CC BY
139
Ольга Вячеславовна Калинина1, Александр Стефанович Сингин2, Борис Александрович Фролов3, Алла Дмитриевна Железнова4, Александр Альбертович Штиль5
ФАРМАКОКИНЕТИКА МЕТОТРЕКСАТА В КОМБИНАЦИИ С ОРГАНОПРОТЕКТОРОМ МИЛИАЦИНОМ
1 Ассистент, кафедра патофизиологии Оренбургской государственной медицинской академии
(460000, РФ, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6)
2 Д. б. н., ведущий научный сотрудник, лаборатория молекулярно-биологических методов исследования НИИ канцерогенеза РОНЦ им.. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 Д. м. н., профессор, заведующий кафедрой патофизиологии Оренбургской государственной медицинской академии (460000, РФ, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6)
4 Ассистент, кафедра патофизиологии Оренбургской государственной медицинской академии
(460000, РФ, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6)
5 Д. м. н., заведующий лабораторией механизмов гибели опухолевых клеток НИИ канцерогенеза
РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адреса для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, лаборатория механизмов гибели опухолевых клеток,
Штиль Александр Альбертович; e-mail: shtilaa@yahoo.com 460000, РФ, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6., Оренбургская государственная медицинская академия, кафедра патофизиологии, Калинина Ольга Вячеславовна; e-mail: olgakalina78@mail.ru
В экспериментах на 135 мышах-самцах Fl(СВА х С57В16) изучена фармакокинетика метотрексата в сыворотке крови, ткани печени и селезенки в условиях его однократного внутрибрюшинного введения в комбинации с тритерпеноидом растительного происхождения милиацином. Выявлено, что милиацин не оказывает существенного влияния на биораспределение метотрексата. Таким образом, обнаруженное нами ранее гепато- и иммунопротекторное действие милиацина при комбинировании с метотрексатом не связано с изменением накопления метотрексата в крови и органах.
Ключевые слова: метотрексат, милиацин, тритерпеноиды, фармакокинетика.
Химиотерапия — один из наиболее важных методов лечения больных со злокачественными новообразованиями. Вместе с тем эффективность химиотерапии нередко ограничивается высокой общерезорбтивной токсичностью лекарственных препаратов. Данное положение в полной мере относится к одному из наиболее эффективных и широко применяемых в онкологической практике препарату метотрексату (МТХ) [1—3]. Способность МТХ вызывать миелодепрессию [4] и токсические поражения печени [4—7] затрудняет его использование в длительных курсах лечения. В связи с этим поиск средств, снижающих токсичность МТХ, представляется актуальным.
В предшествующих исследованиях нами показано, что тритерпеноид растительного происхождения ми-лиацин оказывает гепатопротекторное действие, а также уменьшает выраженность токсических нарушений
© Калинина О. В., Сингин А. С., Фролов Б. А., Железнова А. Д., Штиль А. А., 2009 УДК 615.277.3.015.2
в лимфоидных органах мышей при введении МТХ [8; 9]. Результаты этих исследований характеризуют перспективность использования данного тритерпеноида для снижения гепатотоксичности МТХ и повышения эффективности иммунореабилитации при его применении в клинике. Вместе с тем возможность комбинации ми-лиацина и МТХ должна быть подтверждена отсутствием негативного влияния тритерпеноида на противоопухолевую эффективность МТХ. В частности, требованием является отсутствие изменений биораспределения, метаболических превращений и выведения МТХ из организма при комбинировании с милиацином.
Цель настоящей работы — изучение фармакокинетики МТХ в комбинации с милиацином.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты выполнены на 135 мышах-самцах F1(СВА х С57В16), полученных из питомника РАМН «Столбовая». Животные разделены на 3 группы: I — мыши, получавшие МТХ, — группа сравнения (55 жи-
вотных); II — мыши, получавшие МТХ с последующим 3-кратным введением растворителя милиацина твина-21 в 0,9% растворе хлорида натрия (1,6 х 10-7 моль/кг), — контрольная группа (40 животных); III — мыши, получавшие МТХ с последующим 3-кратным введением милиа-цина, — опытная группа (40 животных).
Милиацин получен из кристаллов просяного масла, выпадающих при его отстаивании на холоде. Очистку препарата проводили путем его перекристаллизации из хлороформа. На основании результатов масс-спектрометрии, изучения ядерно-магнитно-резонансных и инфракрасных спектров, анализа хроматографической однородности и качественного состава выделенный препарат отнесен к группе пентациклических тритерпенои-дов, имеющих структуру 3Р-метоксигерманицена [10] (рис. 1).
