CC BY
100
2001
Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра
Том 129
Е.П.Калчугина, С.В.Леваньков, Н.М.Купина
ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛИКОГЕНА В ГЕПАТОПАНКРЕАСЕ КАМЧАТСКОГО КРАБА В РЕЗУЛЬТАТЕ АВТОЛИТИЧЕСКИХ ПОЦЕССОВ
Объемы отходов краба в виде гепатопанкреаса составляют до 30 % всех отходов производства пищевой продукции из краба (Купина, Леваньков, 1998). Гепатопанкреас камчатского краба на сегодняшний день используется менее чем на 1 %. Главным направлением использования является переработка с целью получения комплексного препарата проте-иназ (Купина, Герасимова, 1991), коллагеназ (Сахаров и др., 1988), эласта-зы (Джунковская, Захарова, 1991). Между тем гепатопанкреас является источником ценных веществ и может служить сырьем для производства полиферментных препаратов комплексного действия, а также липидов и гликогена (Леваньков и др., 2000).
В организме ракообразных метаболизм гликогена, где он, как и в организме других животных и человека, является резервным полисахаридом, ассоциируется с биосинтезом хитина (Renaud, 1949; Passano, 1960). Кроме того, по мнению Рено (Renaud, 1949), гликоген и жирные кислоты
- основа всего энергетического обмена в организме ракообразных. И хотя в дальнейшем это утверждение неоднократно подвергалось критике (Scheer, Scheer, 1951; Scheer et al., 1952, Neiland, Scheer, 1953), оно нашло подтверждение в более поздних работах (Lipke et al. , 1965).
Расщепление гликогена в тканях происходит в основном под действием ферментов, специфически гидролизующих 1,4- (а-глюканфосфо-рилаза и а-амилаза) и 1,6-гликозидные связи (амило-1,6-глюкозидаза). Однако вопрос о взаимосвязи процессов пищеварения, активности про-теолитических ферментов и процессов синтеза и расщепления гликогена во многом остается открытым в настоящее время, хотя попытки связать процессы протеолиза и гликогенолиза предпринимались (Vonk, 1960).
В данной работе нами поставлена задача изучить динамику изменения содержания и состава гликогена гепатопанкреаса камчатского краба в процессах морозильного хранения и автолитической деструкции, установить взаимосвязь процессов автолиза и гликогенолиза.
В качестве объекта исследования использовали гепатопанкреас камчатского краба (Paralithodes camtschatica), выловленного в Охотском море. Для сравнительной оценки содержания гликогена в тканях гидро-бионтов исследовали и другие промысловые объекты (табл. 1).
Гепатопанкреас отделяли от карапакса и немедленно замораживали в эмалированных противнях при толщине слоя 3-5 см при температуре минус 30 оС. Образцы доставляли в лабораторию в течение 1-2 мес и хранили при температуре минус 18 оС.
203
Таблица 1
Содержание гликогена в тканях гидробионтов, %
Table 1
Glycogen contents in issue of sea objects, %
Объект Сухое обезжиренное вещество Литературные данные (Кизиветтер, 1973)
Горбуша 1,34 1,0-3,4
Сельдь 1,68 1,4-3,3
Камбала 0,63 0,49
Треска 2,13 1,4-3,8
Минтай 2,56 1,4-3,8
Навага 3,60 1,4-3,8
Креветка 10,9 -
Краб камчатский 6,37
Мясо конечностей 2,20
Мясо абдомена 4,64
Краб синий 1,4-2,2 0,3-2,0
Краб-стригун 1,3-1,8 0,9-1,2
Осьминог 2,41 3,5-6,8
Гребешок 10,3 11,7
Корбикула 12,1 -
Печень
краба камчатского 29,4 30,4-33,6
лосося 5,8 5-13
сельди 10,2 5-13
Автолизат гепатопанкреаса получали методом МакВайнни и О’Коннора (McWhinnie, O’Connor, 1967).
Гепатопанкреас гомогенизировали при температуре около 0 °С с добавкой нитрата ртути (концентрации не менее 2,5 мМ) или нитрата серебра (концентрации 10,0 мМ). Полученный гомогенизат сепарировали, доочищали от остатков липидов центрифугированием и сублимировали. Из обезвоженного препарата экстрагировали остатки липидов охлажденным до минус 2-4 оС ацетоном. Полученный после сушки в вакууме 2-5 мм.рт.ст. порошкообразный продукт, не обладающий проте-олитической активностью, использовали для извлечения гликогена.
