин» (ООО «Самсон», Россия).
Хитозан-ферментные комплексы с химопсином и экстрактами гепатопанкреаса краба получали добавлением раствора хитозана в уксусной кислоте к водному раствору химопсина или водному экстракту гомогената гепатопанкреаса краба (Бакулин и др., 2009).
Ферментолизаты хитозанов из панциря камчатского краба и углохвостой креветки получали путем гидролиза растворов хитозана ферментным препаратом «ЦеллоЛюкс А» (Черкасова и др., 2005).
Результаты и их обсуждение
Одним из важных параметров хитозана как высокомолекулярного полимера является его кинематическая вязкость. Согласно нормативному документу, она должна составлять не менее 2,5 мм2/с.
Кинематическая вязкость, определенная для хитозана из панциря камчатского краба, составила 53,8 мм2/с, что фактически в 20 раз превышает таковую по ТУ № 9283-174-00472012-03 (рис. 1). По-видимому, столь большие различия могут быть объяснены включением в техническую документацию в качестве источников сырья панцирей различных видов крабов. Поскольку свойства хитозанов значительно зависят от источника их получения, в нормативном документе приведена величина наименьшего значения кинематической вязкости.
60
50
О
"з 40
S
Й 30
о
0
1 20
m
10
53,8
2,5
6,92
По ТУ, не менее
Камчатский краб
Углохвостая
креветка
Рис. 1. Кинематическая вязкость хитозанов Fig. і. Kinematic viscosity of chitosans
Для хитозана из панциря углохвостой креветки показатель кинематической вязкости также оказался выше нормируемого хитозана в 2,8 раза и составил 6,9 мм2/с.
С целью получения олигомеров хитозана была проведена его ферментативная деструкция, определены рациональные условия гидролиза хитозана препаратом «ЦеллоЛюкс-А» (Чепкасова, 2011).
Процесс ферментативного гидролиза под действием различных концентраций фермента по-разному влиял на кинематическую вязкость хитозанов из панциря креветки и краба. Так, ферментативная деструкция хитозана из креветки при одинаковых условиях проходила на 30 % более интенсивно, чем деструкция хитозана из панциря краба (рис. 2).
Показатель ионный эквивалент характеризует сорбционные свойства хитозана в отношении ионов и характеризуется количеством иона металла, сорбируемого на і г сорбента (в миллиграммах на грамм). Метод основан на определении концентрации комплекса иона меди (II) с трилоном Б в растворе.
Согласно ТУ N° 9283-174-00472012-03, хитозан должен иметь ионный эквивалент не менее 100 мг/г.
Величина ионного эквивалента, определенная для хитозанов из разных источников, оказалась практически равной: для хитозана из панциря краба она составляет 145 мг/г, а из панциря углохвостой креветки — 150 мг/г (рис. 3). Ферментативная деструкция хитозана не повлияла на его способность сорбировать ионы металлов.
Удельная поверхность хитозанов коррелирует с величиной поверхности, занимаемой красителем в результате адсорбции.
Согласно ТУ № 9283-174-00472012-03, показатель удельной поверхности хитозана должен быть не менее 12 м2/г. На рис. 4 представлены данные, согласно которым показатель удельной поверхности для хитозанов из различных источников составил соответственно 15,0 и 15,5 м2/г.
Рис. 2. Зависимость кинематической вязкости хитозана от степени его гидролиза: Х-К— хитозан из панциря камчатского краба (Paralithodes camtschaticus); Х-уК—хитозан из панциря углохвостой креветки (Pandalus goniurus); 0,02, 0,20 и 2,0 % — концентрация фермента
Fig. 2. Dependence of chitosan kinematic viscosity on hydrolysis degree: Х-К — chitosan extracted from shell of crab Paralithodes camtschaticus; X-yK — chitosan extracted from shell of shrimp Pandalus goniurus; 0,02, 0,20, and 2,0 % — concentration of enzyme
Рис. 3. Зависимость ионного эквивалента по иону меди (II) от степени гидролиза хитозана. Обозначения как на рис. 2
Fig. 3. Dependence of ion equivalent by cuprum ion (II) on chitosan hydrolysis degree (legend as for Fig. 2)
18
16
"s 14
£ 12 О
* Ю
6 — 4 — 2 — 0
□ no ТУ
I X-K
□ X-yK
исходным
2,0 0,20 Целлолюкс, %
0,02
Рис. 4. Зависимость удельной поверхности по метиленовому синему от степени гидролиза хитозана. Обозначения как на рис. 2.
Fig. 4. Dependence of specific surface by methylene blue on chitosan hydrolysis degree (legend as for Fig. 2)
Ферментативная деструкция хитозанов из различных источников не оказала заметного влияния на сорбционные свойства полимера.