МТХ («Эбеве», Австрия) вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 10 мг/кг. Милиацин вводили внутрибрюшинно в разовой дозе 2 мг/кг 3 раза: через 30 мин, 24 и 48 ч после введения МТХ. Кровь у животных I группы брали через 5, 15, 30 мин, 1, 3, 6, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после введения МТХ; у животных II и III групп — начиная с 1-го часа после введения МТХ, поскольку первые три точки отсчета для этих животных были индентичны таковым в I группе (сравнения). На отдельный временной срок в каждой группе животных использовали по 5 мышей. Животных забивали и отбирали пробы крови, печени и селезенки. Пробы от 5 животных объединяли для проведения хроматографического анализа в целях повышения чувствительности метода, особенно при определении концентрации МТХ через длительное время после его введения.
Сыворотку крови освобождали от белков путем добавления 63% хлорной кислоты (50 мкл на 500 мл сыворотки крови) с последующим центрифугированием при 5000 об./мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость собирали и хранили при температуре —20 °С до анализа. Ткани органов сразу после выделения помещали в морозильную камеру ^ = —20 °С). При подготовке к анализу эти ткани быстро размораживали в кипящей водяной
H3C СНз
Рисунок 1. Химическая структура пентациклического три-терпеноида — милиацина (3р-метокси-Д18-олеанена).
бане, навески (0,23—0,27 г) гомогенизировали в 500 мкл воды. Гомогенат переносили в пробирку с последующим тщательным смывом остатков гомогената 500 мкл воды. Белки в гомогенатах осаждали добавлением 100 мкл 63% хлорной кислоты и центрифугированием (5000 об./мин в течение 20 мин). Полученный супернатант подвергали анализу на хроматографе «Gilson» с ультрафиолетовым детектором при длине волны 313 нм. Колонка — Zorbax C8, 4,6 х 250 мм, подвижная фаза — ацетонитрил : вода (10 : 90), скорость потока 1 мл/мин, объем анализируемой пробы 50—100 мкл. Время удерживания МТХ составило 10—11 мин, чувствительность метода — 10—50 нг/мл образца.
Анализ образцов осуществляли по величине площади пика МТХ (S) на хроматограмме с помощью калибровочной кривой. При построении последней к 1 мл сыворотки крови крупного рогатого скота добавляли МТХ для получения следующих концентраций: 0,5, 1, 2, 3 и 5 мкг/мл. Анализ полученной кривой осуществлен с применением программы Statgraph. При этом неизвестную концентрацию (Сх) МТХ в образце определяли по уравнению:
С = 0,055 + 1,004 х 10-5S.
Фармакокинетический анализ проведен с применением программы WinNonLin.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Фармакокинетические параметры МТХ в сыворотке крови исследуемых животных представлены в таблице, а соответствующие фармакокинетические кривые — на рис. 2. Отмечено, что МТХ быстро всасывался в брюшной полости и поступал в кровоток. Максимальная концентрация МТХ в сыворотке крови животных всех исследуемых групп регистрировалась через 0,16—0,17 ч (Тт„), составляя соответственно (Cmax) 4,94 мкг/мл (I группа), 5,11 мкг/мл (II группа) и 4,98 мкг/мл (III группа). Таким образом, ни растворитель милиацина, ни сам милиацин не влияли на скорость всасывания МТХ в брюшной полости.
Полученные данные свидетельствуют о том, что быстрая фаза распределения МТХ в органах (T0,5a) также не зависит от последующего введения растворителя или милиацина, составляя для животных всех исследованных групп одинаковую величину 0,05 ч. В то же время МТХ из кровяного русла выводится достаточно медленно; соответствующие периоды его полувыведения (T0,5ß) находятся в пределах 29,6 ч (I группа), 25,9 ч (II группа) и 31,4 ч (III группа). О продолжительности удержания МТХ в организме свидетельствуют и величины MRT (mean residence time — среднее время удержания препарата в организме) в диапазоне от 24,8 ч (II группа) до 32,5 ч (I группа). Достоверных различий указанных показателей между группами мышей не выявлено.
Величины экспозиционной дозы (AUC) приблизительно одинаковы во всех исследуемых группах, составляя 13,5 мкг/мл х ч (I группа), 13,1 мкг/мл х ч (II группа) и 15,3 мкг/мл х ч (III группа). Таким образом, фармакокинетика МТХ в сыворотке крови не зависит от введения этого препарата в комбинации с твином-21 или милиаци-ном.
При исследовании фармакокинетических параметров МТХ в печени (см. таблицу; рис. 3) также выявлено отсутствие существенных различий между сравни-
м
і
m
о
.2 3
кг м í 2
мз
20 40 60 80 100 120
20 40 60 80 100 120
5
5
4
4
2
0
0
A
Б
В
Рисунок 2. Фармакокинетические кривые метотрексата в сыворотке крови мышей F1(СВА х С57В16).