Для получения обезвоженного, обезжиренного препарата, содержащего неактивированные протеолитические и коллагенолитические ферменты, гепатопанкреас сублимировали, полученную массу обрабатывали трижды охлажденным до минус 2-4 оС ацетоном и сушили в вакууме 2-5 мм.рт.ст. Полученный порошкообразный продукт использовали для экспериментов по дробному осаждению и растворению гликогена.
Растворы белковых гидролизатов анализировали методом FPLC® (Fast Protein Liquid Chromatography®) на приборе LCS-500 plus , используя колонки стандарта HR 10/30 (Superdex-75 и Superdex-200) и стандарта ХК 16/70 и XK 26/70 (Sephacryl-300 и Sephacryl-400) с использованием детектора UV M -2 при длинах волн 280 (основная), 254 и 214 нм (дополнительные). Математический обсчет хроматограмм проводили с помощью базовой программы FPLC-Director® для РС (Приборы и программное обеспечение фирмы Pharmacia Biotech АВ, Швеция). Для определения молекулярных масс белков и полипептидов использовали калибровочную кривую зависимости времени элюции стандартных белков от величин их молекулярных масс в логарифмическом варианте. Для построения калибровочной прямой использовали следующие набо-
204
ры стандартных белков: тироглобулин (молекулярная масса - 669 кДа), ферритин (440), каталаза (232), лактатдегидрогеназа (140), фосфорилаза (94), альбумин (67), овальбумин (43), карбоангидраза (30), соевый ингибитор трипсина (20,1), миоглобин (16,8), лактальбумин (14,4), цитохром С (12,4). Элюирование проводили 50-75 мМ нейтральным фосфатным буфером с добавкой 0,15 М хлористого натрия при скорости потока 0,5 мл/мин для фаз Superdex-75, Superdex-200 и 0,25 мл/мин - для фаз Sephacryl-300 и Sephacryl-400.
Для определения молекулярных масс гликогена использовали гель-фильтрацию методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в варианте последовательно включенных колонок Shodex Asahipak GS-520 и GS-620 на приборе Shimadzu GC-14B (Япония). Для определения молекулярных масс использовали калибровочную прямую, построенную для стандартных декстранов с молекулярными массами 5, 10, 20, 40, 100, 250, 500 и 2000 кДа.
Протеолитически активные фракции получали хроматографированием разбавленных растворов автолизата методами гельфильтрации на колонках Superdex-200 и Superdex-75 типа HR 10/30 и ионообменной хроматографии на колонках DEAE-Sepharose-6CL типа С5/10 фирмы Pharmacia Biotech AB (Швеция) в градиентных условиях элюирования. Автолизат печени камчатского краба дополнительно обезжиривали и осветляли центрифугированием при 8000 g. Супернатант наносили на колонку Superdex-200 HR 10/30 в количестве 0,5 мл и элюировали 50 мМ фосфатным буфером с добавкой 0,15 М хлористого натрия, рН 7,4, со скоростью 0,5 мл/мин. Ф ракцию, содержащую белки и пептиды с молекулярным весом 15-30 кДа, собирали, концентрировали в два раза диализом против насыщенного раствора полиэтиленг-ликоля (молекулярная масса - 20000). Концентрат наносили на колонку Superdex-75 HR 10/30. Фракционировали белки в вышеуказанном буфере со скоростью 0,35 мл/мин. Фракцию, содержащую белки и пептиды с молекулярной массой 20-27 кДа, собирали, концентрировали в два раза диализом против насыщенного раствора полиэтиленгли-коля. Концентрат диализовали против двадцатикратного объема 20 мМ пирофосфатного буфера, рН 7,5, после чего наносили на колонку С5/10 с DEAE-Sepharose-6CL. Фракционирование белков вели пирофосфат-ным буфером в градиенте хлористого натрия 0-1 М со скоростью
2,5 мл/мин. Фракции, обладающие протеолитической и коллагеноли-тической активностью, объединяли.
