CC BY
38
УДК 616.9. - 092.9 - 08: 615.322
© Б.А. Фролов, А.И. Смолягин, И.Н. Чайникова, А.Д. Железнова, О.В. Калинина, Т.В. Панфилова, Ю.В. Филиппова, 2014
Б.А. Фролов, А.И. Смолягин, И.Н. Чайникова, А.Д. Железнова, О.В. Калинина, Т.В. Панфилова, Ю.В. Филиппова ЗНАЧЕНИЕ ТРИТЕРПЕНОИДА МИЛИАЦИНА В ОГРАНИЧЕНИИ ЭНДОТОКСИНЕМИИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ
ИНФЕКЦИИ
ГБОУ ВПО «Оренбургская государственная медицинская академия» Минздрава России, г. Оренбург
На модели экспериментальной сальмонеллезной инфекции у мышей (CBAxC57Bl6)F1 изучена способность милиацина ограничивать выраженность патологической эндотоксинемии. Введение милиацина снижало уровень эндотоксина в циркуляции, а также системные проявления его влияния на организм, ограничивая подъем уровня кортикостерона в крови, мобилизацию окислительного стресса, продукцию провоспалительных цитокинов: ИЛ-6; ИЛ-17; у-ИНФ - и повышая продукцию противовоспалительного цитокина ИЛ-10 по отношению к только инфицированным животным и животным, зараженным после предварительного введения растворителя для милиацина.
Ключевые слова: сальмонеллезная инфекция, эндотоксинемия, милиацин.
B.A. Frolov, A.I. Smolyagin, I.N. Chainikova, A.D. Zheleznova, O.V. Kalinina, T.V. Panfilova, Yu.V. Filippova TRITERPENOID MILIACIN RESTRICTS ENDOTOXINEMIA IN EXPERIMENTAL SALMONELLA INFECTION
On the basis of experimental salmonella infection model in mice (CBAxC57Bl6)F1 miliacin capacity to restrict evidence of pathological endotoxinemia was studied. Miliacin reduced endotoxin level in circulation as well as systemic manifestations of its influence on the body, limiting corticosterone level rise in blood, oxidation stress mobilization, pro-inflammatory cytokine production: IL-6; IL-17; y-IFN and increasing production of pro-inflammatory cytokine - IL-10 in relation to both just infected animals and animals infected after preliminary injection of solvent for miliacin.
Key words: salmonella infection, endotoxinemia, miliacin.
Патологическая эндотоксинемия характеризуется эндотоксиновой агрессией как универсального фактора патогенеза различных заболеваний инфекционной и неинфекционной природы [3,7]. Соответственно поиск и разработка средств, ограничивающих выраженность эндотоксинемии, представляют актуальную задачу. При выборе таких средств важно отсутствие у них побочных эффектов, чему в первую очередь отвечают вещества природного происхождения. Среди последних в настоящее время все более заметное место отводится тритерпеноидам, к числу которых относится милиацин (3-Р-метокси-Д18-олеанен), входящий в состав просяного масла. Проявляя иммунотропную [1], антиапоптоти-ческую [2], антиоксидантную [4] и мембрано-протекторную [6] активность, милиацин снижает бактериальную обсемененность внутренних органов и повышает выживаемость животных при экспериментальной сальмо-неллезной инфекции [5].
Целью настоящей работы явилось изучение способности милиацина ограничивать выраженность патологической эндотоксине-мии при использовании данной экспериментальной модели инфекционного процесса.
Материал и методы
Исследования выполнены на 320 мышах-самцах (СВАхС^В^^ массой 22-25г, поставленных из питомника «Столбовая»
РАМН. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными (Страсбург, 1985). Эвтаназию мышей осуществляли дислокацией шейных позвонков или декапитацией под эфирным наркозом.
