CC BY
35
УДК 577.15.08+606.61
М.А. Кульметьева, А.И.Коротаева, А.А.Белов
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1 E-mail: ABelov2004@ yandex.ru
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА НА ХИТОЗАНСОДЕРЖАЩИЕ ЦЕЛЛЮЛОЗНЫЕ НОСИТЕЛИ В ПРИСУТСТВИИ ГЛИЦЕРИНА
Изучена кинетика взаимодействия диальдегидцеллюлозы и хитозана с раствором протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба (ПК) в жидкой среде. Установлено, что основное взаимодействие ферментов ПК с изученными полисахаридными носителями происходит в течение 1 часа. Хитозан стабилизирует (9<1) ПК при высушивании и хранении, а использованные модифицированные полисахаридные носители дестабилизируют (6>1).
Ключевые слова: протеиназы, глицерин, иммобилизация, хранение.
На сегодняшний день полимерные соединения используются в различных областях медицины [1,2]. Широкое применение находят полимеры для создания современных лекарственных средств и транспортных систем. Несмотря на все достижения в современной медицине, терапевтическая эффективность многих лекарственных препаратов при различных заболеваниях остается не очень высокой. Благодаря развитию медицинских технологий представляется возможным получать различными методами лекарственные формы
пролонгированного действия на основе полимерных носителей с контролируемым высвобождением активной субстанции. Для получения препаратов пролонгированного действия используются различные методы. Однако все они имеют те или иные недостатки, поэтому требуют дальнейшего изучения и усовершенствования. Применение лекарственных форм на основе полимеров дает возможность значительно повысить биодоступность и минимизировать побочные эффекты данных лекарственных препаратов [2].
Важной предпосылкой к интенсивному развитию лекарственной энзимологии явилось решение теоретических и технологических вопросов модификации ферментов с приданием им новых свойств, причем именно таких, которые имеют кардинальное значение для терапии заболеваний человека [1]. Хитозан (Хт) обладает свойствами, благоприятными для введения его в иммобилизованную систему «перевязочный материал - фермент», а именно, биосовместимостью, биодеструкцией,
нетоксичностью, гидрофильностью, высокой адгезионной способностью и т. д. На основе окисленной целлюлозы, Хт и ферментов из гепатопанкреаса краба (ПК) для лечения гнойно-
некротических ран различной этиологии, выпускается перевязочное средство -«Мультиферм» [1], однако как его биохимические свойства, так и свойства составляющих его компонентов (Хт-ПК) изучены недостаточно. Одна из проблем хитозансодержащих текстильных аппликаций - «ороговение», особенно краев салфетки, связанное со структурными изменениями Хт в процессе иммобилизации, стерилизации (гамма-облучение в дозе 25 кГрей) и хранения [3]. Добавки глицерина в Хт, как следует из литературных данных [4], позволяют получить не только более «мягкие носители», но возможно более стабильные ферментнсодержащие препараты.
В данной работе было исследовано изменение ферментативной активности (ФА) в процессе иммобилизации, высушивании и хранении протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба (ПК) на различные носители: хитозановые гели (Хт), целлюлозу (Ц), диальдегидцеллюлозу (ДАЦ), Ц-Хт и ДАЦ-Хт. На рисунке 1 приведены схемы получение иммобилизованных (стабилизированных)
препаратов. Ферментативную активность иммобилизованных препаратов определяли как описано в [1], в 1/15М фосфатном буферном растворе (1/15М ФБ) рН-8,0, используя в качестве субстрата азоколл. Полученные данные приведены на рис.2.
Было изучено взаимодействие Хт и ПК, в присутствии и без Гл. Высохшие пленки Хт (100 мкл раствора 0,5% масс. Хт было высушено на воздухе на полиэтиленовой подложке) вне зависимости от сроков хранения пленок (5 дней либо 9 месяцев) не снижается ФА ПК (время взаимодействия раствора ПК с пленкой Хт либо15 мин., либо 2 часа). При взаимодействии ПК с Хт гелем, происходит падение ФА ПК, остается 60-
70% первоначальной ФА ПК, причем наличие в Хт иммобилизованного ПК. Что связано со
5% масс Гл не приводит к большему падению ФА взаимодействием амино групп Хт с молекулами Гл
ПК. с образованием различных аддуктов [4].