Гликоген экстрагировали водой, буферными растворами или растворами трихлоруксусной кислоты, осаждали этиловым спиртом (Асатиани, 1956) и гидролизовали серной кислотой до глюкозы. Содержание гликогена определяли фотометрически методом Джангриса (Jungreis, 1968) по поглощению при 620 нм продукта реакции глюкозы с антроном на ФЭК-56М (Россия), используя калибровочный график, построенный для стандартных растворов глюкозы (концентрация 0,1-10,0 мг/мл).
Исследования и литературные данные свидетельствуют о том, что основные промысловые гидробионты весьма различаются по содержанию гликогена в тканях (табл. 1). Основной причиной этого являются особенности питания и среды обитания биологического вида (Vonk, 1960). Использованный нами метод прямого определения гликогена в тканях позволил получить результаты, отличные от приводимых в литературе
205
(Кизеветтер, 1973), где доля этого полисахарида определялась по разнице от суммарного содержания остальных компонентов тканей. Гепатопанк-реас крабов является объектом с наиболее высоким содержанием гликогена. Доля этого полисахарида составляет около 30 % массы сухого обезжиренного вещества ткани.
В постмортальный период содержание гликогена в гепатопанкреа-се быстро уменьшается, в отличие от гликогена мышечной ткани, где он достаточно стабилен продолжительное время. Процесс деструкции гликогена протекает параллельно процессу автолитического расщепления тканей гепатопанкреаса и сопровождается высвобождением липидов и увеличением общей протеолитической активности ферментов. Содержание гликогена уменьшается не только по мере протекания автолиза, но и в результате морозильного хранения при температуре минус 1218 оС. Так, содержание гликогена в гепатопанкреасе краба после 24 мес хранения при температуре минус 10-12 оС такое же, как в автолизате, полученном из свежего сырья - 1,06-1,85 %.
Синтез и распад гликогена происходят при жизни животного непрерывно, и в печени всегда имеется определенное соотношение гликогена и свободной глюкозы. Нами определено, что оно составляет около 10: 1. Наиболее интенсивно распад гликогена происходит в процессе замораживания при предельно высокой температуре замораживания (минус 2-4 оС). При этом распадается до 30 % всего гликогена гепатопан-креаса, в тоже время при быстром замораживании при температуре не выше минус 40 оС уменьшение содержания гликогена практически не наблюдается. Изучение зависимости содержания гликогена от сроков хранения при различных температурах показало, что при низкотемпературном хранении (температура не выше минус 18 оС) сырье характеризуется относительно стабильным содержанием гликогена в течение 6 мес, после чего процесс активного ферментативного гидролиза гликогена становится заметным. После 24 мес хранения содержание гликогена снижается до 25-33 % от исходного при постоянном соотношении гликоген: глюкоза (10: 1). В условиях хранения при более высоких температурах процесс расщепления гликогена активируется значительно быстрее. При температуре хранения от минус 4 до минус 6 оС остаточное содержание гликогена не превышает 10-12 % от исходного после 6 мес хранения. При низких положительных температурах (4 оС и выше) процесс идет наиболее быстро и после 24 ч хранения приводит практически к полному расщеплению гликогена гепатопанкреаса (рис. 1, а). При этом независимо от исходного состояния объекта, продолжительности его хранения и содержания гликогена в нем динамика процесса гликогенолиза и характер зависимости степени деструкции гликогена от времени экспозиции одинаковы (рис. 1, а, б).
Исследования процесса деструкции гликогена в условиях автолиза тканей гепатопанкреаса показали непропорциональное изменение содержания гликогена и глюкозы в объекте, вследствие чего соотношение содержания гликогена и глюкозы не является постоянным. Если исходное содержание глюкозы приблизительно в 10 раз ниже количества гликогена, то при автолизе процессы деструкции гликогена и утилизации глюкозы протекают с разными скоростями. Но через 24 ч содержание гликогена и глюкозы в смеси становится максимальным и практически равным соотношению этих веществ в равновесном состоянии
206
(рис. 2). Изменение соотношения гликоген: глюкоза в процессе автолиза и его относительно стабильный показатель в процессе морозильного хранения, по-видимому, являются следствием особенностей кинетики процессов ферментативного расщепления гликогена и утилизации глюкозы. Вероятно, процесс протекает через ряд равновесных состояний, а собственно гидролиз является лимитирующей стадией по отношению к стадии утилизации глюкозы и достижения равновесия.
