CC BY
23
2
НОМЕР
ISSN 2304-9081
Электронный журнал
On-line версия журнала на сайте
http://www.elmag.uran.ru
БЮЛЛЕТЕНЬ
ОРЕНБУРГСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА УрО РАН
2016
УЧРЕДИТЕЛИ
УРАЛЬСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ РАН ОРЕНБУРГСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР УрО РАН
© Ю.В. Филиппова, 2016 УДК 616-022-085
Ю.В. Филиппова
ВЛИЯНИЕ ТРИТЕРПЕНОИДА МИЛИАЦИНА НА РАЗВИТИЕ ИНФЕКЦИИ У МЫШЕЙ, ВЫЗВАННОЙ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙ ФЛОРОЙ
Оренбургский государственный медицинский университет, Оренбург, Россия
Цель. Оценить возможности защитного влияния милиацина при экспериментальной инфекции, вызванной летальной дозой заражения грамотрицательной патогенной и условно-патогенной флорой.
Материалы и методы. В работе использован тритерпеноид милиацин, полученный из кристаллов просяного масла. В исследовании проведена оценка влияния тритерпеноида милиацина на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Salmonella серовар Enteritidis, Klebsiella pneumonia и Pseudomonas aeruginosa на мышах-самцах (CBAxC57Bl6)F1, массой 22-25г, поставленных из питомника «Столбовая» РАМН. Для характеристики течения инфекционного процесса использовали показатели гибели животных.
Результаты. Заражение животных S. еnteritidis вызывало развитие инфекции, сопровождающейся гибелью 37,5% мышей в течение 28 суток, введение милиацина снижало гибель мышей до 25,0%. Заражение мышей штаммом K. pneumoniae и P. аeruginosa приводило к гибели соответственно 85,7% и 70% животных в течение 48 часов. Использование милиацина не оказало защитного эффекта при инфекции, вызванной введением K. pneumoniae.
Заключение. Милиацин ослабляет тяжесть течения сальмонеллезной инфекции, что проявляется в снижении гибели животных. На развитие острой генерализованной инфекции, вызванной K. pneumonia милиацин влияния не оказывает.
Ключевые слова: тритерпеноид милиацин, мыши, экспериментальная инфекция, грамотрицательные бактерии
Y. V. Filippova
INFLUENCE TRITERPENOID MILIACIN ON THE DEVELOPMENT OF INFECTION IN MICE CAUSED BY GRAM-NEGATIVE FLORA
Orenburg State Medical University, Orenburg, Russia
Objective. To evaluate the possible protective effects of miliacin during experimental infection with a lethal dose of infection by gram-negative pathogenic and conditionally pathogenic flora.
Materials and methods. We used the triterpenoid miliacin obtained from crystals of millet oil. The study assessed the influence of triterpenoid miliacin on the development of experimental infections caused by Salmonella serovar Enteritidis, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa on mice-males (CBAxC57Bl6)F1 weighing 22-25g, delivered from the nursery "Stolbovaya" of the RAMS. For the flow characteristics of the infection process used figures of animal deaths.
Results. The animals infected by S. enteritidis caused the development of infection and the resulting death of 37.5% of the mice within 28 days, the introduction of miliacin reduces death in mice to 25.0%. Infection of mice with a strain of K. pneumoniae and P. aeruginosa resulted in death, respectively, of 85.7% and 70% of the animals within 48 hours. The use of miliacin has not had a protective effect in infections caused by introduction of the K. pneumoniae.
Conclusion. Miliacin reduces the severity of Salmonella infection, which is manifested in the decrease in animal deaths. On the development of acute generalized infection caused by K. pneumoniae miliacin has no effect.
Keywords: triterpenoid miliacin, mouse, experimental infection, gram-negative bacteria
Введение
В настоящее время в условиях усиливающегося влияния экологически неблагоприятных факторов, стрессовых ситуаций, стремительного распространения антибиотикорезистентности наблюдается рост заболеваний, связанных с нарушениями в системе иммунитета. С иммунобиологической позиции состояние здоровья современного человека характеризуется снижением иммунологической реактивности и, как следствие, повышением острой и хронической заболеваемости микробной этиологии. Увеличивается число случаев инфекций, вызванных условно-патогенными бактериями, включая клебсиеллы и псевдомонады, которые могут индуцировать токсико-септические состояния. Одно из ведущих мест в инфраструктуре острых кишечных заболеваний занимают инфекции, вызванные сальмонеллами, обладающими выраженными иммуносупрессивными свойствами, способностью к длительной персистенции в организме человека и животных и для которых характерно значительное разнообразие клинических проявлений (от бессимптомного бактерионосительства до генерализованной формы).