Известно, что хитозан обладает способностью связывать белки в растворе. Представляло интерес провести сравнительное исследование способности хитозанов из различных источников и их ферментолизатов связывать ферменты. В качестве модельных систем были выбраны 0,01 % раствор коммерческого препарата «Химопсин» и водный экстракт печени камчатского краба.
Определение протеолитической активности в ткани гепатопанкреаса камчатского краба показало, что наиболее активными являются щелочные протеазы с рН-оптимумом 8,0 (активность 7,7 ± 0,2 Ед/г; при рН 6,0 — 4,1 ± 0,15; при рН 3,7 — 2,4 ± 0,1 Ед/г). Полученные данные согласуются с литературными (Klimova et al., 1990; Сахаров и др., 1992; Сахаров, Джунковская, 1993), где показано, что наибольшая активность ферментов гепатопанкреаса краба наблюдается в области рН 7,0-8,0.
Химопсин содержит два индивидуальных фермента — трипсин и химотрипсин,
— принадлежащих к классу сериновых протеаз, с активностью 6000 Ед/г.
Остаточная протеолитическая активность в экстрактах, полученных после осаждения хитозанами с различной кинематической вязкостью (и, следовательно, полимерностью) из панциря креветки и краба, оказалась близка для ферментов химопсина и гепато-панреаса краба (рис. 5). Полученные данные показали одинаковый характер зависимости сорбции химопсина и ферментов из гепатопанкреаса краба в отношении хитозанов с различной удельной вязкостью из панциря краба и креветки, что может указывать на принадлежность щелочных ферментов ге-патопанкреаса краба к классу сериновых про-теиназ.
Рис. 5. Активность про-теолитических ферментов в экстрактах химопсина и гепатопанкреаса краба после сорбции на хитозанах из панциря креветки и краба
Fig. 5. Activity of proteolytic enzymes of chimop-sin and enzymes of crab hepatopancreas after absorption on chitosan extracted from shells of shrimp and crab
Хитозан из панциря креветки
5-----
О -I------------,-------------,-------------,---------
0,69 1,38 2,21 6,92
Кинематическая вязкость, мм2/с
Для изучения вопроса о сорбционной емкости хитозанов по отношению к ферментам была исследована их способность связывать комплекс протеолитических ферментов из гепатопанкреаса краба. Соотношение экстракт : хитозан в работе подобрали согласно технологии получения вспомогательного средства «Крусэнзим» ТУ 9283-157-00472012-10.
Определение протеолитической активности проводили в экстрактах и осадках после сорбции по двум субстратам: казеин (при рН 8,0) и гемоглобин (при рН 3,4 и 6,0).
В результате исследования активности протеолитических ферментов гепатопан-креаса краба в осадках, образовавшихся после обработки экстрактов ткани хитозанами (рис. 6), установлено, что доля сорбции щелочных протеаз тем выше, чем выше кинематическая вязкость хитозанов из панциря креветки. Полученные данные согласуются с ранее проведенными исследованиями по изучению зависимости сорбции белков от молекулярной массы хитозана из панциря краба (Леваньков, Якуш, 2001в). Однако следует отметить, что для нейтральных протеаз (рН 6,0) характерна иная зависимость: увеличение кинематической вязкости хитозана приводит к снижению количества сорбированного фермента. Высокополимерный хитозан обладал наибольшей афинностью к нейтральным протеазам.
Рис. 6. Зависимость степени сорбции про-теолитических ферментов от кинематической вязкости и источника хитозана
Fig. 6. Dependence of proteolyitic enzymes absorption degree on kinematic viscosity of chitosan and its origin
Иная картина наблюдалась при сорбции комплекса протеолитических ферментов хи-тозаном из панциря краба и его ферментолизатами. Незначительное возрастание сорбции с ростом вязкости, а следовательно, молекулярной массы олигомеров хитозана, показано только для щелочных протеаз (рН 8,0). При сорбции кислых и нейтральных протеаз прямой зависимости количества сорбированного фермента от кинематической вязкости хитозанов не отмечается. Наблюдается специфичное связывание ферментов с хитоза-нами определенной молекулярной массы. Так, 70 % нейтральных протеаз сорбируются хитозаном с вязкостью 24,5 мм2/с и 50 % на хитозане с вязкостью 6,9 мм2/с. Хитозаны с иной вязкостью способны сорбировать от 20 до 30 % активности нейтральных протеаз.
Следует отметить, что при иммобилизации кислых протеаз доля сорбированного фермента снижается при уменьшении вязкости хитозанов.
Для обоснования разработки метода получения иммобилизованных на хитозанах протеолитических ферментов можно предложить следующие рекомендации.