А. При внутрибрюшинном введении. Б. При последующем введении растворителя для милиацина. В. При последующем введении милиацина.
ваемыми группами. В частности, для животных всех групп было характерно быстрое поступление препарата в печень: максимальные концентрации МТХ достигались уже через 15 мин (Ттах). Эти концентрации (Стах) достаточно высоки и составляют 35,4 мкг/г (I группа),
34,9 мкг/г (II группа) и 36,4 мкг/г (III группа).
Показатели выведения МТХ из печени оказались близкими по значениям. Соответствующие периоды по-лувыведения у животных I, II и III групп в быстрой фазе составили 0,36, 0,32 и 0,44 ч, в медленной фазе — 39,6,
35,9 и 31,4 ч соответственно. Важно, что вследствие высоких концентраций МТХ в печени величины АУС (со-
Таблица
Влияние милиацина на фармакокинетические параметры метотрексата в сыворотке крови, ткани печени и селезенки мышей F1(СВА X С57В16)
Фармакокинетический параметр Сыворотка крови Ткань печени Ткань селезенки
группы животных
I II III I II III I II III
T0,5a, ч 0,05 0,05 0,05 0,36 0,32 0,44 0,19 0,17 0,17
T0,5ß, ч 29,6 25,9 31,4 39,6 35,9 31,4 33,6 36,8 34,1
Kel, мин-1 0,31 0,39 0,33 0,62 0,78 0,53 0,35 0,32 0,36
MRT, ч 32,5 24,8 32,0 42,5 44,8 42,0 34,9 35,9 39,6
Vc, мл 5,0 4,5 4,6 - - - - - -
Cl, мл/мин 0,25 0,27 0,24 0,05 0,07 0,04 0,14 0,08 0,06
AUC, мкг/мл x ч (мкг/г x ч)а 13,5 13,1 15,3 110,0 83,3 93,4 34,5 35,7 38,6
Cmax, мкг/мл (мкг/г)а 4,94 5,11 4,98 35,4 34,9 36,4 15,4 15,8 15,6
Tmax, ч 0,17 0,16 0,16 0,26 0,23 0,24 - - -
AUC (area under curve) — площадь под фармакокинетической кривой; Cl — скорость выведения метотрексата из сыворотки крови; Cmax — максимальная концентрация метотрексата в сыворотке крови; Kel — константа скорости выведения; MRT (mean residence time) — среднее время удержания метотрексата в организме; Vc — объем распределения; То,5а — период полувыведения, соответствующий быстрой фазе распределения препарата по органам и тканям; To,5ß — период полувыведения метотрексата из организма; Tmax — время достижения максимальной концентрации. а В скобках указана размерность для ткани печени и селезенки.
з5
35
30
25
20
15
10
5
0
20 40 60 80 100 120
35
30
25
20
15
10
5
0
V
20 40 60 80 100 120
A
Б
В
Рисунок 3. Фармакокинетические кривые метотрексата в печени мышей F1(СВА х С57В16).
А. При внутрибрюшинном введении. Б. При последующем введении растворителя для милиацина. В. При последующем введении милиацина.
ответственно 110, 83,3 и 93,4 мкг/г х ч) были почти в 6 раз выше, чем в сыворотке крови.
Фармакокинетические параметры МТХ в селезенке представлены в таблице и на рис. 4. Максимальные концентрации МТХ в селезенке составили 15,4 мкг/г (I группа), 15,8 мкг/г (II группа) и 15,6 мкг/г (III группа), т. е. максимальная концентрация в селезенке в 2 раза ниже, чем в печени. Выведение исследуемого препарата из селезенки, как и из печени, осуществляется в 2 фазы. Периоды полувыведения для быстрой фазы (Т0,5а) составили соответственно 0,19, 0,17 и 0,17 ч, т. е. были гораздо короче, чем для печени. Продолжительность медленной фазы (T05ß) для селезенки (33,6, 36,8 и 34,1 ч) соответствовала таковой для печени. Параметры AUC у сравниваемых групп животных находились в пределах 34,5—38,6 мкг/г х ч, достоверных различий между группами не обнаружено.
Таким образом, тритерпеноид милиацин не оказывает существенного влияния на биораспределение МТХ
в сыворотке крови, ткани печени и селезенки мышей F1(CBA х С57В16). Это дает основание сделать вывод, что защитное действие милиацина на печень и систему иммуногенеза не связано с изменением фармакокинетики МТХ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Jahovic N. Cevik H., Schirli A. O. Melatonin prevents methotrexate — induced hepatorenal oxidative injury in rats // J. Pineal Res. — 2003. — Vol. 34, N 4. — P. 282—287.
