CC BY
47
_Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 8_
УДК 577.15.08+606.61
Э.Э. Досадина, А. А. Белов*
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия, 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1
* e-mail: ABelov2004@ yandex.ru
ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ХИТОЗАНА, ЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ НОСИТЕЛЕЙ И БЕЛКОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА
Изучено взаимодействие растворов хитозана с различными целлюлозными носителями и (или) белками протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба. Предложены схемы и механизмы взаимодействия геля хитозана с различными целлюлозными носителями и (или) белками протеолитического комплекса гепатопанкреаса краба. Установлена стабилизация хитозаном не только белков протеолитического комплекса гепатопанкреаса краба, но и диальдегидцеллюлозы.
Ключевые слова: хитозан, целлюлоза, диальдегидцеллюлоза, протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба.
Разработка биологически активных полимерных систем с заданными свойствами имеет большое значение для создания новых материалов, предназначенных для применения в медицине, биотехнологии, экологии и других областях. Одним из перспективных направлений в области поиска новых материалов для медицины стало изучение, создание и внедрение в практику материалов на основе хитозана (Хт). Уникальный комплекс нативных свойств Хт - биосовместимость, биодеградируемость, нетоксичность на фоне высокой биологической и сорбционной активности, позволяют отнести этот аминополисахарид к немногочисленной группе промышленно доступных, экологически безопасных полимеров и, в перспективе, - к потенциально новым биоматериалам на его основе, исключительно подходящим для использования в медицинских целях. Растворимость Хт в разбавленных водных растворах кислот, наряду с волокно- и пленкообразующей способностью и наличием реакционно-способных аминогрупп облегчает модификацию этого полимера и переработку его в полимерные изделия [2]. Поскольку Хт достаточно быстро претерпевает биодеградацию под действием ферментов живого организма, не образуя токсичных веществ, он может стать прекрасным биоразлагаемым защитным материалом для лечения открытых ран и ожогов. Особый интерес могут представлять ферментсодержащие
хитозановые материалы, которые целесообразно использовать на стадии очищения раны от некротических тканей и в косметической терапии келоидных рубцов. При этом существует принципиальная возможность регулирования скорости ферментативного разложения материалов на раневой поверхности [1]. В связи с этим особую актуальность приобретает целенаправленное изучение закономерностей получения
хитозансодержащих ферментных материалов, а также поиск путей регулирования ферментативной устойчивости материалов, полученных на основе Хт.
В работе использовали - протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба (ПК) (ТУ 9281-
004-11734126-00, НПО "Биопрогресс" МО г. Щелково, Россия), Хт- производства НПО "Биопрогресс" (ТУ 9289-067-00472124-03, г. Щелково, МО, РФ) (влажность препарата (10%, степень деацилирования 80,0%; кинематическая вязкость не менее 383,7 сСт; молекулярная масса 478 кДа). Все остальные реактивы, если не оговорено особо, отечественного производства, квалификации не ниже "ХЧ".
Активацию целлюлозного носителя в виде тканых полотен (медицинской марли) проводили перйодатом натрия, в результате чего получали диальдегидцеллюлозу (ДАЦ) требуемой степени модификации вторичных спиртовых групп [3,4]. Количество альдегидных групп на носителях определяли аналогично [3,4] окислением последних раствором йода в слабощелочной среде (0,1Н. раствор Na2B4O7), либо с помощью 3,5-динитросалициловой кислотой [5] и выражали в мМ/г с учетом влажности носителя [3].