Учитывая указанные изменения структуры инфекционной патологии, наиболее заметные успехи в борьбе с патогенами и условно-патогенными микроорганизмами могут быть достигнуты благодаря использованию препаратов с иммуномодулирующими свойствами. В настоящее время к числу иммунокорректоров отнесены тритерпеноиды - вещества, обладающие широким спектром биологического действия. Продемонстрированная в ряде работ способность тритерпеноидов к стимуляции гуморального и клеточного иммунного ответа [1, 2] характеризует их как перспективные средства иммунотерапии.
Ранее было показано, что пентациклический тритерпеноид милиацин обладает широким спектром биологических свойств, включая антиоксидант-ную активность [3], способность уменьшать выраженность патологической эндотоксинемии [4], а также реализовывать протекцию в отношении системы иммунитета в вакцинальном процессе [5].
В этой связи представляет большой интерес изучение применения ми-
лиацина на модели инфекционного процесса бактериальной природы для изучения механизмов его протективного влияния и оценки защитного действия при остро протекающей инфекции, вызванной грамотрицательными длительно перстистирующими патогенными, а также условно-патогенными бактериями, способными вызывать инфекцию, центральным звеном патогенеза которой является токсико-септический процесс.
Целью настоящей работы являлась оценка возможности защитного влияния милиацина при экспериментальной инфекции, вызванной летальной дозой заражения грамотрицательной патогенной и условно-патогенной флорой.
Материалы и методы
Все экспериментальные исследования выполнены на мышах-самцах (CBAxC57Bl6)F1, массой 22-25 г, поставленных из питомника «Столбовая» РАМН. Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках при комнатной температуре, двухразовом питании натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам, при неограниченном доступе к воде. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными, отраженными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985). Эвтаназию мышей осуществляли дислокацией шейных позвонков.
В работе использован милиацин, полученный из кристаллов просяного масла, выпадающих при его отстаивании на холоду и очищенный перекристаллизацией из хлороформа. На основании изучения масс-, ЯМР- и ИК-спектров, хроматографической однородности и качественного состава выделенный препарат отнесен к группе пентациклических тритерпеноидов, имею-
18
щих структуру 3^-метоксигер-маницена ß-ß-метокси-А -олеанена) [6].
В исследовании проведена оценка влияния тритерпеноида милиацина на развитие экспериментальной инфекции, вызванной Salmonella серовар Enteritidis, Klebsiella pneumonia и Pseudomonas aeruginosa.
Для оценки влияния милиацина на развитие сальмонеллезной инфекции милиацин вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалами в 3 дня между введениями в разовой дозе 2 мг/кг. Заражение животных проводили через 24 часа после последнего введения тритерпеноида внутрибрюшинным введением клинического штамма S. enteritidis в дозе 2х106 КОЕ в объеме 0,5 мл на мышь. Было использовано 96 животных, разделенных поровну на 3
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 группы: 1 - только зараженные (группа сравнения); 2 - зараженные после предварительного трехкратного введения растворителя для милиацина (твин
п
21 в конечной концентрации 1,6х10- моль/кг) - контроль; 3 - зараженные после предварительного введения милиацина (опыт). Гибель мышей оценивали на протяжении 28 суток после их заражения.
Для оценки влияния милиацина на развитие клебсиеллезной инфекции воспроизведена модель генерализованной инфекции путем внутрибрюшин-ного заражения животных клиническим штаммом K. pneumonia в дозе 2х106 КОЕ в объеме 0,5 мл на мышь. В работе использованы 64 особи мышей, разделенных на 6 групп. Первую из них составили 14 животных, подвергнутых только заражению (группа сравнения). Вторая включала 10 зараженных особей, которым через 2 часа после заражения внутрибрюшинно вводился рас-
п
творитель для милиацина: твин 21 в конечной концентрации 1,6х10- моль/кг (контроль). 3, 4, 5 и 6 группы животных (опытные группы) подвергались через 2 часа после заражения внутрибрюшинному введению 0,5 мл милиацина соответственно в конечных концентрациях - 2, 10, 20 и 40 мг/кг. Гибель животных оценивали в течение первых трех дней после заражения.