Время экспозиции, час
0 1 2 4 6 12 20 22 24
Время экспозиции, час
I I гликоген
Y/////////Ä сумма моно-, олиго- и полисахаридов
Рис. 1. Динамика содержания углеводов (1) и гликогена (2) при автолизе (4 °С) для свежего (а) и хранившегося 24 мес при минус 18 °С гепатопанкреаса камчатского краба (б)
Fig. 1. Dynamics of polysaccharides (1) and glycogen (2) contents during autolysis at 4 оС for fresh (a) and 24 month kept at - 18 оС (б) crab liver
В результате автолиза происходит увеличение общей протеолити-ческой активности (рис. 3). В период автолиза наблюдается практически линейный рост протеолитической активности, что связано с разрушением белково-липидных ассоциатов, высвобождением жиров и концентрированием белковых компонентов в водной фазе. В результате автолиза в течение 24 ч в водной фазе автолизата накапливаются белки и полипептиды с широким диапазоном молекулярных масс: от 660 кДа (сигнал с временем удерживания 16,61 мин, рис. 4, а) до олигомеров с
207
массой около 1 кДа (сигналы с временем удерживания 50-60 мин, рис. 4, б). В процессе экспозиции доля тяжелых белков уменьшается, а низкомолекулярных - возрастает. После 20 ч автолиза на хроматограмме смеси появляются сигналы, соответствующие свободным аминокислотам (сигнал с временем удерживания 74 мин, рис. 4, б), содержание которых может достигать 5-6 % от сухого остатка автолизата.
Рис. 2. Изменение соотношения содержания гликогена и глюкозы в процессе автолиза гепатопанкреаса краба при температуре 4 °С
Pic. 2. Changing glycogen and glucose ratio during autolysis of crab liver at 4 оС
0 5 10 15 20 25
Время автолиза, час
10 15 20
Время автолиза , час
Рис. 3. Изменение общей протеолитичес-кой активности автолизата гепа-топанкреаса краба в процессе автолиза при температуре 4 оС Pic. 3. Changing of total protease activity of crab liver’s auto-lyzate during autolysis at 4 оС
25
0
5
Таким образом, процессы распада гл]когена и увеличения общей протеолитической активности являются параллельными, противоположно направленными, а технологический выход гликогена прямо пропорционально зависит от степени деструкции белков и, следовательно, от концентрации и активности ферментов гепатопанкреаса. Протеазы гепато-панкреаса представлены группой белков с молекулярными массами 2028 кДа (Сахаров и др., 1988). По данным ВЭЖХ, основное количество
208
гликогена представлено полисахаридами с молекулярными массами от 350 кДа и более (табл. 2).
0 10 20 30 40 50 60
Время, мин
Рис. 4. Гельфильтрация белков гепато-панкреаса краба: а - после 1 ч инкубирования при 4 °С (колонка Superdex-200 HR 10/30); б - после 24 ч инкубирования при 4 оС (колонка Super-dex-75 HR 10/30) Pic. 4. Gelfiltration of crab liver’s proteins: а -after incubation during 1 h at 4 оС (Superdex-200 HR 10/30 column); б - after incubation during 24 h at 4 оС (Superdex-75 HR 10/30 column)
Время, мин
Таблица 2
Фракционный состав гликогена, полученного осаждением из раствора автолизата на различных стадиях автолиза гепатопанкреаса краба, (по данным ВЭЖХ)
Table 2
Fractional contents of glycogen received by means of precipitating from autolyzate solution at various stages of crab liver’s autolysis (results of HPLC analysis)
№ сигнала Время удерживания (Rf), мин Молекулярная масса, кДа Содержание, %*
1 6,236 > 2000 59-86
2 8,120 700 2-7
3 9,081 350 2-10
4 10,818 35 2-5
5 13,435 0,8 7-14
6 14,230 0,18** 0,9-1,1
* От общего количества полисахаридов. ** Глюкоза.
Для определения характера гликоген-белковых взаимодействий использовали метод дробного осаждения насыщенным раствором сульфата аммония и дробное растворение в растворе сульфата аммония компонентов сублимированного автолизата гепатопанкреаса краба.