2. Hepatotoxicity in patients with juvenile idiopathic arthritis receiving longterm methotrexate therapy / Lahdenne P., Rapola J., Yli-joki H., Haapasaari J. // J. Rheumatol. — 2002. — Vol. 29, N 11. — P. 2442—2445.
3. Lobo D., Balthasar J. P. Pharmacokinetic — Pharmacodynamic modeling of methotrexate — induced toxicity in mice // J. Pharmac. Sci-en. — 2003. — Vol. 92, N 8. — P. 1654—1664.
4. Петров Р. В., Манько В. М. Иммунодепрессоры (справочник). — М.: Медицина, 1971. — 299 с.
5. Role of liver function tests in detecting methotrexate-induced liver damage in sarcoidosis / Baughman R. P., Koehler A., Bejarano P. A.,
A
14 14
12 ‘ 12-
10 10-
мкг/г а мкг/г а
■ 6 и Стах, 6
4 4-
\ 2 V. 2 -
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
10 20 30 40 50 60 70 80
Б
В
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Рисунок 4. Фармакокинетические кривые метотрексата в селезенке мышей F1(СВА х С57В16).
А. При внутрибрюшинном введении. Б. При последующем введении растворителя для милиацина. В. При последующем введении милиацина.
6
4
Lower E. E., Weber F. L. // Arch. Intern. Med. — 2003. — Vol. 163, N 5. — P. 615—620.
6. N-acetylcysteine ameliorates methotrexate-induced oxidative liver damage in rats / Cetinkava A., Bulbuloglu E., Kurutas E., Kantarceken B. // Med. Sci. Monit. — 2006. — Vol. 12, N 8. — P. 274—278.
7. Garattini S. Pharmacokinetics in cancer chemotherapy // Eur. J. Cancer. — 2007. — Vol. 43. — P. 271—282.
8. Морфологические проявления защитного влияния милиацина в органах иммуногенеза при действии метотрексата / Желез-нова А. Д., Железнов Л. М., Штиль А. А., Фролов Б. А. // Бюл. экс-пер. биол. — 2007. — Т. 144, № 10. — С. 458—463.
9. Гепатопротекторное действие милиацина при токсическом поражении печени метотрексатом / Калинина О. В., Красиков С. И., Шехтман А. M., Штиль А. А., Фролов Б. А. // Рос. биотер. журн. — 2009. — T. В, № 1. — С. 48—54.
10. Химическая природа и биологическая активность милиацина / Олифсон Л. Е., Осадчая Н. Д., Нузов Б. Г., Галкович К. Г., Павлова M. M. // Вопр. питания. — 1991. — № 2. — С. 57—59.
Поступила 01.06.2009
Olga Vyacheslavovna Kalinina1, Alexander Stefanovich Singin2, Boris Alexandrovich Frolov3, Alla Dmitrievna Zheleznova4, Alexander Albertovich Shtil5
PHARMACOKINETICS OF METHOTREXATE IN COMBINATION WITH PROTECTOR MILIACIN
1 Assistant, Department of Pathophysiology, Orenburg State Medical Academy (6, ul. Sovetskaya, Orenburg, Russian Federation, 460000)
2 PhD, DSc, Leading Researcher, Laboratory of Molecular Biologic Study Methods, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478)
3 MD, PhD, DSc, Professor, Head, Department of Pathophysiology, Orenburg State Medical Academy (6, ul. Sovetskaya, Orenburg, Russian Federation, 460000)
4 Assistant, Department of Pathophysiology, Orenburg State Medical Academy (6, ul. Sovetskaya, Orenburg, Russian Federation, 460000)
5 MD, PhD, DSc, Head, Laboratory of Tumor Cell Death, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478)
Addresses for correspondence: Shtil Alexander Albertovich, Laboratory of Tumor Cell Death, Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin RCRC RAMS, 24, Kashirskoye sh., Moscow, Russian Federation, 115478;
e-mail: shtilaa@yahoo.com Kalinina Olga Vyacheslavovna, Department of Pathophysiology, Orenburg State Medical Academy, 6, ul. Sovetskaya, Orenburg, Russian Federation, 460000; e-mail: olgakalinina78@mail.ru;
Serum, liver and spleen methotrexate pharmacokinetics following single-dose intraperitoneal administration in combination with a vegetable triterpenoid, miliacin, was studied in 135 male mice Fi(CBA x C57Bl6). Miliacin had no considerable effect on methotrexate biodistribution. Therefore, the previously discovered hepato- and immunoprotective activity of miliacin in combination with methotrexate was not associated with changes in blood or organic accumulation of methotrexate.
Key words: methotrexate, miliacin, triterpenoids, pharmacokinetics.
