CC BY
79
УДК 616.36-006-06:615.099.092
O.V. Kalinina1, S.I. Krasikov1, A.M. Shechtman2, A.A. Shtil3, B.A. Frolov1
PROTECTION OF METHOTREXATE INDUCED LIVER TOXICITY
BY MILIACIN
1Orenburg Medical Academy, 2Regional Clinical Hospital, Orenburg 3N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
ABSTRACT
The changes in liver morphology and hepatic enzyme's activity in 406 male (CBA x C57Bl6) mice treated with the antitumor drug methotrexate have been studied. The non-toxic plant-derived triterpenoid miliacine markedly attenuated the hepatotoxic effects of methotrexate.
Key words: methotrexate, miliacin, triterpenoids, liver toxicity.
O.B. Калинина1, С.И. Красиков1, A.M. Шехтман2, A.A. Штиль3, Б.А. Фролов1*
ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ МИЛИАЦИНА ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ МЕТОТРЕКСАТОМ
1Оренбургская государственная медицинская академия, Оренбург; 2ГУЗ Оренбургская областная клиническая больница, Оренбург; 3ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН,
115478 Москва, Каширское ш., 24
РЕЗЮМЕ
B экспериментах на 406 мышах-самцах (CBA x C57Bl6)F1 изучены морфологическая реорганизация печени, динамика восстановления органных нарушений и активность ферментов печени при действии противоопухолевого препарата — метотрексата. Показано ослабление гепатотоксического эффекта метотрексата при использовании растительного тритерпеноида — милиацина.
Ключевые слова: метотрексат, милиацин, тритерпеноиды, гепатотоксичность
ВВЕДЕНИЕ
Гепатотоксичность метотрексата (МТ) [11; 12; 14; 15] ограничивает его использование в длительной терапии онкологических больных. В связи с этим актуален поиск средств, снижающих гепатотоксичность МТ [13]. Природные тритерпеноиды — нетоксичные соединения растительного происхождения — перспективны для защиты тканей от различных экзогенных повреждений [5]. Пентациклический тритерпено-ид — милиацин (получен из просяного масла [8]) стимулирует иммунный ответ [6], ограничивает гор-
мониндуцированный апоптоз лимфоцитов [9], проявляет антиоксидантную активность [10] и оказывает защитное влияние на органы иммуногенеза (тимус, селезенку, костный мозг) при действии МТ [4]. Цель настоящей работы — исследование влияния милиаци-на на структурно-функциональную реорганизацию печени и динамику восстановления органных нарушений у мышей, подвергшихся воздействию МТ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты выполнены на 406 мышах-самцах
*Штиль Александр Альбертович — д. мед. наук, лаборатория механизмов гибели опухолевых клеток НИИ канцерогенеза; тел. (499) 612 78 34, факс (495) 324 12 05; [email protected]
Калинина Ольга Вячеславовна — ассистент кафедры патофизиологии; тел 353 277 96 07 Красиков Сергей Иванович — д. мед. наук, заведующий кафедрой общей химии; тел 353 277 62 21 Шехтман Александр Михайлович — заведующий отделением патологии Фролов Борис Алексеевич — д. мед. наук, заведующий кафедрой патофизиологии
(СБА х С57В16^ь разделенных на 4 группы: I — ин-тактные мыши (24 животных); II — мыши, получавшие МТ — группа сравнения (137 животных); III — мыши, получавшие МТ с последующим 3-кратным введением растворителя милиацина — твина-21 в 0,9%-ном растворе хлорида натрия (1,6 х 10-7 моль/кг) — контрольная группа; IV (124 животных) — мыши опытной группы, получавшие МТ с последующим 3-кратным введением милиацина. МТ (10 мг/кг) вводили однократно внутрибрюшинно. Милиацин вводили внут-рибрюшинно в разовой дозе 2 мг/кг 3-кратно: через 1 ч после МТ и в последующие 2 дня. Растворитель вводили по аналогичной схеме. Животных выводили из эксперимента на 4-е, 7-е, 14-е и 21-е сут после введения МТ методом дислокации шейных позвонков с соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных». После взвешивания печень фиксировали в 10%-ном забуференном формалине и срезы органа окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрию проводили при увеличении микроскопа в 400 раз, определяли плотность гепатоцитов и количество двуядерных клеток по результатам подсчетов в 10 выборочных полях зрения (окулярная сетка 70 х 70 мкм) [1].
Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и у-глутамил-транспептидазы (у-ГТ) в сыворотке крови исследовали спектрофотометрически, используя стандартные наборы реактивов CORMAY. Желчные пигменты в моче определяли полуколичественным методом (тест-полоски ЖТО-РНАЫ, Lachema, Чехия). Данные обрабатывали стандартными методами вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по ^критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Введение МТ приводило к снижению массы печени на 4-е сут эксперимента (на 34,3 ± 3,9 % по сравнению с интактными животными) (табл. 1). В это время отмечено венозное полнокровие и очаговая дистрофия гепатоцитов с пикнотическим изменением ядер. Повышена плотность клеток (на 61,8 ± 1,6 % по сравнению с интактными животными). К 7-м суткам масса печени восстанавливается на фоне снижения плотности гепатоцитов, которая все еще превосходит (на 18,0 ± 1,8 %) исходную величину. Отмечены обширная гид-ропическая дистрофия гепатоцитов, немногочисленные очаги некроза и слабо выраженная инфильтрация паренхимы лейкоцитами. К 14-м сут описанные морфологические нарушения нарастали, достигая максимальных проявлений. В этот период плотность клеточного инфильтрата была минимальной, а дистрофия гепато-цитов приобретала диффузный характер с обилием очагов некроза и некробиоза в сочетании со значительной мелкоочаговой лейкоцитарной инфильтрацией паренхимы (рис. 1, А, Б). Отмечен отек межбалочного пространства. Существенно, что в этот период обнаружены двуядерные гепатоциты (см. табл. 1), что может свидетельствовать о регенерации печени. К 21-м сут регенераторные процессы приобретают более отчетливый характер и проявляются в нарастании плотности клеточного инфильтрата (на 25,9 ± 6,1 % по сравнению с интактными животными), увеличении количества двуядерных клеток (на 44,8 ± 4,5 %) и восстановлении компактного расположения гепатоцитов в центрах долек. Вместе с тем даже к указанному сроку у мышей данной группы сохранялись диффузные очаги гидро-пической дистрофии печени и некроза (рис. 2, Б).
Группы животных
Исследуемые показатели
Масса печени, мг Плотность клеток (в 1 поле зрения) Двуядерные клетки %
4 сутки 7 сутки 14 21 сутки 4 сутки 7 14 21 4 7 14 21
сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки
1232,4 ± 62,7 (7)* 80,72 ± 0,86 (5/50)** 7,6 ± 0,4 (5)
809,0± 1106,0± 1351,8± 1166,8± 130,62± 95,22± 61,72± 101,60± 7,56± 4,1± 5,52± 11,0±
43,7й 44,7 60,03 45,92,3 1,3012 1,5*,2 1,70х,2 4,891,2 0,5 0,112 0,51 0,341,2
(12) (20) (13) (12) (5/50) (5/50) (5/50) (5/50) (5) (5) (5) (5)
788,0± 1127,7± 1178,8± 1459,6± 122,44± 93,16± 64,26± 98,00± 7,33± 4,05± 5,48± 10,14±
29,0й 55,1 37,5 31,31,2 2,901,2 2,40*,2 2,80*,2 2,001,2 0,6 0,41,2 0,21 0,51,2
(9) (12) (11) (12) (5/50) (5/50) (5/50) (5/50) (5) (5) (5) (5)
1214,2± 1199,9± 1250,4± 1346,75± 80,62± 82,20± 77,12± 85,0± 6,23± 6,2± 6,5± 8,78±
40,3 23,3 74,9 20,9 0,80 0,60 1,31 2,15 0,31 0,321 0,5 0,31
(12) (15) (8) (12) (5/50) (5/50) (5/50) (5/50) (5) (5) (5) (5)
I интактные
II МТ
III МТ + растворитель
IV МТ + милиацин
*В скобках указано количество животных;
**в числителе указано количество животных, в знаменателе - количество исследованных полей зрения. 'Достоверно по сравнению с группой I (при р < 0,05); 2достоверно по сравнению с группой IV (при р < 0,05); 'достоверно при сравнении групп II и III (при р < 0,05).