Для оценки влияния милиацина на развитие инфекции, вызванной P. aeruginosa милиацин вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалами в 3 дня между введениями в разовой дозе 2 мг/кг. Заражение животных проводили через 24 часа после последнего введения тритерпеноида внутрибрю-шинным введением клинического штамма P. aeruginosa в дозе 80х106 КОЕ в объеме 0,5 мл на мышь. Было использовано 30 животных, разделенных на 3 группы: 1 - только зараженные (группа сравнения); 2 - зараженные после предварительного трехкратного введения растворителя для милиацина (твин
п
21 в конечной концентрации 1,6х10- моль/кг) - контроль; 3 - зараженные после предварительного введения милиацина (опыт). Гибель мышей оценивали на протяжении 8 суток после их заражения.
Результаты и обсуждение
Установлено, что заражение животных S. enteritidis вызывает развитие инфекции, сопровождающейся гибелью 12 из 32 мышей (37,5%) на протяжении 28 суток наблюдения (группа 1). При этом наибольшая гибель регистрировалась на протяжении первых 7 суток после заражения. Предварительное введение растворителя (группа 2) не оказало существенного влияния на летальность: 13 из 32 мышей (40,6%), но способствовало смещению максимума
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2016, № 2 гибели на вторую неделю инфекции. Предварительное введение милиацина (группа 3) оказывало защитный эффект: погибли 8 из 32 мышей (25,0%), и максимум гибели животных смещался на вторую неделю инфекции (табл.1).
Таблица 1. Влияние милиацина на показатели гибели мышей (СБЛхС^Б^^ при сальмонеллезной инфекции
п Количество погибших мышей в ди-
Группы намике инфекции Всего
животных 0 -7 дней 8-14 дней 15 -28 дней
1 заражение 32 8 2 2 12 (37,5%)
2 растворитель + заражение 32 3 6 4 13 (40,6%)
3 милиацин + заражение 32 2 5 1 8 (25,0%)
Таким образом, введение милиацина ослабляет тяжесть течения саль-монеллезной инфекции, что подтверждается снижением гибели животных. Ранее полученные данные свидетельствовали, что использование милиацина приводило к уменьшению микробной обсемененности внутренних органов, ограничению гипоплазии костного мозга и тимуса, а также реакции селезенки на инфекционный процесс в виде увеличения ее массы и количества спле-ноцитов [7]. При этом защитное действие милиацина при сальмонеллезной инфекции не было связано с гуморальным иммунным ответом [7], что соответствует существующим представлениям об относительной роли антител в защите организма от сальмонеллезной инфекции [8, 9].
В связи с этим можно полагать, что эффекты тритерпеноида опосредуются стимуляцией им механизмов клеточного иммунитета [10], а также его антиоксидантной [3] и мембранопротекторной [11-13] активностями. Последняя представляет особое звено в механизме протекции при сальмонел-лезной инфекции с учетом внутриклеточного паразитирования возбудителя [14]. Вместе с тем не исключено, что действие милиацина носит бинарный характер и определяется также его прямым бактерицидным влиянием, установленным для других тритерпенов [15], либо ограничением персистентных свойств возбудителя [16], повышающим чувствительность последнего к факторам защиты макроорганизма.
Внутрибрюшинное заражение мышей штаммом K. pneumoniae группы сравнения приводило к гибели 85,7% животных в течение 48 часов. Использование растворителя не повлияло на показатели гибели животных, которые на протяжении 48 часов составили 80%. Введение милиацина зараженным мышам не оказало защитного эффекта. Показатели гибели мышей в течение 48 часов при дозах тритерпеноида 2, 10, 20 и 40 мг/кг не отличались от контроля и группы сравнения, составляя, соответственно, 90, 70, 100 и 90%.
Развитие токсико-септического процесса, вызванного P. aeruginosa на протяжении 48 часов сопровождалось гибелью 70% мышей в первой группе, 10% - во второй и 20% - в третьей. Таким образом, предварительное ведение как растворителя (2 группа), так и милиацина (3 группа) приводило к снижению гибели мышей. Для оценки влияния тритерпеноида милиацина на инфекцию, вызванную P. аeruginosa, требуются дополнительные исследования.
