CC BY
14МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Б.А.Фролов, И.Н. Чайникова, А.Д.Железнова, Т.В.Панфилова, И.П.Медведева, Ю.В.Филиппова, А.И.Смолягин
ЗАЩИТНЫЙ ЭФФЕКТ МИЛИАЦИНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ САЛЬ-МОНЕЛЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ
Оренбургская государственная медицинская академия
Цель. Оценка влияния тритерпеноида милиацина на развитие экспериментальной сальмонеллезной инфекции. Материалы и методы. Исследования выполнены на 330 мышах-самцах (CBAxC57Bl6)Fb Милиацин вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалом в 3 дня между введениями в разовой дозе 2 мг/кг. Животных заражали внутрибрюшинно штаммом Salmonella enteritidis госпитального происхождения (2х106 бактерий на мышь). Использовано 4 группы мышей: I — интактные; II — зараженные; III — зараженные после трехкратного введения растворителя для милиацина (твин 21 в конечной концентрации 1,6х10-7 моль/кг); IV — зараженные после введения милиацина. Результаты. Милиацин уменьшал гибель мышей по сравнению со II и III группой. Микробная обсе-мененность селезенки у мышей IV группы была значимо ниже по сравнению с группой II на всех сроках исследования, а печени — на 10 и 15 сутки. Тритерпеноид ослаблял клеточное опустошение костного мозга, тимуса и ограничивал гиперплазию селезенки по сравнению с животными II и III групп. Его защитный эффект не коррелирован с возрастанием титра антител. Заключение. Милиацин ослабляет тяжесть течения сальмонеллезной инфекции.
Журн. микробиол., 2013, № 6, С. 3—8
Ключевые слова: экспериментальная сальмонеллезная инфекция, милиацин, обсеменен-ность, лимфоидные органы
B.A.Frolov, I.N.Chainikova, A.D.Zheleznova, T.V.Panfilova, I.P.Medvedeva, Yu.V.Filippova, A.I.Smolyagin
PROTECTIVE EFFECT OF MILIACIN DURING EXPERIMENTAL SALMONELLOSIS INFECTION
Orenburg State Medical Academy, Russia
Aim. Evaluation of influence of triterpenoid miliacin on the development of experimental salmonellosis infection. Materials and methods. Studies were carried out in 330 male mice (CBAxC57Bl6)F1. Miliacin was administered 3 times intraperitoneally with the interval of 3 days between administrations at a single dose of 2 mg/kg. The animals were infected intraperitoneally by hospital origin Salmonella enteritidis strain (2x106 bacteria per mice). 4 groups of mice were used: I — intact; II — infected; III — infected after administering solvent for miliacin 3 times (tween 21 at final concentration of1.6x10-7 mol/kg); IV — infected after administration of miliacin. Results. Miliacin reduced the mortality of mice compared with groups II and III. Microbial contamination of mice spleen in group IV was significantly lower compared with group II at all the periods of the study, and liver — at days 10 and 15. Triterpenoid weakened cell depletion of bone marrow, thymus and limited hyperplasia of spleen compared with animals of groups II and III. Its protective effect did not correlate with increase of antibody titers. Conclusion. Miliacin weakens the severity of salmonellosis infection course.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2013, No. 6, P. 3-8
Key words: experimental salmonellosis infection, miliacin, contamination, lymphoid organs ВВЕДЕНИЕ
В ранее выполненных исследованиях было установлено, что тритерпеноид растительного происхождения — милиацин стимулирует вакцинальный иммунитет [6] и оказывает протекторное действие на иммунную систему при иммуносупрессивных воздействиях [2, 3, 9]. С учетом роли иммунной системы в антиинфекционной резистентности организма подобная иммунотропная активность милиацина позволяет полагать его возможное влияние на течение и исход инфекционного процесса.
Целью настоящей работы являлась оценка влияния милиацина на развитие экспериментальной сальмонеллезной инфекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования выполнены на 330 мышах-самцах (CBAxC57Bl6)Fi массой 22 — 25г из питомника «Столбовая» РАМН. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями работы с лабораторными животными. Эвтаназию мышей осуществляли дислокацией шейных позвонков или декапитацией под эфирным наркозом.
Заражение животных выполняли внутрибрюшинным введением штамма Salmonella enteritidis госпитального происхождения в дозе 2х106 бактерий на мышь.