На рис. 5 представлена зависимость протеолитической и коллаге-нолитической активностей осадков, полученных при различных степенях насыщения раствора сульфата аммония. Максимальная общая про-теолитическая активность соответствует фракции, осажденной при достижении степени насыщения 20-25 %, а коллагенолитическая активность остается стабильно высокой во фракциях, осажденных из растворов со степенью насыщения до 25 %.
22 27 32 37 42
Концентрация сульфата аммония
насыщения,%
Рис. 5. Дробное осаждение протеаз автолизата гепатопанкреаса краба насыщенным раствором сульфата аммония
Pic. 5. Fractional precipitating of crab liver’s proteases by sated solution of ammonium sulphate
Обе кривые имеют также второй максимум в области 41-43 % степени насыщения сульфата аммония. По-видимому, при дробном осаждении происходит фракционирование протеиназ и коллагеназ гепатопанкреаса, различающихся степенью сродства и способностью образовывать устойчивые хорошо растворимые ассоциаты с другими компонентами автолизата. Массовое соотношение фракций, характеризующихся максимальной активностью, составляет около 5 (25 % насыщения): 1(45 % насыщения). У становлено, что при степени насыщения 35-37 % осаждается не менее 70 % исходного количества гликогена. Белковый состав осадка представлен на 90 % тяжелыми пептидами с молекулярной массой не менее 100 кДа, а доля пептидов с молекулярными массами 20-30 кДа не превышает 2-4 %. В сравнении с активностью осажденных фракций автолизата максимальное осаждение гликогена соответствует минимальным значениям протеолитической и коллагенолити-ческой активностей осадков. Первой осаждается ферментативно активная фракция, а фракция высокомолекулярных белков осаждается более насыщенными растворами сульфата аммония. Растворимость последних выше, по-видимому, вследствие образования гликоген-белковых ассоциа-тов, что обеспечивает их большую стабильность в растворе (табл. 3).
210
211
Таблица 3
Экстракция гликогена гепатопанкреаса краба
Table 3
Glycogen extraction from crab liver
Условия экстракции Содержание гликогена, % Протеолитическая активность р-ра, ПЕ/г Молекулярно-массовое распределение гликогена по данным ВЭЖХ Выход
Экстрагент pH Т, °С Способ инактивации ферментов Раствор Осадок Rj, мин MB, кДа Доля, % МВ связанного белка, кДа %
Фталевокислый
буфер, 1: 1 4,01 20 - 34,57 58,71 290 27,6
Фосфатный
буфер 6,86 20 - 37,83 61,94 537 28,1
Боратный буфер 9,18 20 - 37,30 62,35 413 26,4
Вода, 1: 1 7,0 20 32,90 65,71 401 6,236 >2000 59-86 600; 400 21,3
7,0 70 90 °С 44,96 51,19 180 8,12 700 2-7 70; 35 37,4
1: 5 20 2 % ТХУ 78,98 19,64 - 9,081 350 2-10 - 48
1: 10 20 2 % ТХУ 97,3 1,11 - 10,818 35 2-5 - 61
1: 10 7,0 20 нё2+ 97,42 0,86 0,216 13,435 0,8 7-14 - 74
1: 10 7,0 20 Ае+ 96,92 0,94 1,58 14,230 0,18 0,9-2,0 - 72
Т рихлоруксусная к-та, 4 %-ный р-р,
1: 1 20 - 57,6 42,1 - 58
1: 5 20 - 87,85 12,09 - 71
Раствор (ЫН4)2Б04
концентрация 70 % 20 _ 38 61 * *
35 % 20 - 35 59
10 % 20 - 4,6 66,44
* Параметры не определяли.
Для подтверждения этого сублимат гепатопанкреаса подвергли дробному осаждению и растворению в растворе сульфата аммония. В варианте дробного осаждения сублимат гепатопанкреаса растворяли в нейтральном 40 мМ пирофосфатном буфере с добавкой 0,1 М хлористого натрия. К полученному раствору с содержанием сухого вещества не менее 3,5 % добавляли насыщенный раствор сульфата аммония до достижения его необходимой конечной концентрации в растворе. Выпадающий осадок отделяли центрифугированием и определяли содержание гликогена в осадке и растворе. В варианте дробного растворения исходный сублимат гепатопанкреаса обрабатывали насыщенным раствором сульфата аммония, к которому далее добавляли пирофосфатный буфер, добиваясь необходимой конечной концентрации сульфата аммония в растворе. Нерастворившийся осадок отделяли центрифугированием и определяли содержание гликогена в осадке и растворе. Результаты экспериментов представлены на рис. 6.