Результаты и их обсуждение Важнейшим условием получения высокоактивных препаратов иммобилизованных ферментов, является участие в образовании ковалентных связей с носителем тех функциональных групп белка, которые не являются ответственными за его биологические свойства, иными словами, не входят в состав активного центра фермента и не располагаются в непосредственной близости от него [3]. Связывание молекул белка с полиионами (Хт или полисахариды) происходит благодаря электростатическому взаимодействию, которому может способствовать образование водородных связей и гидрофобных контактов. Чаще всего диальдегидполисахариды применяют для присоединения веществ, имеющих в своей структуре первичную аминогруппу, включая белки или физиологически активные пептиды. Результатом взаимодействия являются белково-полисахаридные конъюгаты, в которых белковые молекулы связаны с полисахаридом ковалентной связью. Прочность связывания белка с полисахаридом определяется гидролитической стабильностью связей и сильно разнится от
Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 8
легкогидролизуемои альдиминовои до практически не гидролизуемой в условиях организма вторичной аминной. Тип образовавшейся связи зависит как от условий получения диальдегидполисахарида, так и от условий формирования конъюгата, и до настоящего времени является предметом острых дискуссий. Знание природы и реакционной способности окисленных звеньев диальдегидполисахаридов, полученных различными способами, чрезвычайно важно. Непрореагировавшие с белком звенья также входят в состав белково-полисахаридного конъюгата. Они неотделимы от последнего, и потому звенья могут оказаться в крови вместе с полимерным лекарством. Альдегидные группы остаются частью полимера-носителя и при этом сохраняют свою реакционную способность. Таким образом, полимерное лекарство в целом оказывается реакционноспособным полимером, которое может связываться с белками крови, токсинами и др. веществами [6]. р1 протеиназ ПК ниже 3 [3], что может свидетельствовать о большом количестве внешних карбоксильных групп, которые могут образовывать и интерполиэлектролитные комплексы с Хт. При модификации Хт целлюлозой, не все активные группы Ц будут заняты Хт (вследствие стерических затруднений - размер ассоциатов Хт
может более 250 нм), а в процессе иммобилизации ПК на хитозансодержащие целлюлозные носители свободные активные группы могут быть заняты (ферментами) белками ПК (размер до 10нм). Как было показано [4,9] при взаимодействии полисахаридальдегидов даже с небольшими (по размеру) аминосодержащими веществами реагирует не более 70% амина. В работе [7] приведены возможные схемы взаимодействия аминогрупп белков и целлюлозы, аналогично на наш взгляд могут взаимодействовать с целлюлозой (или ее производными) не только аминогруппы белков (ферментов) входящих в состав ПК, но также и аминогруппы Хт (Рис.1). В работе [8] приведены возможные схемы образования различных коньюгатов гидрогелей Хт как внутри себя самого, так и с различными субстанциями. В литературе [4,6,9] показано что, как в твердом виде, так и в растворах водных и неводных сред окисленные звенья диальдегидсахаридов существуют в виде циклических полуацеталей (Рис. 2 схемы В,С,Б). Независимо от степени окисления
диальдегидпроизводные относительно устойчивы в нейтральных водных растворах.
I® О
Scheme 3.
Рис. 1. Схемы возможного взаимодействия амино групп Хт (или белковой молекулы) - и альдегидных групп Ц scheme 1; - и карбоксильных групп Ц scheme 2; - и спиртовых групп Ц scheme 3 (вместо Ц может быть и ДАЦ)
CHjOH
CH2OH -O.
OH
B
C
D
Рис. 2. Схемы окисления Ц перйодат ионом и возможного образование ацеталей в окисленной целлюлозе
В Хт присутствуют функциональные группы, такие как: -ОН; -КЫСОСИз; -NN2. Для того чтобы белки взаимодействовали с Хт, их pI должна быть ниже pKa Хт, чтобы их заряды были бы противоположными. Значения pKa Хт , которые
встречаются в литературе, варьируют от 6,2 до 7,0. Это зависит от Хт и условий измерения. Белки являются заряженными молекулами, поэтому их взаимодействие (адсорбция, образование
ковалентных или нековалентных коньюгатов) с
n
Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 8
молекулой Хт, Ц, ДАЦ будет зависеть по-видимому от их заряда. Адсорбция - это процесс, в котором принимают участие ионные взаимодействия, водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия. Многие данные говорят о том, что максимум адсорбции белка в водной среде незаряженным полисахаридом происходит при рН раствора близком к изоэлектрической точке белка. Ковалентная связь между белком и полисахаридом является специфическим, сильным и устойчивым
взаимодействием. Ковалентная связь между двумя биополимерами имеет целью образование стабильного коньюгата, который сочетает свойства гидрофобного белкового компонента и гидрофильного полисахарида. Нековалентные взаимодействия проявляются как сумма множественных взаимодействий между группами биополимеров. Эти взаимодействия могут быть
ионными, биполярными, силами Ван-дер-Ваальса, водородными мостиками или гидрофобными. Результатом может быть слабая связь (обратимая) или сильная (слабо обратимая). Это зависит от условий водной среды. Условиями для образования комплексов являются следующие: значение рН, вид полимера, концентрация полимера, температура, время реакции и ионная сила. Когда белок реагирует с противоположно заряженным полиэлектролитом с образованием полиэлектролитного комплекса, происходит структурное изменение: дестабилизация или стабилизация [10].