В работе использован милиацин, полученный из кристаллов просяного масла, выпадающих при его отстаивании на холоду, и очищенный перекристаллизацией из хлороформа. На основании изучения масс-, ЯМР- и ИК-спектров, хроматографиче-ской однородности и качественного состава выделенный препарат отнесен к группе пентациклических тритерпеноидов, имеющих структуру 3^-метоксигер-маницена (3^-метокси-А18-олеанена) [7]. Милиацин вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалами в 3 дня между введениями в разовой дозе 2 мг/кг. Заражение животных проводили через 24 часа после последнего введения тритерпеноида.
Использовано 4 группы животных: I — интактные (положительная группа сравнения); II — зараженные (отрицательная группа сравнения); III — зараженные после предварительного трехкратного введения растворителя для милиацина (твин 21 в конечной концентрации 1,6х10-7 моль/кг — контроль); IV — зараженные после предварительного введения милиацина (опыт). Животных II — IV групп выводили из эксперимента на 5, 10 и 15 сутки после заражения. В эти же сроки осуществляли эвтаназию интактных мышей.
Для характеристики течения инфекционного процесса использовали показатели гибели животных, микробной обсемененности внутренних органов, массы и содержания клеток в органах иммуногенеза (тимус, селезенка, костный мозг), титра антител в сыворотке крови.
Гибель мышей оценивали на протяжении 28 суток после их заражения. Массу тимуса и селезенки определяли взвешиванием на электронных весах ВЛТ-150-П. Содержание клеток в этих органах рассчитывали после подсчета кариоцитов в их клеточных суспензиях, получаемых путем мягкого продавливания тканей тефлоновым пестиком в забуференном (рН 7,2) физрастворе. Количество миелокариоцитов в бедренной кости определяли после их вымывания средой 199. Подсчет клеток осуществляли в камере Горяева.
Для оценки микробной обсемененности печени и селезенки стандартные навески этих органов гомогенезировали на холоду в стерильном физиологическом растворе, полученный гомогенат пропускали через капроновый фильтр, готовили разведения фильтрата (цельный, 1:5, 1:10 и 1:20), которые в объеме 0,2 мл засевали шпателем на
поверхность среды Плоскирева в чашках Петри. Выросшие колонии идентифицировали в реакции агглютинации со специфической сальмонеллезной сывороткой. Учет выросших колоний проводили через 48 часов инкубации чашек при 37°C с последующим перерасчетом на 1г ткани.
Титр антител определяли в сыворотке крови животных в реакции непрямой ге-магглютинации с использованием эритроцитарного сальмонеллезного О-диагнос-тикума и выражали в lg.
Статистическую обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики из пакета прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 10 с оценкой различий между средними величинами по t-критерию Стьюдента [10]. Для описания показателей микробной обсемененности рассчитывали медиану (Ме), нижние (Q25) и верхние (Q75) квартили. Уровень статистической значимости различий определяли с помощью непараметрического дисперсионного анализа Краскела-Уоллиса [10]. Различия считались статистически достоверными при р<0,05.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Установлено, что заражение животных вызывает развитие инфекции, сопровождающейся гибелью 12 из 32 мышей (37,5%) на протяжении 28 суток наблюдения (группа II). При этом наибольшую гибель регистрировали на протяжении первых 7 суток после заражения. Предварительное введение растворителя (группа III) не оказало существенного влияния на летальность: 13 из 32 мышей (40,6%), но способствовало смещению максимума гибели на вторую неделю инфекции. Предварительное введение милиацина (группа IV) снижало гибель мышей (8 из 32) до 25,0% и также смещало максимум гибели на вторую неделю инфекции.
Этим данным соответствовали и результаты определения показателя микробной обсемененности (КОЕ/г) внутренних органов у животных исследуемых групп (табл. 1). Как видно из табл. 1, на всех сроках после заражения этот показатель для селезенки у мышей опытной группы (IV) был достоверно ниже по сравнению с таковым, определяемым в отрицательной группе сравнения (II), т.е. у только что зараженных животных. Аналогичная ситуация имела место и для ткани печени на 5 и 15 сутки после заражения. Что касается мышей контрольной группы (III), получавших перед заражением растворитель, то статистически значимые различия КОЕ/г с группой только зараженных животных (II) определяли у них лишь для ткани селезенки на 5 сутки инфекции. Вместе с тем, обращает на себя внимание то, что количественные
Таблица 1. Влияние милиацина на показатели микробной обсемененности селезенки и печени при сальмонеллезной инфекции у мышей (CBA x C57Bl6)F1
Исследуемые органы
Группы животных Сроки наблюдения Селезенка Печень
Me (Q25 - Q75) n Me (Q25 - Q75) n
II 5 сутки 1 169 785 (677 991 — 1 411 228) 7 670 374 (141 182—1 056 910) 6
III 349 790А (261830—730616) 7 38 804 (24 737—88 095) 7
IV 355 689° (267460—618659) 7 11713 (10 863—32 7237) 7
II 10 сутки 2 918 519 (1 193 069—4 285 714) 7 1 924 569 (1 225 166—5 807 692) 7
III 633 980 (606777—1016154) 7 792 683 (535653—1 177 249) 7
IV 319 269° (98827—413235) 7 49 531°° (37 076—65 512) 6
II 15 сутки 4234 (3049—237 000) 7 5361,5 (4386—16 071) 6
III 694 (476—3950) 7 1626 (441—3378) 7
IV 406° (227—984) 7 86° (0—678) 7
Примечание: "Достоверность между группами IV и II (при р<0,05); пмежду группами IV и III (при р<0,05); Амежду группами III и II (при р<0,05).