При работе с хитозаном из панциря креветки для создания комплексов с про-теолитическими ферментами гепатопанкреаса краба широкого диапазона рН предпочтительнее использовать негидролизованный хитозан с показателем кинематической вязкости 6,92 мм2/с, так как он отличается наибольшей сорбционной емкостью.
Для извлечения нейтральных протеаз из гепатопанкреаса краба необходимо использовать олигомеры с показателем кинематической вязкости 24,5 мм2/с. Для сорбции щелочных и кислых протеаз, как и в случае с панцирем креветки, предпочтительнее использовать высокополимерный хитозан.
выводы
Проведенные исследования показали возможность ферментативной деградации хитозана, полученного из различных источников. Определенные в ходе работы рациональные условия сорбции протеиназ гепатопанкреаса краба на хитозанах с различной кинематической вязкостью и, следовательно, степенью полимерности могут быть использованы при создании иммобилизованных форм ферментов различной специфичности.
список литературы
Бакулин А.в., Гавриленко Н.в., Червяковский Е.М. и др. Эффективность связывания белков молочной сыворотки с хитозаном // Тр. Белорус. гос. ун-та. — 2009. — Т. 4, ч. 2. — С. 283-289.
Белов А.А., Белова Е.Н., Филатов B.H. Текстильные материалы, содержащие хитозан и протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, для медицинских целей // Биомед. химия. — 2009. — Т. 55, вып. 1. — С. 61-67.
Белов А.А., Белова Л.А., Филатов B.H. и др. Взаимодействие ингибиторов протеиназ плазмы крови с иммобилизованным на диальдегидцеллюлозе протеолитическим комплексом из гепатопанкреаса краба // Вестн. МГУ. Сер. 2. — 2003. — Т. 44, № 1. — С. 16-19.
Beceлoва И.А., Кирейко A.B., Шеховцова Т.Н. Повышение каталитической активности и стабильности пероксидазы хрена за счет включения ее в полиэлектролитный комплекс с хитозаном // Прикл. биохимия и микробиология. — 2009. — Т. 45, № 2. — С. 143-148.
Горбач B.^ Получение хитозана низкого молекулярного веса // Биоактивные вещества из морских макро- и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока : мат-лы науч. конф. — Владивосток, 2001. — С. 41-43.
Ильина A.B., Загорская Д.С., Левов А.Н. и др. Получение низкомолекулярного хитозана и его производных с использованием ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба // Прикл. биохимия и микробиология. — 2009. — Т. 45, № 4. — С. 415-421.
Каверзнева Е.Д. Стандартный метод определения протеолитической активности для комплексных препаратов протеаз // Прикл. биохимия и микробиология. — 1971. — Т. 7, № 2. — С. 225-228.
Косой B^. Инженерная реология. Пособие для лабораторных и практических занятий.
— СПб. : ГИОРД, 2007. — 662 с.
Леваньков C.B., Якуш E.B. Ионообменные свойства хитозана в зависимости от величины его удельной поверхности // Изв. ТИНРО. — 2001а. — Т. 129. — С. 116-120.
Леваньков C.B., Якуш E.B. Удельная поверхность хитозана и способ ее определения // Изв. ТИНРО. — 2001б. — Т. 129. — С. 109-115.
Леваньков C.B., Якуш E.B. Адсорбционные свойства хитозана по отношению к белковым веществам // Изв. ТИНРО. — 2001в. — Т. 129. — С. 121-128.
Лютова Л^., Карабасова М.А., Андреенко T.B. и др. Действие протеолитического препарата морикразы на состояние рубцовой ткани в условиях in vitro // Вопр. мед. химии. — 1999. — Т. 45, вып. 5. — С. 47-51.
Cаxарoв И.Ю., Джунковская A.B. Эластаза из гепатопанкреаса камчатского краба // Биохимия. — 1993. — Т. 58, № 9. — С. 1445-1453.
Cаxарoв И.Ю., Литвин Ф.Е., Артюков А.А. Физико-химические свойства коллагено-литической протеазы C камчатского краба // Биохимия. — 1992. — Т. 57, № 1. — С. 40-45.
Чепкасова А.И. Сравнительная характеристика хитозанов краба и креветки // Тез. докл. 4-й Междунар. науч.-практ. конф. «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». — Южно-Сахалинск, 2011. — С. 248.
Черкасова Е.И., Алексеева М.Ф., Пастухов М.О. и др. Деструкция хитозана ферментным комплексом из Carica рapaya // Биотехнология. — 2005. — № 2. — С. 73-81.
Klimova O.A., Borukhov S.I., Solovieva N.I. et al. The isolation and properties of collagtno-lytic proteases from crab hepatopancreas // Biochem and Biophys. Res. Communs. — 1990. — Vol. 166, № 3. — Р. 1411-1420.
Поступила в редакцию 11.02.13 г.
