CC BY
60
О КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012
УДК 615.322.03:616-092:612.017.1]-008.64-084
О. В. Калинина, А. Д. Железнова, Т. В. Панфилова, Б. А. Фролов
РАЗВИТИЕ ВТОРИЧНОГО ИММУНОДЕФИЦИТА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ КСЕНОБИОТИКА С ИММУНОСУПРЕССИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
ГБОУ ВПО Оренбургская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ
В эксперименте на мышах (CBA-C57Bl6)F1 и крысах Вистар показан защитный эффект тритерпеноида растительного происхождения — милиацина (3-в-метокси-А18-олеанена) в отношении гуморального иммунного ответа и клиренсной функции макрофагов печени в условиях применения ксенобиотика метотрексата. Результаты работы определяют перспективу использования милиацина как иммунопротектора при воздействии на организм неблагоприятных экологических и производственных химических факторов, формирующих вторичный иммунодефицит.
Ключевые слова: ксенобиотики, иммунодефициты, милиацин, тритерпеноиды, профилактика
O.V Kalinina, A.D. Zheleznova, T.V Panfilova, B.A. Frolov — THE DEVELOPMENT OF SECONDARY IMMUNODEFICIENCY IN BODY WHEN EXPOSED TO THE EFFECT OF XENOBIOTICS WITH IMMUNOSUPPRESSIVE ACTIVITY
The State Education Institution of Higher professional education “The Orenburg State Medical Academy of Federal Agency in Public Health and Social Development”
In the experiment on mice (CBA x C57Bl6) F1 and Wistar rats is shown the protective effect of triterpenoid plant — miliatsina (3-ft-methoxy-A18-oleanena) in relation to the humoral immune response and clearance macrophage function hepatic xenobiotic conditions of use - methotrexate. The results define the term as used miliatsina immunoprotector with adverse effects on the body of environmental and industrial chemical factors that form the secondary immunodeficiency.
Key words: xenobiotics, immune deficiency, miliacin, triterpenoids, prevention
Введение
Иммунная система является критической мишенью для большого числа ксенобиотиков [6,8] и, следовательно, служит индикатором экологического фона. Вместе с тем нарушения иммунного статуса снижают резистентность организма к инфекции [10], отрицательно сказываются на эффективности вакцинопрофилактики [4], повышают риск аутоиммунных и аллергических заболеваний [6]. Эти положения определяют необходимость решения ряда актуальных прикладных задач, включая разработку подходов для предупреждения нарушений иммунной системы под влиянием неблагоприятных экологических факторов или для коррекции уже возникших нарушений.
В обширном ряду иммунокорректоров [7] все большее внимание привлекают тритерпеноиды, обладающие иммунотропной активностью [11]. Такая активность обнаружена и у милиацина, проявляющего способность к стимуляции вакцинального иммунитета
[2] и дающего защитный эффект при стрессиндуциро-ванных нарушениях иммунного ответа [5].
Целью настоящей работы являлась экспериментальная оценка иммунопротективной способности милиа-цина в условиях действия на организм ксенобиотика с иммуносупрессивными свойствами.
Материалы и методы
Использован милиацин, полученный из кристаллов просяного масла, выпадающих при его отстаива-
Калинина О. В. — заочный асп. каф. патологической физиологии ([email protected]); Железнова А. Д. — канд. мед. наук, ассистент каф. патологической физиологии; Панфилова Т. В. — канд. мед. наук., доц. каф. патологической физиологии; Фролов Б. А. — д-р мед. наук, проф., зав. каф. патологической физиологии.
нии на холоде, и очищенный перекристаллизацией из хлороформа. На основании масс-спектрометрии, ЯМР и ИК-спектров, хроматографической однородности и качественного состава препарат отнесен к группе пентациклических тритерпеноидов со структурой 3-Р-метоксигерманицена (3 -Р-метокси-А18-олеанена)
[3]. В работе применен метотрексат (МТ) австрийской фирмы «Эбеве».
Гуморальный иммунный ответ изучен на 109 мы-шах-самцах (СВА-С^^^ массой 18—20 г (питомник РАМН «Столбовая»), разделенных на 4 группы: 1-я — интактные; 2-я — получавшие внутрибрюшинно однократно МТ (10 мг/кг); 3-я — получавшие МТ с последующим троекратным введением растворителя для милиацина: твин-21 в конечной концентрации
1,6 • 10-7 моль/кг; 4-я — получавшие МТ с последующим троекратным введением милиацина (2 мг/кг). Введение тритерпеноида или растворителя проводили внутрибрюшинно через 1, 24, 48 ч после инъекции цитостатика. Иммунизацию мышей 2, 3 и 4-й групп выполняли на 5, 9 и 16-е сутки после применения МТ внутрибрюшинным введением эритроцитов барана (5 • 108/мл — 1,0 мл). В эти же сроки иммунизировали мышей 1-й группы. Иммунный ответ тестировали на 5-е сутки после иммунизации, определяя относительное и абсолютное содержание антителообразующих клеток (АТОК) в селезенке животных [9].