Милиацин вводили трехкратно внутри-брюшинно с интервалами в 3 дня между введениями в разовой дозе 2 мг/кг. Заражение животных проводили через 24 часа после последнего применения тритерпеноида внутри-брюшинным введением штамма Salmonella enteritidis госпитального происхождения в дозе 2-5x106 бактерий на мышь.
Всего использовано 4 группы животных: I - интактные (положительная группа сравнения); II - зараженные (отрицательная группа сравнения); III - зараженные после предварительного трехкратного введения растворителя для милиацина - твин 21 в конечной концентрации 1,6x10-7 моль/кг (контроль); IV - зараженные после предварительного введения ми-лиацина (опыт). Животных II-IV групп выводили из эксперимента на 10-е сутки после заражения - в период, соответствующий наибольшей микробной обсемененности их внутренних органов [6]. В эти же сроки осуществляли эвтаназию интактных мышей.
Эндотоксин в плазме крови мышей определяли хромогенным LAL-тестом по ко-
нечной точке путем измерения интенсивности окрашивания проб с помощью фотометра "Multiskan" (Labsystems, Финляндия) при длине волны 405 нм после остановки реакции и выражали в ЕД/мл. Выполнение данных исследований осуществлялось с использованием наборов Hbt LAL (Hycult biotech, Нидерланды).
В качестве показателей вовлеченности миелоидных клеток и лимфоцитов в воспалительный процесс проводилась оценка способности спленоцитов к митогениндуцированной (Кон А, 5мкг/мл) продукции провоспалитель-ных (ИЛ-6, ИЛ-17, у-интерферона) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов, определяя их содержание в супернатантах двухсуточных культур клеток методом ИФА (тест-системы "Bender MedSystems", Австрия). Для культивирования использовали RPMI-1640 c добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США) и гентамицина (80 мкг/мл).
Маркером окислительного стресса служили продукты окисления (МДА), реагирующие с тиобарбитуровой кислотой: ТБК-реагирующие продукты (ТБК-РП). Определение последних в сыворотке крови проводили с использованием стандартных наборов реактивов ТБК-АГАТ («Агат-Мед», Россия). Интенсивность цветной реакции определяли на
спектрофотометре APEL PD-303 UV при длине волн 535 и 570 нм.
Показателем мобилизации нейроэндо-кринной регуляции на действие эндотоксина как разновидности биологического стрессора являлся уровень в крови кортикостерона, определяемого методом ИФА. Интегральным критерием влияния эндотоксинемии на организм служила гибель животных на протяжении 21-го дня после заражения.
Статистическую обработку полученных данных проводили методами вариационной статистики из пакета прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 10 с оценкой различий между средними величинами по критерию Стьюдента. Статистические результаты выражали в виде медианы (Ме), нижних (Q25) и верхних (Q75) квартилей. Уровни статистической значимости различий определяли с помощью непараметрического критерия Ман-на-Уитни. Различия считались статистически достоверными при р<0,05.
Результаты
Установлено, что сальмонеллезная инфекция обусловливает значимое возрастание содержания эндотоксина в крови (группа II) (табл. 1). Медиана показателя его количества в циркуляции на 10-е сутки после заражения превосходила медиану количества эндотоксина у интактных мышей (группа I) в 7,25 раза.