Рис. 6. Растворение и осаждение гликогена в растворе сульфата аммония
Fig. 6. Dissolving and precipitating of glycogen in ammonium sulphate solution
Степень насыщения,%
При растворении наблюдается конкурентная экстракция белков и гликогена в раствор. Раствор не насыщается гликогеном, по мере разбавления его концентрация регулируется одновременно растворяющимися ферментами. Так, после разбавления экстракта до 10 %-ной степени насыщения сульфатом аммония (содержание гликогена в растворе
4,6 %) и часа экспозиции концентрация гликогена уменьшается до минимальной, характерной для автолизата, - 1,06-1,85 %. Если для инактивации ферментов использовать ферментативные яды (соли ртути или серебра), то при разбавлении гликоген переходит в раствор практически без разрушения и к моменту полного растворения сублимата его потери не более 10 %. Однако при этом вследствие сохранения интанкт-ности высокомолекулярных белков чистые препараты гликогена удается получить с технологическим выходом 72-74 % (табл. 3).
Комплексный хроматографический анализ методом ВЭЖХ с использованием для детектирования компонентов смесей двух длин волн (280 и 210 нм) позволил определить, что гликоген гепатопанкреаса краба в растворах образует наиболее прочные ассоциаты с белками с высокой молекулярной массой (табл. 3). Об этом же свидетельствует сравни-
212
тельный хроматографический анализ методом FPLC экстрактов гепато-панкреаса с последующей обработкой 6 М раствором мочевины и фильтрацией экстракта через слой сорбента ConA Sepharose® (табл. 4). Обработка 6 М раствором мочевины белковых смесей приводит к полному разрушению белок-белковых ассоциатов. При сравнении хроматограмм вариантов (1) и (2) (табл. 4) это проявляется в снижении интенсивности сигнала (AU • мин) с Rf 8,72 мин (молекулярный вес 660 кДа) на 24 %, сигнала с Rf 12,3 мин (310 кДа) вдвое, а также в увеличении сигналов низкомолекулярных компонентов смеси с Rf 18,18 мин (72 кДа), с Rf 20,46 мин (47,3 кДа). Аффинная фаза ConA Sepharose® фирмы Pharmacia Biotech АВ (Швеция) представляет собой агарозный гель с поверхностью, модифицированной конканавалином А -белком, обладающим сильным сродством к гликогену (Bernfeld, 1978). Обработка исходной пробы (1) фильтрацией через слой аффинного сорбента (3) приводит к значительному уменьшению доли высокомолекулярных фракций на хроматограмме (с Rf 8,72; 12,3 мин) и появлению сигнала свободного белка с Rf 9,76 мин (420 кДа), который не фиксировался в двух предыдущих случаях. Общее уменьшение доли растворимых веществ анализируемой пробы после обработки на ConA Sepharose составляет 25-30 %, что соответствует связыванию 90-95 % гликогена в образце пробы.
Таблица 4
Молекулярно-массовое распределение полипептидов гепатопанкреаса краба
Table 4
Molecular weighting distribution of crab liver’s polypeptides
Полипептид Содержание, % от общего*
Время удерживания, мин Молекулярная масса, кДа** 1 2 3
8 72*** 660 5,45 4,22 0,78
9 76*** 420 - - 0,95
12,3*** 310 9,46 4,81 3,56
18,18 72 25,77 35,72 37,29
20,46 47,3 2,02 35,73 37,65
24,86 26,6 1,07 1,09 1,68
25,95 23 0,14 0,17 0,20
27,68 12 14,09 9,20 8,95
30,06 8 9,01 9,58 8,34
33,46 <4 0,82 0,74 0,60
* 1 - экстракт гепатопанкреаса; 2 - экстракт гепатопанкреаса, обработанный 6 М мочевиной при температуре 90-95 °С, 2 мин; 3 - экстракт гепатопанкреаса, профильтрованный через колонку С5/10 СопА Sepharose-6CL в соотношении 0,5 мл пробы на 2,5 мл объема фазы.
** Гельфильтрация на Superdex-200 HR 10/30 и ХК 16/70 Sephacryl-
400.