Отсутствие коррекции сформировавшегося септического процесса, вызванного K. pneumonia, может быть объяснено данными ранее выполненных исследований других авторов, в том числе с помощью подходов, направленных на нейтрализацию определенных провоспалительных агентов (специфические антитела к ФНОа / ИЛ 1р, растворимые рецепторы к ФНО, антагонисты рецепторов к ИЛ 1) [17]. Известно, что центральная роль в патогенезе генерализованной инфекции принадлежит цитокиновой экспансии, индуцируемой сигнальным каскадом при участии TLR-4, адаптерного белка MyD 88 и фактора транскрипции NF-kB, отвечающего за экспрессию генов большинства провоспалительных цитокинов. Положение усугубляется способностью самих секретируемых цитокинов (ФНОа) выступать в роли индукторов NF-kB, придавая этой секреции лавинообразный характер, а также вовлекать в патологический процесс другие медиаторы воспаления. Тем самым, включаются регуляторные механизмы, формирующие системный воспалительный процесс, индуцируемый не только комплексом токсических соединений бактериального происхождения, но и громадным числом образующихся биологически активных веществ, обусловливающих полиморфизм проявлений патологии и тяжесть ее исхода. Вероятно, эффективная коррекция токсико-септических состояний может быть достигнута путем лимитирования продукции биологически активных веществ и формированием ранней эндоток-синовой толерантности [18].
Заключение
Милиацин ослабляет тяжесть течения сальмонеллезной инфекции, что проявляется в снижении гибели животных. На развитие острой генерализованной инфекции, вызванной K. pneumonia, милиацин влияния не оказывает.
ЛИТЕРАТУРА
1. Bernhardt M, Sturm C., Shaker K.H. et al. Structurally related immunological effects of triterpenoid saponins. Pharmazie. 2001. 56(9):741-3.
2. Ильичева Т.Н., Проняева Т.Р., Шульц Э.Э. и др. Иммуностимулирующая активность тритерпенов растительного происхождения и их производных. Журн. микробиол. 2001. 2: 53-56.
3. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Фролов Б.А. Тритерпеноид милиацин снижает индуцируемое стрессом ПОЛ. Бюлл. экспер. биол и мед. 2006. 141(6): 633-635.
4. Фролов Б.А., Чайникова И.Н., Филиппова Ю.В. и др. Механизмы реализации защитного действия милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции: влияние на эндотоксинемию и продукцию цитокинов. Журн. микробиол. 2014. 5: 8-12.
5. Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В. и др. Стимуляция иммунитета к столбнячному анатоксину милиацином. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2003. 6: 36-38.
6. Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Химическая природа и биологическая активность милиацина. Вопросы питания. 1991. 2: 57-59.
7. Фролов Б.А., Чайникова И.Н., Железнова А.Д. и др. Защитный эффект милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции. Журн. микробиол. 2013. 6: 3-8.
8. Чайникова И.Н. Инфектологическая характеристика сальмонеллеза. Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. Оренбург, 2006. 47с.
9. Lessard M., Hutckings D.L., Spencer J.L. Cell-mediated and humoral immune responses in chickens infected with Salmonella typhimurium. Avian diss. 1995. 39: 230-238.
10. Железнова А.Д., Панфилова Т.В., Смолягин А.И. и др. Влияние милиацина на дисфункцию иммунной системы у мышей, при действии метотрексата. Иммунология. 2009. 5: 298-302.
11. Калинина О.В., Красиков С.И., Шехтман А.М. и др. Гепатопротекторное действие милиацина при токсическом поражении печени метотрексатом. Российский биотерапевтический журнал. 2009. 8(1): 48-54.
12. Фролов Б.А., Кириллова А.В. Милиацин как мембранопротектор. Защитное действие милиацина при детергент-индуцированной иммуносупрессии. Российский аллергол. журнал. 2011. 4(1): 402-403.
13. Чернов А.Н., Павлова М.Н., Олифсон Л.Е. Средство, стабилизирующее биологические мембраны. А С. № 1043860 от 23.05.1983. А61К35/78.
14. Kiney-Cain T., Clements J.D., Bost K.L. Endogenous and exogenous interleukin-12 augment the protective immune response in mice orally challenged with Salmonella Dublin. Infect. Immunol. 1996. 64: 1444-1447.
15. Nick A., Wright A.D., Sticher O., Rali T. Antibacterial triterpenoid aids from Dillenia papuona. J. Nat. Prod. 1994, 52: 1245-1250.
16. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, 1999. 367 с.
17. Маркина А.А. Комплексное экспериментальное моделирование шоковых состояний. Иммунология. 2012. 5: 250-254.