Таблица 2. Влияние милиацина на содержание миелокариоцитов и показатели лимфоидных органов при сальмонеллезной инфекции у мышей (CBA x C57Bl6)F1
Исследуемые органы
Группы Сроки наблюдения Костный мозг Тимус Селезенка
количество клеток на бедро (х10б) масса органа, мг количество клеток (х106) масса органа, мг количество клеток (х106)
I 22,11 + 1,03 (п=20) 45,6+3,7 (п=17) 54,8+8,1 (п=6) 134,8± 10,5 (п=8) 154,4+18,0 (п=8)
II 5 сутки 5,90+0,5* (п=9) 19,6+1,9* (п=14) 28,7+5,4* (п=6) 338,2+34,9* (п=6) 260,5+26,5* (п=6)
III 7,04+0,7* (п=8) 22,8+2,7* (п=14) 26,0+5,4* (п=6) 306,7+55,7* (п=6) 267,8+48,9* (п=6)
IV 11,6+1,1*°° (п=9) 29,2+2,7*° (п=14) 45,0+7,0 (п=6) 231,0+13,9*° (п=6) 210,3+16,9* (п=6)
II 10 сутки 9,23+0,8* (п=9) 17,9+2,5* (п=13) 15,0+2,3* (п=6) 471,2+37,8* (п=6) 283,2+25,2* (п=6)
III 9,2+1,1* (п=9) 19,2+2,6* (п=14) 14,0+2,3* (п=6) 475,3+66,0* (п=6) 212,5+20,8 (п=6)
IV 14,8+1,7*°° (п=9) 22,2+2,9* (п=14) 34,0+12,2 (п=6) 372,2+16,3*° (п=6) 154,5+14,2°° (п=6)
II 15 сутки 8,93+1,3* (п=8) 16,5+2,7* (п=12) 15,0+1,5* (п=6) 516,0+36,3* (п=6) 330,2+14,5* (п=6)
III 11,7+3,3* (п=7) 20,9+1,9* (п=13) 9,3+3,7* (п=6) 377,0+27,5* (п=6) 230,3+16,0* (п=6)
IV 16,4+2,9° (п=8) 24,1+2,9* (п=14) 23,0+2,1*°° (п=6) 424,0+35,2* (п=6) 223,3+23,4° (п=6)
Примечание: ^Достоверность с группой I (при р<0,05); "между группами IV и II (при р<0,05); □между группами IV и III (при р<0,05).
параметры этого показателя (медианы и распределения по квартилям) у мышей контрольной группы (III) во всех случаях были ниже, чем у животных отрицательной группы сравнения (II).
Данные о весовых и клеточных показателях органов иммуногенеза в динамике сальмонеллезной инфекции представлены в табл. 2. Как следует из табл. 2, инфекция (группа II) приводит к существенному падению (на 73,4+2,3% по отношению к ин-тактным мышам — группа I) содержания миелокариоцитов в костном мозге уже на 5 сутки после заражения. Аналогичная направленность изменений отмечена также у животных III и IV групп. Однако если у мышей контрольной группы (III) интенсивность этого падения (на 68,1+3,3%) соответствовала отрицательной группе сравнения (II), то у мышей опытной группы (IV) она была значительно менее выражена (на 47,5+5,1%). Указанные различия сохранялись и на 10 сутки, когда уровень падения содержания миелокариоцитов в костном мозге бедренной кости у животных II, III и IV групп составлял соответственно 58,2+3,6; 58,4+5,0 и 33,1+5,1%. К концу наблюдения у мышей опытной группы (IV), в отличие от животных II и III групп, статистически значимых различий данного показателя с интактными животными не обнаруживали, хотя полного восстановления содержания миелокариоцитов все еще не происходило (снижение на 25,8+6,6%).