Приведенные схемы позволяют объяснить двухфазный механизм инактивации
иммобилизованных препаратов ПК на модифицированные Хт содержащие целлюлозные носители после иммобилизации, хранении или в процессе эксплуатации [3].
Досадина Элина Эльдаровна, студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Белов Алексей Алексеевич д.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Чернова В.В. Деструкция хитозана под действием некоторых ферментных препаратов медицинского назначения // дисс. на соиск. уч. ст. к.х.н.Уфа, 2011, С. 129.
2. Перминов П.А. Закономерности взаимодействия хитозана с глутаровым альдегидом и их использование при получении ферментсодержащих полимерных материалов //автореф. дисс. на соиск. уч. ст. к.х.н., М., 2007. -С.16.
3. Белов, А.А. Текстильные материалы, содержащие иммобилизованные гидролазы для медицинских и косметологических целей. Получение. Свойства. Применение / А.А. Белов.- LAP LAMBERT: Acad. Pub., GmbH &Co. KG, Germany, 2012.- 242 c.
4. Роговин З.А. Химия целлюлозы. - М.:Химия, 1972. - С.125-244.
5. Досадина Э.Э., Белов А.А. Получение хитозансодержащих носителей на основе модифицированной целлюлозы для медицинских целей //Успехи в химии и хим. технологии. 2014. Т. XXVIII. № 5. с.15-17.
6. Гумникова В. И. Синтез диальдегиддекстрана и диальдегидкарбоксиметилцеллюлозы и их химические
превращения// дисс... на соиск. уч. ст. канд. хим. наук, РХТУ 2014, с.137.
7. Kotel'nikova N.E., Mikhailova S.A., Vlasova E.N. Immobilization of proteolytic enzymes trypsin and a-
chymotrypsin to cellulose matrix // Russ. J. Appl. Chem., 2007, V. 80., #2, P.322-329.
8. Bergera J., Reista M., Mayera J.M. et al. Structure and interactions in covalently and ionically crosslinked
chitosan hydrogels for biomedical applications //Europ. J. of Pharm. and Biopharmaceutics, 2004, V. 57, P.19-34.
9. Суворова О.Б., Иозеп А.А., Пассет Б.В. Исследование реакционной способности полисахаридов в
реакции с N-нуклеофилами// ЖПХ, 2001,Т.74.Вып.6,С. 988-992.
10. Хитин и хитозан: Природа, получение и применение. Материалы проекта CYTED IV. 14: «Хитин и хитозан из отходов переработки ракообразных» Под ред. M.Sc. Ana Pastor de Abram (Перу), РХО, Щелково, 2010, с.292.
DosadinaElinaEl'darovna, BelovAlexey Alexeevich*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: ABelov2004@ yandex.ru
POSSIBLE INTERACTION BETWEEN CHITOSAN, CELLULOSE CARRIERS AND PROTEINS OF PROTEASE COMPLEX FROM HEPATOPANCREAS OF CRAB.
Abstract
The interaction between chitosan solutions and different cellulose carriers or protease complex from hepatopancreas of crab was studied. The schemes and possible mechanisms of chitosan gel, cellulose carriers and protease complex from hepatopancreas of crab were purposed. It was stated that chitosan could stabilize not only protease complex but the dialdehyde cellulose as well.
Key words: chitosan, cellulose, dialdehyde cellulose, protease complex from hepatopancreas of crab.