18. Remick D.G., Ward P.A. Evaluation of endotoxin models for the study of sepsis. Shock. 2005. 24: 7-11.
Поступила 16.05.2016
(Контактная информация: Филиппова Юлия Владимировна - м.н.с. проблемной
научно-исследовательской лаборатории по изучению процессов естественного иммунитета Оренбургского государственного медицинского университета; адрес: 460014, г. Оренбург, ул. Советская, 6; тел. 8 (3532) 777172; e-mail: probllab. orenburg@mail. ru)
LITERATURE
1. Bernhardt M., Sturm C., Shaker K.H. et al. Structurally related immunological effects of triterpenoid saponins. Pharmazie. 2001. 56(9):741-3.
2. Il'icheva T.N., Pronjaeva T.R., Shul'c Je.Je. i dr. Immunostimulirujushhaja aktivnost' triterpenov rastitel'nogo proishozhdenija i ih proizvodnyh. Zhurn. mikrobiol. 2001. 2: 53-56.
3. Panfilova T.V., Shtil' A.A., Frolov B.A. Triterpenoid miliacin snizhaet induciruemoe stressom POL. Bjull. jeksper. biol i med. 2006. 141(6): 633-635.
4. Frolov B.A., Chajnikova I.N., Filippova Ju.V. i dr. Mehanizmy realizacii zashhitnogo dejstvija miliacina pri jeksperimental'noj sal'monelleznoj infekcii: vlijanie na jendotoksinemiju i produkciju citokinov. Zhurn. mikrobiol. 2014. 5: 8-12.
5. Kirillova A.V., Skachkov M.V., Panfilova T.V. i dr. Stimuljacija immuniteta k stolbnjachnomu anatoksinu miliacinom. Jepidemiologija i vakcinoprofilaktika. 2003. 6: 36-38.
6. Olifson L.E., Osadchaja N.D., Nuzov B.G. i dr. Himicheskaja priroda i biologicheskaja aktivnost' miliacina. Voprosy pitanija. 1991. 2: 57-59.
7. Frolov B.A., Chajnikova I.N., Zheleznova A.D. i dr. Zashhitnyj jeffekt miliacina pri jeksperimental'noj sal'monelleznoj infekcii. Zhurn. mikrobiol. 2013. 6: 3-8.
8. Chajnikova I.N. Infektologicheskaja harakteristika sal'monelleza. Avtoref. diss. ... dokt. med. nauk. Orenburg, 2006. 47s.
9. Lessard M., Hutckings D.L., Spencer J.L. Cell-mediated and humoral immune responses in chickens infected with Salmonella typhimurium. Avian diss. 1995. 39: 230-238.
10. Zheleznova A.D., Panfilova T.V., Smoljagin A.I. i dr. Vlijanie miliacina na disfunkciju immunnoj sistemy u myshej, pri dejstvii metotreksata. Immunologija. 2009. 5: 298-302.
11. Kalinina O.V., Krasikov S.I., Shehtman A.M. i dr. Gepatoprotektornoe dejstvie miliacina pri toksicheskom porazhenii pecheni metotreksatom. Rossijskij bioterapevticheskij zhurnal. 2009. 8(1): 48-54.
12. Frolov B.A., Kirillova A.V. Miliacin kak membranoprotektor. Zashhitnoe dejstvie miliacina pri detergent-inducirovannoj immunosupressii. Rossijskij allergol. zhurnal. 2011. 4(1): 402-403.
13. Chernov A.N., Pavlova M.N., Olifson L.E. Sredstvo, stabilizirujushhee biologicheskie membrany. A.S. № 1043860 ot 23.05.1983. A61K35/78.
14. Kiney-Cain T., Clements J.D., Bost K.L. Endogenous and exogenous interleukin-12 augment the protective immune response in mice orally challenged with Salmonella Dublin. Infect. Immunol. 1996. 64: 1444-1447.
15. Nick A., Wright A.D., Sticher O., Rali T. Antibacterial triterpenoid aids from Dillenia papuona. J. Nat. Prod. 1994, 52: 1245-1250.
16. Buharin O.V. Persistencija patogennyh bakterij. M.: Medicina, 1999. 367 s.
17. Markina A.A. Kompleksnoe jeksperimental'noe modelirovanie shokovyh sostojanij. Immunologija. 2012. 5: 250-254.
18. Remick D.G., Ward P.A. Evaluation of endotoxin models for the study of sepsis. Shock. 2005. 24: 7-11.
Образец ссылки на статью:
Филиппова Ю.В. Влияние тритерпеноида милиацина на развитие инфекции у мышей, вызванной грамотрицательной флорой, Бюллетень Оренбургского научного центра УрО
РАН. 2016. 2: 8с. [Электронный ресурс] (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/
2016-2/Articles/FYV-2016-2.pdf).