Наличие Гл в носителе для иммобилизации (ДАЦ-Хт), снижает количество
A - Иммобилизация на активированный носитель
Pol—+ NH2-E -»►Pol—C:
SN-E
H
+
H2O
альдегидсодержащий полимер белок Иммобилизованный препарат
В - Образование хитозансодержащего геля.
Хт ПК Хт-белок
С - Иммобилизация ПК на хитозан содержащий целлюлозный носитель.
1 1
О +
Целлюлозный носитель Хт ПК Иммобилизованный препарат
Рис. 1. Получение иммобилизованных (стабилизированных) препаратов
А/Ао
ДАЦ-Хт-ПК ПК
ПК-Хт(5%Гл)
Время, мес
ДАЦ-Хт(Гл)-ПК ПК-Хт
Рис. 2. Влияние высушивания и сроков хранения на ферментативную активность хитозансодержащих
производных ПК
Наибольшие потери ФА ферментов ПК после иммобилизации, вызывают Ц и ДАЦ. Это может быть связано как с попаданием фермента в поры носителя, так и взаимодействием альдегидных групп модифицированного полимера с белковой глобулой. Высушивание ПК на
полиэтиленовой подложке на воздухе, не ведет к значительному изменению ФА (потери ФА не более 10-15%). Кинетика инактивации иммобилизованных ферментов, в процессе хранения, описывается характерной для гидролаз сложной экспоненциальной (Ат/Ао=а1*е-к1т + а2*е-
к2т) зависимостью. В полулогарифмических координатах установленные зависимости имеют вид ломаной линии, каждая из которых описывается уравнением первого порядка. Двухфазная кинетика инактивации
иммобилизованных форм протеиназ - факт известный в литературе. Кинетические закономерности такого рода могут быть объяснены общим механизмом инактивации, включающим существование двух форм
фермента, различающихся активностью и устойчивостью к денатурирующим воздействиям [1]. Увеличение температуры хранения с 5 до 37°С увеличивает эффективные константы скорости инактивации иммобилизованных образцов. Гл не оказывает стабилизирующего действия на ферментативную активность иммобилизованного ПК при хранении при повышенной температуре.
Кульметьева Маргарита Анатольевна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Коротаева Алина Игоревна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Белов Алексей Алексеевич д.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Белов А. А. Текстильные материалы, содержащие иммобилизованные гидролазы для медицинских и косметологических целей. Получение. Свойства. Применение. //LAP LAMBERT Acad. Pub., GmbH &Co. KG, Germany, 2012 г.- 242 c.
2. Медвецкий А. И., Компанцев В. А., Щербакова Л. И., Маркова О. М. Полимерные соединения: методы получения и характеристики основных типов транспортных систем на их основе // Совр. проблемы науки и образования, 2013, №3.- С.1-8.
3. Нудьга Л.А., Петрова В.А., Гофман И.В. и др. Химические и структурные превращения в хитозановых пленках в процессе хранения //ЖПХ, 2008,т.81.-, вып. 11.- С. 1877-1881.
4. Quijada-Garrido, V. Iglesias-Gonzarlez, J.M. Mazorn-Arechederra, J.M. Barrales-Rienda The role played by the interactions of small molecules with chitosan and their transition emperatures. Glass-forming liquids:1,2,3-Propantriol (glycerol) // Carbohydrate Polymers.-2007.-v. 68.- Р.173-186.
KulmetievaMargarita Anatolievna, Korotaeva AlinaIgorevna, Belov Alexey Alexeevich*
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: ABelov2004@ yandex.ru
IMMOBILIZATION OF PROTEOLYTIC COMPLEX OF CRAB HEPATOPANCREAS ON HITOZANCONTAINS CELLULOSE CARRIERS IN THE PRESENCE OF GLYCEROL
Abstract
The kinetics of the interaction dialdehydecellulose and chitosan solution with proteolytic complex of crab hepatopancreas (PC) in a liquid medium . It has been established that the primary interaction with the enzymes studied PC polysaccharide carriers occurs within 1 hour. Chitosan stabilizes (0 < 1) PC on drying and storage, and use a modified polysaccharide carriers destabilize (0 > 1).
Key words: chitosan, dialdehydecellulose, immobilization, glycerol, storage