*** Гельфильтрация на Superdex-75 HR 10/30 и ХК 26/70 Sephacryl-300.
Уменьшение содержание высокомолекулярной фракции (300600 кДа) после обеих обработок свидетельствует о сложном ассоциативном составе данных белковых фракций. Очевидно, реализуются как белок-белковые, так и белок-полисахаридные взаимодействия. Стабильное содержание ферментативно активной фракции свидетельствует об отсутствии сильных ассоциативных взаимодействий гликогена с протеа-зами гепатопанкреаса.
Таким образом, влияние пищеварительных ферментов на содержание гликогена в гепатопанкреасе краба является косвенным и, вероятно, сводится к высвобождению гликогена, связанного с белками-субстратами протеаз в результате протеолиза, вследствие чего макромолекулы гликогена становятся более доступны к действию специфических гидролаз.
ЛИТЕРАТУРА
Асатиани B.C. Методы биохимических исследований. - М.: Мир, 1956.
- 256 с.
Джунковская А.В., Захарова H.B. Панкреатическая эластаза - новая сериновая протеаза, выделенная из гепатопанкреаса камчатского краба // Все-союз. совещ. “Биологически активные вещества гидробионтов - новые лекарственные, лечебно-профилактические и технические препараты”: Тез. докл. -Владивосток: ТИНРО, 1991. - С. 8.
Кизеветтер И.В. Биохимия сырья водного происхождения. - М.: Пищ. пром-сть, 1973.
Купина H.M., Герасимова Н.А. Протеиназы из отходов переработки безпозвоночных // Рациональное использование биоресурсов Тихого океана. Тез. докл. Всесоюз. конф. - Владивосток: ТИНРО, 1991. - С. 229-230.
Купина H.M., Леваньков C.B. Использование отходов от разделки крабов // Рыб. хоз-во. - 1998. - № 4. - С. 56-58.
Леваньков C.B., Касьянов С.П., Купина H.M., Кучеравенко К.М. Комплексная переработка отходов производства пищевой продукции из камчатского краба (Paralithodes camtschatica) // Хранение и переработка сельхоз-сырья. - 2000. - № 3. - С. 36-41.
Сахаров И.Ю., Литвин Ф.Е., Артюков А.А., Кофанова Н.Н. Очистка и характеристика коллагенолитической протеазы А из гепатопанкреаса Paralithodes camtschatica // Биохимия. - 1988. - Т. 53, вып. 11. - С. 1844-1849.
Bernfeld P. Comparative biochemestry. - NY: Academic Press, 1978. -Vol. 3. - 356 p.
Jungreis A.M. The role of stored glycogen during long-term temperature acclimation in the freshwater crayfish // Comp. Biochem. Physiol. - 1968. - Vol. 24. - P. 1-6.
Lipke H., Graves B., Leto S. Polysaccharide and glycoprotein formation in the cockroach. - II. Incorporatioln of D-glucose-14C into bond carbohydrate // J. Biol. Chem. - 1965. - Vol. 240, № 3. - P. 601-608.
McWhinnie M.A., O’Connor J.D. Metabolism and low temperature acclimation in the temperate crayfish Orconectes virilis // Comp. Biochem. Physiol.
- 1967. - Vol. 20. - P. 131-145.
Neiland K.A., Scheer B.T. The influence of fasting and sinus gland removal on body composition of Hemigrapsus nudus // Physiol. Comp. Oeocol. - 1953. -Vol. 3. - P. 321-326.
Passano L.M. Molting and its control // The Physiology of Crustace. -
NY: Academic Press, 1960. - Vol. 1. - P. 473-536.
Renaud L. Le cycle des reserves organiques chez les Crustaces Decapoda // Annls Inst. Oceanogr. (Paris). - 1949. - Vol. 24. - P. 259-357.
Scheer B.T., Scheer M.A. Blood sugar in spiny lobsters // Physiol. Comp.
Oeocol. - 1951. - Vol. 2. - P. 198-209.
Scheer B.T., Schwabe C.W., Scheer M.A. Tissue oxidation in crustaceans // Physiol. Comp. Oeocol. - 1952. - Vol. 2. - P. 327-338.
Vonk H.J. Digestion and metabolism // The Physiology of Crustacea. -NY: Academic Press, 1960. - Vol. 1. - P. 291-316.
Поступила в редакцию 18.05.2001 г.
