CC BY
30
УДК 577.15.08+606.61
*
М.А. Кульметьева, Э.Э. Досадина, Т.А. Данилова, Д.А.Быданов, А.А.Белов
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1 * е-таИ.АВе1оу2004@ yandex.ru
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ (ФЕРМЕНТОВ) ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА С РАСТВОРОМ ХИТОЗАНА
Изучено влияние раствора хитозана (Хт) различной концентрации на ферментативную активность протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба (ПК). Показана разнонаправленность действия на ферментативную активность растворов хитозана в зависимости от соотношения Хт:ПК. Установлена стабилизация хитозаном ферментов протеолитического комплекса гепатопанкреаса краба при термоинактивации при повышенных температурах.
Ключевые слова: хитозан, протеиназы, структурные единицы, ферментативная активность, стабилизация.
Хитозан (Хт) это уникальный биополимер обладающий разнообразными биологическими свойствами [1-4]. Хитозан обладает высокой биологической активностью при отсутствии токсичности, биосовместимостью и
биодеградируемостью. Особое внимание исследователей привлекает способность Хт образовывать с другими полиэлектролитами (в том числе и с белками) различные комплексы. На процесс комплексообразования Хт с белками большое влияние оказывает конформация как макромолекул Хт так и белка, молекулярный вес биомолекул, степень полидисперсности, степень деацилирования Хт, значение констант диссоциации, распределение функциональных групп вдоль полимерной цепи [1]. Как следует из литературы молекулярные массы
коллагенолитических ферментов ракообразных значительно меньше, чем у коллагеназ позвоночных и микроорганизмов [5]. По данным электрофореза они колеблются в пределах 23-30 кДа, для них не отмечалось присутствия углеводной части. Существенным признаком, объединяющим молекулярные свойства этих ферментов, служит их необычайно низкая изоэлектрическая точка, обычно приводятся величины ниже 3,5 [6,7]. Вследствие чего взаимодействие белков ПК с молекулой Хт происходит очень быстро. Наличие в ПК разнообразных по специфичности ферментов может частично деполимеризовать молекулу Хт [8]. Неспецифическая частичная деполимеризация происходит в течении первых 30 минут.
Было исследовано изменение ферментативных активностей (ФА) ПК при взаимодействии с растворами Хт. ФА определяли либо по гидролизу азоколлла, либо раствора казеина, либо по синтетическому субстрату паранитроанилид N бензоил-Б,Ь-аргинина (БАрКА) или БосА1аОКр аналогично [9] в 1/15М фосфатном буферном растворе (1/15М ФБ) рН-8,0, в случае с БосА1аОКр рН-6,2. В работе использовали - протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба (ПК)(ТУ 9281-
004-11734126-00, НПО "Биопрогресс" МО г. Щелково, Россия), хитозан (Хт) производства НПО "Биопрогресс" (ТУ 9289-067-00472124-03, г. Щелково, МО, РФ) (влажность препарата 10%, степень деацилирования 80,0%; кинематическая вязкость не менее 383,7 сСт; молекулярная масса 478 кДа). Все остальные реактивы, если не оговорено особо, отечественного производства, квалификации не ниже "ХЧ".
Взаимодействие ПК с раствором Хт проводили следующим образом: либо сливали равные объемы ПК и раствора Хт; либо к раствору Хт добавляли сухой фермент. После полного растворения фермента определяли ферментативную активность. За 100% принимали активность фермента в отсутствии Хт. В специально проведенных опытах было установлено, что условия получения комплекса Хт-ПК не влияет на остаточную ФА, а все определяется конечным соотношением ПК:Хт. ФА в образцах определяли через 30 минут после получения. На рис.1 и 2 приведены полученные нами данные о влияние Хт на остаточную ФА ферментов ПК в зависимости от соотношения ПК:Хт. На рис.3 приведены данные о действии на ФА ферментов ПК структурных единиц Хт.
УФ-Вид измерения выполнялись с помощью регистрирующего спектрофотометра фирмы Shimadzu UV-2600 (Япония). Zeta potential and the average particles diameter were measured on a Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, UK.
Хитозан является практически единственным поликатионом природного происхождения,
полиэлектролитные свойства которого обусловлены наличием протонированных аминогрупп в кислых средах. Наличие функционально-активных групп в макромолекуле хитозана и растворимость в воде обеспечивают его способность к
комплексообразованию с противоположно заряженными синтетическими и природными полиэлектролитами, ПАВ, металлами [10].