Функциональную активность макрофагов печени у крыс Вистар оценивали по их клиренсной функции, показателем которой служила скорость очищения крови от внутривенно введенной туши. Всего использовано 49 животных, разделенных на 4 аналогичных группы. Крысам, наркотизированным уретаном (внутримышечно 1,0 г/кг), в бедренную вену вводили 0,26 мл на 100 г массы тела суспензии туши, смешанной в равной пропорции с 0,4% раствором желатины. Кровь для анализа (по 0,1 мл) забирали из предварительно катетеризиро-
73
[гиена и санитария 3/2012
Таблица 1
Влияние милиацина на формирование гуморального иммунного ответа у мышей (СВА-С Bl^Fj, подвергавшихся воздействию МТ,
при иммунизации животных в различные сроки после введения цитостатика
Группа животных Срок иммунизации после введения МТ, сут Срок тестирования после введения МТ, сут Исследуемые показатели (M±m)
количество сплено-цитов, • 106 АТОК, • 106 АТОК на селезенку
1-я — Интактные (22) - 5 110,9±3,07 266,9±13,56 29 442±959
2-я — МТ (7) 5 10 115,0±8,4 94,4±13,3** 11 244±2170**
3-я — МТ + растворитель (8) 5 10 119,4±7,4 108,0±11,8** 12 763±1158**
4-я — МТ + милиацин (7) 5 10 125,0±6,3 161,6*14,1*,',# 19 967*1637*-,#
2-я — МТ (11) 9 14 117,7±5,2 206,5±20,8* 21 281±2559*
3-я — МТ + растворитель (14) 9 14 119,6±3,1 186,4±13,2** 22 002*1349**
4-я — МТ + милиацин (13) 9 14 109,2±3,74 276,2*17,76',## 30 178*1703',#
2-я — МТ (10) 16 21 107,0±2,6 287,5±16,7 30 569*1462
3-я — МТ + растворитель (9) 16 21 102,2±3,9 282,9±13,7 28 635*1066
4-я — МТ + милиацин (8) 16 21 109,4±5,6 268,0±14,4 29 101*1488
Примечание. Достоверность различий: * — с показателями 1-й группы (при p < 0,05); ** — то же (при p < 0,001); ' — между показателями
4-й и 2-й групп (при p < 0,05); : — то же (при p < 0,01); # — между показателями 4-й и 3-й групп (при p < 0,01); ## — то же (при p < 0,001).
ванной яремной вены через 15 и 30 с после введения туши, а также через 1, 3, 6, 9 и 12 мин в пробирки, содержащие 3 мл физиологического раствора с гепарином (5 Ед/мл). Наличие остаточной туши в пробах определяли после 15 мин центрифугирования (1000 об/мин) на спектрофотометре APEL PD-303 UV при длине волны 650 нм. Результат выражали в процентах от исходного количества туши, приняв за нулевую точку показатель экстинкции плазмы через 15 с после ее введения. Исследования выполнены на 10-е и 14-е сутки после инъекции МТ, т. е. в разгар деструктивно-морфологических изменений в печени [1].
Животных содержали в стандартных клетках при комнатной температуре, двухразовом питании натуральным кормом при неограниченном доступе к воде. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страс-
бург, 1985). Выведение из опытов мышей проводили цервикальной дислокацией, крыс — передозировкой наркотизирующего препарата.
Статистическую обработку результатов осуществляли с применением параметрического (критерий Стьюдента) и непараметрического (критерий Манна— Уитни) методов. В качестве минимально допустимого использовано значение p < 0,05.
Результаты и обсуждение
Депрессивное влияние МТ на гуморальный иммунный ответ было максимальным при иммунизации мышей 2-й группы на 5-е сутки после применения цитостатика (табл. 1). Это выражалось существенным падением относительного (на 64,6±4,98%) и абсолютного (на 61,8±7,4%) содержания АТОК по отношению к их уровню у только что иммунизированных мышей (1-я группа). При иммунизации на 9-е сутки после применения МТ эффект иммуносупрессии был менее выра-
Таблица 2
Влияние милиацина на МТ-индуцированную депрессию клиренса крови крыс Вистар
Группа животных
Срок забора крови для исследования 1-я, интактные (6) 2-я, 10-е сутки МТ (7) 3-я, 10-е сутки МТ + растворитель (7) 4-я, 10-е сутки МТ + милиацин (7) 2-я, 14-е сутки МТ (8) 3-я, 14-е сутки МТ + растворитель (7) 4-я, 14-е сутки МТ + милиацин (7)
остаточное содержание туши в плазме, %
15 с 100 100 100 100 100 100 100
30 с 64,0*1,8 87,5*2,4* 79,9*1,4* 68,5*2,1',А 89,3*2,8* 88,9*1,3* 62,3*2,3',А
1 мин 50,8*2,0 61,3*3,3* 62,7*3,0* 47,7*1,5'Л 79,1*4,3* 75,3*4,0* 44,9*3,0',А
3 мин 31,0*1,8 35,6*2,0 38,8*1,7* 34,0*1,8 46,9*2,6* 50,9*3,1* 32,9*2,9',А
6 мин 15,9*2,6 17,2*2,1 18,6*0,9 17,5*1,1 22,5*1,3* 26,1*1,8* 17,3*0,9'Л
9 мин 9,5*0,7 11,9*1,2 12,6*0,6 10,7*1,0 11,2*1,1 12,6*0,9 9,6*1,2
12 мин 6,0*0,5 7,1*0,6 8,0*0,4 7,3*0,6 7,6*0,6 7,3*0,8 6,3*0,6
Примечание. Достоверность различий: * — с показателями 1-й группы (приp < 0,05); • — между показателями 4-й и 2-й групп (приp < 0,05); ,▲ — между показателями 4-й и 3-й групп (приp < 0,05); в скобках указано количество животных.