Наряду с опустошением красного костного мозга сальмонеллезная инфекция приводила к гипоплазии тимуса во всех исследуемых группах мышей. Выраженность этой гипоплазии, оцениваемой по массе органа, среди животных различных групп существенно не отличалась, хотя в опытной группе (IV) на всех сроках (5, 10, 15 сутки) она была несколько менее выражена (падение массы на 36,0+4,5; 51,4+6,4 и 47,2+5,5%) по сравнению с показателями II (на 57,0+4,3; 60,8+5,5 и 63,8+5,8%) и III групп (на 50,0+6,6; 57,9+5,7 и 54,2+4,2%). Аналогичную зависимость отмечали и при определении содержания тимоцитов.
В отличие от изменений весовых и клеточных показателей, регистрируемых в тимусе и красном костном мозге, их кинетика для селезенки носила противоположную направленность и характеризовалась возрастанием. Наиболее отчетливо и динамично это возрастание имело место у зараженных мышей II и III групп, у которых прирост массы селезенки на 5 и 10 сутки после заражения составлял соответственно 151,0+25,8; 249,5+28,0 и 127,5+41,3; 252,7+49,0%. У животных опытной группы (IV) прирост
массы органа в указанные сроки был менее выражен, составляя 71,4± 10,2 и 176,1+12,1%. Сходную динамику обнаруживали и для показателя содержания спле-ноцитов, количество которых в указанные сроки у мышей II и III групп превосходило уровень, определяемый для мышей IV группы, вплоть до достоверных различий между группами (10 и 15 сутки инфекции).
Определение титров антител показало, что применение милиацина не только не способствовало увеличению их содержания в сыворотке крови зараженных животных, но сопровождалось даже их некоторым снижением. Так, если у мышей II группы на
5 и 15 сутки содержание антител составляло соответственно 2,05+0,2 и 1,24+0,5 у мышей III группы 1,97+0,15 и 1,8+0,4 то у животных IV группы оно составляло 1,42+0,5 и 1,15+0,07
ОБСУЖДЕНИЕ
Главный вывод по результатам работы состоит в том, что милиацин ослабляет тяжесть течения сальмонеллезной инфекции. Данное положение подтверждается снижением гибели животных, уменьшением микробной обсемененности их внутренних органов, ограничением гипоплазии костного мозга и тимуса, а также реакции селезенки на инфекционный процесс в виде увеличения ее массы и количества спле-ноцитов. Отмеченное некоторое снижение показателя микробной обсемененности у мышей III группы, получавших предварительно растворитель, могло быть обусловлено стимулирующим действием на перитонеальные макрофаги самой процедуры внутрибрюшинного введения растворителя. Не исключено, что такая процедура могла изменить функциональное состояние макрофагов по классическому пути их активации, характеризующемуся повышением бактерицидного потенциала фагоцитов [14]. Реализация этого потенциала могла способствовать и сдвигу максимальной гибели мышей на вторую неделю, однако она была недостаточной для их эффективной защиты, что отразилось на общем показателе погибших животных. Результаты работы свидетельствуют также о том, что защитное действие милиацина не связано с гуморальным иммунным ответом, что соответствует существующим представлениям
06 относительной роли антител в защите организма от сальмонеллезной инфекции [12, 16]. В связи с этим, можно полагать, что эффекты тритерпеноида опосредуются стимуляцией им механизмов клеточного иммунитета [4], антиоксидантной [8] и мем-бранопротекторной [5, 11, 13] активностью. Последняя представляет особое звено в механизме протекции при сальмонеллезной инфекции с учетом внутриклеточного паразитирования возбудителя [15]. Вместе с тем, не исключено, что действие милиа-цина носит бинарный характер и определяется также его прямым бактерицидным влиянием, установленным для других тритерпенов [17], либо ограничением перси-стентных свойств возбудителя [1], повышающим чувствительность последнего к факторам защиты макроорганизма.
Таким образом, установленный в работе защитный эффект милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции служит обоснованием дальнейшей разработки тритерпеноида в качестве возможного средства повышения эффективности воздействия на данный инфекционный процесс.
Л ИТЕРАТУРА
1. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М., Медицина, 1999.
2. Железнова А.Д., Железнов Л.М., Штиль А.А., Фролов Б.А. Морфологические проявления защитного влияния милиацина в лимфоидных органах при воздействии метотрексата. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2007, 144 (10): 458-463.
3. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Скачков М.В. и др. Милиацин предотвращает депрессию иммунитета к столбнячному анатоксину, индуцированную метотрексатом. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2009, 1: 53-59.
4. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Смолягин А.И. и др. Влияние милиацина на дисфункцию иммунной системы у мышей, при действии метотрексата. Иммунология. 2009, 5: 298-302.
5. Калинина О.В., Красиков С.И., Шехтман А.М. и др. Гепатопротекторное действие милиа-цина при токсическом поражении печени метотрексатом. Российский биотерапевтический журнал. 2009, 8 (1): 48-54.
6. Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В. и др. Стимуляция иммунитета к столбнячному анатоксину милиацином. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003, 6: 36-38.
7. Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Химическая природа и биологическая активность милиацина. Вопросы питания. 1991, 2: 57-59.
8. Панфилова Т.В. Штиль А.А., Фролов Б.А. Тритерпеноид милиацин снижает индуцированное стрессом ПОЛ. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2006, 141 (6): 633-635.
9. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Полосухина Е.Р. и др. Влияние тритерпеноида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки к апоптозу, индуцированному дексаме-тазоном. Бюлл. экспер. биол. и мед. 2003, 136 (10): 382-385.
10. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ «Статистика». М., Медиа Сфера, 2002.
11. Фролов Б.А., Кириллова А.В. Милиацин как мембранопротектор. Защитное действие милиацина при детергент-индуцированной иммуносупрессии. Российский аллергол. журнал. 2011, 4 (1): 402-403.
12. Чайникова И.Н. Инфектологическая характеристика сальмонеллеза. Автореф. дисс. д-ра мед. наук. Оренбург, 2006.
13. Чернов А.Н., Павлова М.Н., Олифсон Л.Е. Средство, стабилизирующее биологические мембраны. АС № 1043860 от 23.05.1983. А61К35/78.
14. Шварц Я.Ш., Свистельник А.В. Функциональные фенотипы макрофагов и концепция М1-М2-поляризации. Провоспалительный фенотип. Биохимия. 2012, 77 (3): 312-329.
15. Kiney-Cain T., Clements J.D., Bost K.L. Endogenous and exogenous interleukin-12 augment the protective immune response in mice orally challenged with Salmonella dublin. Infect. Immunol. 1996, 64: 1444-1447.
16. Lessard M., Hutckings D.L., Spencer J.L. Cell-mediated and humoral immune responses in chickens infected with Salmonella typhimurium. Avian diss. 1995, 39: 230-238.
17. Nick A., Wright A.D., Sticher O., Rali T. Antibacterial triterpenoid aids from Dillenia papuona. J. Nat. Prod. 1994, 52: 1245-1250.
Поступила 12.02.13
Контактная информация: Смолягин Александр Иванович, д.м.н., проф.,
460000, Оренбург, ул. Советская, 6, р.т. (3532)77-71-72
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
Е.В.Сысолятина1, К.А.Собянин1, А.В.Петряков2, Н.И.Трушкин2, Е.Н.Бекетова3, О.Ю.Арсеенкова3, Т.И.Карпова1, А.Л.Гинцбург1, Ю.С.Акишев2,4, С.А.Ермолаева1
БАКТЕРИЦИДНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ АРГОНОВОЙ ПЛАЗМЫ НА БИОПЛЕНКИ, СФОРМИРОВАННЫЕ IN VITRO И В ЗУБНОМ КАНАЛЕ
1НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи, 2Троицкий институт инновационных и термоядерных исследований, 3Стоматологическая поликлиника № 65, 4Национальный исследовательский ядерный университет «МИФИ», Москва
Цель. Оценка эффективности бактерицидного действия низкотемпературной плазмы (НТП) на биопленки, сформированные in vitro и в зубном канале. Материалы и методы. В работе использован антибиотикоустойчивый изолят Staphylococcus epidermidis, выделенный из очага гнойного пульпита. Биопленки, сформированные S.epidermidis in vitro на поверхности пластика и ex vivo на поверхности стенок зубных каналов, обрабатывали плазменной струей, формируемой смесью аргон:воздух (9:1), подвергнутой электромагнитному воздействию с частотой 100 кГц. Жизнеспособность бактерий определяли высевами на твердые питательные среды и по дифференциальной окраске Live/Dead с помощью флюоресцентной микроскопии. Результаты. Установлена дозозависимая гибель бактерий в биопленках с трехступенчатой кинетикой. Полное уничтожение микроорганизмов, содержащих в образце до 109 КОЕ/мл, было достигнуто при времени экспозиции равном 240 с и более. Заключение. Доказана возможность использования НТП для уничтожения бактерий в биопленках, сформированных в зубных каналах.