Рис.1. УФ-спектр растворов ПК (1 мг/мл), Хт (5мг/мл), Хт-ПК (5:1)
мг структурной единицы
Рис.2. Влияние структурных единиц Хт на ФА растворов ПК (субстрат казеин)
ПК:ХТ, мг:мг
Рис.3. Изменение ФА растворов ПК при до б авлен ии Хт (суб с трат казеин)
Показано [11], что в разбавленных водных растворах хитозан и его производные образуют межмолекулярные агрегаты, которые сосуществуют в динамическом равновесии с одиночными цепями. Хитозан ведет себя как ассоциирующий полиэлектролит: самопроизвольно формирует агрегаты макромолекул, размеры которых
Таблица 1. Средние гидродинамические диаметры (ф и дзетта потенциал (£) Хт, ПК и ПК-Хт
Обращец Параметры
ё, нм С мВ
ПК в 0,1М №С1 789,0(84,1%) 33,1(10,5%) 5,2 (5,4%) -12,0
0,5 % Хитозан 5237(2,7%) 1449(97,3%) +48,9
ПК-Хитозан (1:50) 4386 (100%) +63,5
ПК-Хитозан (1:5) 1635 (100%) +60,2
ПК-Хитозан (50:1) 138,8 (57,4%) 330,0 (42,6%) -24,0
определяются конкуренцией притяжения
ассоциирующих групп, вызывающих агрегацию, и отталкивания из-за наличия заряженных звеньев и противоионов, препятствующего агрегации. Показано, что основные закономерности процесса агрегации определяются содержанием звеньев N ацетил-Б-глюкозамина, влиянием присутствия солей и рН, длиной основной цепи хитозана, а так же то, что независимо от наличия гидрофобных заместителей в растворе всегда присутствуют два типа частиц: одиночные макромолекулы и агрегаты (таб.1). Таким образом размер агрегатов хитозана и ГМ хитозана не зависит от молекулярной массы полимера, а агрегационное число растет с уменьшением длины полимерной цепи, при этом агрегаты представляют собой наногели с более плотным ядром и разреженной оболочкой. В то же время было отмечено, что доля агрегированных макромолекул хитозана в растворе хлорида натрия существенно выше, чем в растворе ацетата натрия. Это может быть связано с более высокой склонностью хлорида хитозана к кристаллизации, что дополнительно способствует агрегации макромолекул. По данным работы[12] критическая концентрация Хт в воде составляет 1,35мг/мл.
Следует обратить внимание на поведение ПК при увеличении концентрации Хт выше 1:30. Что может быть связано на наш взгляд не только с влиянием Хт на ПК, но и на раствор казеина, при увеличении концентрации Хт большое количество амино групп остаются свободными (не заняты ферментами ПК) и могут взаимодействовать с казеином увеличивая доступность гидролизуемых связей.
Данная работа является частью систематических исследований, проводимых на кафедре биотехнологии РХТУ им. Д.И.Менделеева, по изучению взаимодействия белков (ферментов) с различными полисахаридами для последующего их использования в создании новых препаратов для ранозаживления.
Кульметьева Маргарита Анатольевна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Досадина Элина Эльдаровна, студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия,
Данилова Татьяна Александровна, студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия,
Быданов Дмитрий Александрович, аспирант кафедры наноматериалов и нанотехнологий РХТУ им. Д.И. Менделеева, Россия,
Белов Алексей Алексеевич д.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Краюхина М.А., Самойлова Н.А., Ямсков И.А. Полиэлектролитные комплексы хитозана:формирование, свойства и применение//Успехи Химии. 2008, т.77, вып.9, с.854-869.
2. Воронько Н.Г., Деркач С.Р., Соколан Н.И. Взаимодействие желатины с хитозаном: влияние концентрации полисахарида // Вестник МГТУ, 2015 г. том 18, № 1, стр. 80-89.
3. Краюхина Мария Александровна Полиэлектролитные комплексы хитозана с сополимерами малеиновой кислоты: автореф. дисс.. на соиск. уч. ст. канд хим наук, М. 2010, С.27.
4. Зубарева А.А. Разработка системы доставки биологически активных веществ на основе наночастиц хитозана и его производных: авторефер. дис. ... канд хим. наук
5. Литвин Ф.Е. Коллагенолитические протеазы из гепатопанкреаса камчатского краба; выделение и свойства // Дисс. ... канд. биол. наук. М., 1993.- 136 с.
6. Rudenskaya G.N., Bioorganic Chemistry (in Russian), 2003,29(2):117
7. Rudenskaya G.N., Isaev V.A., Shmoylov A.M. [et al.], App.Biochem.Biotech., 2000, 22: 175
8. Е.И. Кулиш, В.П. Володина, В.В. Чернова и др. Ферментативная деструкция хитозана//Пластические массы, N5, 2008,с32-38.
9. Belov A.A. Textile materials containing immobilized hydrolases for medical and cosmetic purposes. Production. Properties. Application. //LAP LAMBERT Acad. Pub., GmbH &Co. KG, Germany. - 2012. - P. 242;
10. Шилова С.В. Комплексы синтетических и природных катионных полиэлектролитов с анионными поверхносно-активными веществами в водно-спиртовых средах:формирование и свойства//дисс... на соиск уч. степени дхн, Казань, 2015, стр. 80,138,139.
11. Корчагина Е.В. Агрегация хитозана и его производных в разбавленных водных растворах //автореф. дисс. на соиск. уч. степ. канд. физ-мат наук, М., 2012, с22.
12. С. В. Шилова, О. А. Зинурова, Р. Р. Хусаинова и др. Исследование ассоциации хитозана в водно-бутанольных средах методом зондовой флуоресцентной спектроскопии//Вестник Казанс. технол. ун-та 2013, Вып. №11,том 16, с.85-87.
Kulmetieva Margarita Anatolievna, Dosadina Elina Eldarovna, Danilova Tatyana Alexandrovna, Bidanov Dmitry Alexandrovich, Belov Alexey Alexeevich.
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: ABelov2004@ yandex.ru
THE INTERACTION BETWEEN PROTEINS (ENZYMES) OF PROTEOLYTIC COMPLEX FROM HEPATOPANCREAS OF CRAB WITH CHITOSAN SOLUTION
Abstract
In this research we studied the effect of different concentration of chitosan solution on enzymatic activity of proteolytic complex from hepatopancreas of crab (PC). We showed a diversity of affection of chitosan solution on enzymatic activity depending on the ratio Chitosan:PC. We state that chitosan stabilizes enzymes of proteolytic complex from hepatopancreas of crab in the process of thermoinactivation at increased temperature.
Key words: chitosan, proteases, structural units, enzymatic activity, stabilization.