Таблица 1
Влияние милиацина на выраженность системной патологической эндотоксинемии _при сальмонеллезной инфекции у мышей (Ме; р25 - р75)_
Показатели Группы животных
I II III IV
Эндотоксин, ЕД/мл n 0,04 (0,0 -0,18) 13 0,29* (0,2-0,41) 22 0,3* (0,19-0,48) 10 0,15*О# (0,14-0,22) 13
Кортикостерон, нг/мл n 28,95 (19,38-38,3) 12 100,3 * (34,7-166,2) 12 81,3* (47,13-143,9) 10 41,45* (36,47-102,5) 12
ТБК-РП, мкмоль/л n 0,23 (0,2-0,28) 11 0,88* (0,51-1,1) 7 0,76* (0,67-0,9) 6 0,2О# (0,18-0,22) 12
ИЛ-6, пг/мл n 257,1 (213,1-313,8) 8 918,9* (302,0-1775,0) 13 655,0* (358,0-916,6) 7 387,8О#(203,5-494,4) 14
ИЛ-17, пг/мл n 5,4 (4,71-6,28) 8 54,5* (27,15-60,20) 11 51,37* (24,53-101,4) 11 38,7* (16,67-52,21) 10
у-ифн, пг/мл n 23,32 (20,38-31,41) 11 369,8* (234,3-843,9) 11 395,1* (256,1-460,5) 11 296,65* (256,1-880,8) 10
ИЛ-10, пг/мл n 5,19 (4,33-5,81) 8 22,95* (17,63-32,69) 11 15,47* (9,32-25,29) 11 30,54*# (20,43-50,77) 10
Гибель — 37,5% (12/32)1 40,6% (13/32) 25% (8/32)
1 В числителе - количество погибших животных; в знаменателе - общее число зараженных животных. *р<0,05 с группой I; О р<0,05 между группами IV и II; # р<0,05 между группами IV и III.
Использование растворителя (группа
III) не оказало влияния на прирост эндотоксина. В этом случае медиана его содержания в крови превышала значения интактных животных в 7,5 раза. Введение милиацина (группа
IV), напротив, приводило к снижению (на 50%) содержания эндотоксина до уровня, превосходящего показатель интактных мышей лишь в 3,75 раза.
Снижение содержания эндотоксина под влиянием милиацина приводило к менее выраженному проявлению общего адаптационного синдрома. Так, если среди зараженных мышей II и III групп уровень кортикостерона в крови превышал значения интактных животных (группа I) в 3,46 и в 2,81 раза, то у мышей IV группы этот показатель составил 1,43.
В условиях снижения содержания эндотоксина у мышей опытной группы (IV) не наблюдалось повышения содержания в крови ТБК-РП по отношению к интактным животным (группа I). В то же время во II и III группах данный показатель интенсивности окислительного стресса был существенно повышен без значимых различий между этими группами.
Эндотоксинемия у зараженных мышей (группа II) характеризовалась не только возрастанием уровня эндотоксина в циркуляции, но и существенным повышением продукции провоспалительных цитокинов: ИЛ-6 в 3,57 раза, ИЛ-17 в 10,1 раза и у-ИНФ в 15,85 раза. Введение растворителя не ослабляло этого эффекта. Прирост цитокинов у данной группы животных (III) составил: ИЛ-6 в 2,54 раза, ИЛ-17 в 9,5 раза и у-ИНФ в 16,9 раза. Что касается опытной группы (IV), то в ней регистрировалось ослабление продукции данных медиаторов воспаления. В частности, уровень ИЛ-6 на 57,8% был ниже, чем у мышей группы II, и на 40,8% ниже, чем у мышей группы III. Снижение продукции ИЛ-17 у мышей IV группы по отношению к группам II и III составило 29% и 24,7%, а для у-ИНФ соответственно - 19,8% и 25%. В противоположность этому, продукция противовоспалительного цитокина - ИЛ-10 у мышей IV группы была выражена максимально и превышала ее уровень по отношению к животным II и III групп на 33,1% и 97,4 %.
Как итог ослабления системной патологической эндотоксинемии у мышей опытной группы регистрировалось снижение гибели (25%) по сравнению с только зараженными животными (37,5%) и зараженными животными, получавшими растворитель (40,6%).