74
жен: снижение этих показателей по отношению к таковым в 1-й группе составило соответственно 22,6±5,9 и 27,7±5,5%. При иммунизации на 16-е сутки различий между 2-й и 1-й группами не выявлено.
Уровень иммунного ответа у мышей 3-й группы, получавших МТ с растворителем, полностью соответствовал тому, который был характерен для животных 2-й группы на всех сроках иммунизации после введения МТ.
Милиацин (4-я группа) ослаблял иммуносупрессию, индуцированную МТ. При иммунизации мышей этой группы на 5-е сутки после применения МТ снижение относительного (на 39,4±5,3%) и абсолютного (на 32,2±5,6%) содержания АТОК по отношению к таковому в 1-й группе было почти в 2 раза меньше, чем у животных 2-й и 3-й групп. Кроме того, милиацин сокращал и сроки восстановления уровня иммунного ответа, который у мышей 4-й группы нормализовался при их иммунизации уже на 9-е сутки после введения МТ.
Изучение клиренсной функции макрофагов печени показало (табл. 2), что МТ оказывает на нее угнетающее влияние, проявляющееся более высокими значениями остаточного содержания туши в плазме крови крыс 2-й группы по сравнению с интактными животными (1-я группа). Причем, если на 10-е сутки после введения цитостатика эта депрессия регистрировалась на протяжении 1-й минуты, то к 14-м суткам — уже на протяжении 6 мин после инъекции туши. Применение растворителя (3-я группа) не повлияло на снижение элиминации туши из плазмы крови животных, подвергавшихся воздействию МТ. Совершенно иная картина имела место при использовании милиацина: и на 10-е, и на 14-е сутки после введения МТ содержание остаточной туши в плазме крови животных 4-й группы соответствовало показателям интактных крыс (1-я группа).
Таким образом, полученные данные демонстрируют важную особенность милиацина как средства, защищающего иммунную систему от иммунодепрессивного влияния ксенобиотика, что определяет перспективы практического использования тритерпеноида в качестве иммунопротектора при воздействии на организм неблагоприятных экологических и производственных факторов.
Литер атур а
1. Калинина О. В., Красиков С. И., Шехтман А. М. и др. // Рос. биотер. журн. — 2009. — Т 8, № 1. — С. 48—54.
2. Кириллова А. В., Скачков М. В., Панфилова Т. В. и др. // Эпидемиология. Вакцинопрофилактика. — 2003. — № 6 (13). — С. 36—38.
3. Олифсон Л. Е., ОсадчаяН. Д., НузовБ. Г. и др. // Вопр. пит. — 1991. — № 2. — С. 57—59.
4. Савилов Е. Д. // Бюл. СО РАМН. — 2008. — № 1. — С. 43— 46.
5. Фролов Б. А., Панфилова Т. В. // Рус. иммунол. журн. — 2004. — № 9 (1). — С. 242.
6. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В., Истамов Х. И. Экологическая иммунология. — М.: Из-во ВНИРО, 1995.
7. Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. // Иммунология. — 2000. — № 5. — С. 4—7.
8. Черешнев В. А., Кеворков Н. Н., Бахметьев Б. А. и др. // Второй Российский симпозиум по патофизиологии с международным участием. 9—12.10. — М., 2000. — С. 158.
9. Jerne N. K., Nordin A. A. // Science. — 1963. — Vol. 140, N 3565. — P. 405—407.
10. Ruiz M. R., Quinones A. G., Diaz N. L., Tapia F. J. // Br. J. Dermatol. — 2003. — Vol. 149, N 4. — Р. 731—738.
11. Yu Y. L., Chen I. N., Shen K. Y. et al. // Eur. J. Immunol. — 2009. — Vol. 39, N 9. — Р. 2482—2491.
Поступила 21.11.11
75