Обсуждение
Полученные результаты свидетельствуют о том, что милиацин ослабляет выраженность эндотоксинемии, снижая уровень эндотоксина в крови и системные проявления его влияния на организм. Особого внимания заслуживает способность милиацина ограничивать продукцию провоспалительных цито-кинов: ИЛ-6 - цитокина широкого спектра действия, участвующего в индукции всего
комплекса местных проявлений воспалительной реакции; ИЛ-17 - цитокина, активирующего фактор транскрипции КБ-кВ и экспрессию многочисленных КБ-кВ-зависимых генов воспаления; у-ИНФ - основного медиатора клеточного воспаления. В то же время милиа-цин повышал способность спленоцитов к продукции ИЛ-10 -противовоспалительного цитокина, служащего антагонистом у -ИНФ, угнетающего продукцию ИЛ-17 и ингибиру-ющего активность макрофагов.
Наиболее очевидным объяснением такого эффекта милиацина является ранее установленный факт снижения под его влиянием микробной обсемененности внутренних органов. Вместе с тем выраженность эндотокси-немии обусловлена не только поступлением эндотоксина в системную циркуляцию, но и возможностью его элиминации из крови. Последняя в наибольшей степени определяется активностью макрофагальной системы печени - клеток Купфера, характеризующихся высокой экспрессией рецепторов к ЛПС -ТЬЯ4. Принимая во внимание данные о способности милиацина оказывать гепатопротек-торный эффект, в том числе и в отношении клеток Купфера [4], представляется вероятным, что влияние тритерпеноида реализовы-валось в отношении и этого антиэндотокси-нового механизма.
Наконец, можно полагать, что эффекты тритерпеноида опосредуются и его мем-бранопротекторной активностью. Последняя представляет особое звено в механизме протекции при сальмонеллезной инфекции с учетом внутриклеточного паразитирования возбудителя.
Выводы
1. Тритерпеноид милиацин ослабляет выраженность патологической эндотокси-немии при экспериментальной сальмонеллез-ной инфекции, уменьшая содержание эндотоксина в циркуляции и ограничивая системные проявления его влияния на организм.
2. Снижение выраженности эндоток-синемии у зараженных животных под влиянием милиацина может отражать один из значимых механизмов его защитного действия при инфекционном процессе.
Сведения об авторах статьи:
Фролов Борис Александрович - д.м.н., профессор, зав. кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Парковый проспект 7. Тел./факс: 8(3532)77-96-07. E-mail: k_pathphys@orgma.ru. Смолягин Александр Иванович - д.м.н., профессор, зав. проблемной лабораторией по изучению механизмов естественного иммунитета ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Парковый проспект 7. Тел./факс: 8(3532)77-71-72. E-mail: probllab.orenburg@mail.ru.
Чайникова Ирина Николаевна - д.м.н., профессор, старший научный сотрудник проблемной лаборатории по изучению механизмов естественного иммунитета ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Парковый проспект 7. Тел./факс: 8(3532)77-71-72. E-mail: probllab.orenburg@mail.ru.
Железнова Алла Дмитриевна - к.м.н., доцент кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Парковый проспект 7. Тел./факс: 8(3532)77-96-07. E-mail: k_pathphys@orgma.ru. Калинина Ольга Вячеславовна - заочный аспирант, ассистент кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Парковый проспект 7. E-mail: k_pathphys@orgma.ru.
Панфилова Татьяна Владимировна - к.м.н., доцент кафедры патологической физиологии ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Парковый проспект 7. Тел./факс: 8(3532)77-96-07. E-mail: k_pathphys@orgma.ru. Филиппова Юлия Владимировна - мл. научный сотрудник проблемной лаборатории по изучению механизмов естественного иммунитета ГБОУ ВПО ОрГМА Минздрава России. Адрес: 460000, г. Оренбург, Парковый проспект 7. Тел./факс: 8(3532)77-71-72; e-mail: probllab.orenburg@mail.ru.
ЛИТЕРАТУРА
1. Железнова А.Д. Экспериментальное обоснование применения милиацина для коррекции иммуносупрессии, индуцированной метотрексатом: автореф. дисс.... канд. мед. наук. - Пермь, 2010. - 22 с.
2. Влияние тритерпеноида милиацина на чувствительность лимфоцитов тимуса и селезенки к апоптозу, индуцированному декса-метазоном / Т.В. Панфилова [и др.] //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т.136, №10. - С.382-385.
3. Механизмы антиэндотоксиновой защиты печени / Л.Ф. Панченко [и др.] // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2012. - №2. - С.62-69.
4. Преодоление гепатотоксичности метотрексатом: роль тритерпеноидов / Б.А. Фролов [и др.] // Клиническая онкогематология. -2013. - Т. 6, № 1. - С. 1-10.
5. Защитный эффект милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции / Б.А. Фролов [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2013. - № 6. - С. 3-8.
6. Чернов, А.Н. Средства, стабилизирующие биологические мембраны / А.Н. Чернов, М.М. Павлова, Л.Е. Олифсон // Авторское свидетельство № 1043860 от 23.05.1983. А 61К 35/78.
7. Яковлев, М.Ю. Эндотоксиновая агрессия как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных / М.Ю. Яковлев //Успехи современной биологии. - 2003. - Т. 123, № 1. - С. 31-40.
УДК612. 363 - 089:618. 2
© А.Г. Хасанов, Э.В. Янбарисова, Ф.Ф. Бадретдинова, 2014
А.Г. Хасанов, Э.В. Янбарисова, Ф.Ф. Бадретдинова КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОСТРОГО АППЕНДИЦИТА У БЕРЕМЕННЫХ
ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, г. Уфа МБУЗ «Городская клиническая больница №8», г. Уфа
Изучены клинико-морфологические особенности острого аппендицита у 106 беременных. У 61 беременной диагноз был исключен. При анализе диагностических признаков по шкале Альварадо сумма баллов у большинства таких больных не превышала 5. У 45 беременных клинико-лабораторная картина соответствовала острому аппендициту. При оценке клинических признаков у подавляющего большинства этих больных она составляла 7-10 баллов. При катаральных аппендицитах сумма баллов, как правило, составила 7-8. У 11 (27,5%) беременных диагностирован острый катаральный аппендицит. При гистологическом изучении макропрепарата у 5 больных верифицирован поверхностный аппендицит, у 6 - обострение хронического аппендицита. Применение шкалы Альварадо позволяет улучшить диагностику острого аппендицита у беременных.
Ключевые слова: острый аппендицит, беременность, шкала Альварадо.
A.G. Khasanov, E.V. Yanbarisova, F.F. Badretdinova CLINICAL AND MORPHOLOGICAL FEATURES OF ACUTE APPENDICITIS DURING PREGNANCY
106 pregnant women have been studied for clinical and morphological features of acute appendicitis. In 57 pregnant women diagnosis was excluded. In the analysis of diagnostic signs according to Alvarado scale, the sum of points did not exceed 5 in most patients. Clinical and laboratory picture of 45 pregnant women corresponded to acute appendicitis. When scoring clinical signs in the vast majority of patients it was 7-10 points. In catarrhal appendicitis points sum usually was 7-8 points. 11 (27.5%) pregnant women were diagnosed with acute catarrhal appendicitis. Histological study of gross specimen verified surface appendicitis in 5 patients, in 6 - exacerbation of chronic appendicitis. Alvarado scale application allows to improve the diagnosis of acute appendicitis in pregnant women.
Key words: acute appendicitis, pregnancy, Alvarado scale.
Острый аппендицит (ОА) у беременных является одним из сложных пограничных акушерско-хирургических ситуаций. Своевременная диагностика данного заболевания во время беременности крайне затруднительна. Это связано с изменением топографии органов брюшной полости, гормонального и иммунологического баланса во время беременности, реакцией самого организма на те-
чение острого воспалительного процесса [2,3,6,8]. Существующее множество диагностических приемов и характерных симптомов для острого аппендицита зачастую не позволяют хирургу однозначно определить дальнейшую тактику ведения больного. Клиническая триада Дьелафуа, включающая в себя основные локальные признаки ОА в виде боли в правой подвздошной области, локального