Таблица 1
Влияние милиацина на весовые и клеточные показатели печени мышей (СВА х С57В1б)Р1, подвергнутых воздействию метотрексатом (М ± т)
Рис. 1. Морфологическое исследование печени мышей (CBA х C57Bl6)Fj на 14-е сут эксперимента:
А — I группа, ткань с сохраненной микроструктурой;
Б — II группа, диффузная гидропическая дистрофия, очаги некробиоза и некроза; В — III группа, диффузная гидропическая дистрофия, очаги некробиоза и некроза; Г — IV группа, очаговая гидропическая дистрофия, микронекрозы, двуядерные гепатоциты. Полутонкие срезы, окраска гематоксилином и эозином (х400).
Применение растворителя на фоне введения МТ (табл. 1, рис. 1, В, 2, В) не сказывалось на выраженности и динамике изменений массы органа, его морфологических и морфометрических параметров. Напротив, применение милиацина в комбинации с МТ су-
щественно повлияло на исследуемые показатели. Ми-лиацин предотвращал снижение массы органа; плотность клеточного инфильтрата не изменялась на протяжении 7 сут наблюдения (см. табл. 1). На 14-е сут этот показатель снижался лишь на 4,5 ± 1,6 % по
Рис. 2. Морфологическое исследование печени мышей (CBA х C57Blg)Fi на 21-е сут эксперимента:
А — I группа, ткань с сохраненной микроструктурой;
Б — II группа, очаговая гидропическая дистрофия, микронекрозы, двуядерные гепатоциты; В — III группа, очаговая гидропическая дистрофия, микронекрозы, двуядерные гепатоциты; Г — IV группа, ткань с сохраненной микроструктурой. Полутонкие срезы, окраска гематоксилином и эозином (х400).
сравнению с группой I, тогда как у животных II (снижение на 23,5 ± 2,1 %) и III групп (снижение на 20,4 ± 3,5 %) изменения соответствующих показателей более выражены. Нарушения структуры печени у животных,
получавших МТ и милиацин, отмечены с 7-х сут наблюдения и характеризовались очаговой гидропиче-ской дистрофией гепатоцитов преимущественно по периферии долек. К 14-м сут дистрофия приобретала
диффузный характер (рис. 1, Г) в сочетании с очагами микронекрозов и лейкоцитарной инфильтрацией. Однако эти изменения значительно менее выражены по сравнению с животными II и III групп. К 21-м сут структура печени у мышей IV группы восстанавливается (рис. 2, Г) на фоне возрастания количества дву-ядерных гепатоцитов (на 15,5 ± 3,5 % по сравнению с интактными мышами) (см. табл. 1).
Динамике морфологических показателей соответствовали результаты определения ферментемии у исследуемых животных (табл. 2). МТ вызывал резкое увеличение активности ферментов на 4-е сут после введения с превышением значений для интактных мышей в 4,5 раза (АлАТ); в 2,6 (АсАТ) и 1,8 раз (у-ГТ). К 7-м сут отмечено снижение исследуемых показателей с превышением уровня у интактных животных в 4,1 (АлАТ); в 2,0 раза (АсАТ) и 1,6 раза (у-ГТ). В последующие сроки (14-е и 21-е сут) активность ферментов продолжала снижаться, однако даже к концу наблюдения активность АлАТ и АсАТ превосходила таковую у интактных мышей соответственно на 45,2 ± 4,83 % и 23,6 ± 4,80 % (р<0,05). Восстановление активности у-ГТ регистрировалось уже на 14-е сут эксперимента.
Аналогичный характер носили сдвиги активности исследуемых ферментов и в группе животных, получавших МТ и растворитель (группа III). Динамика нарастания гиперферментемии и ее выраженность идентичны таковым в группе II. У животных, получавших МТ и милиацин (группа IV), активность АлАТ и АсАТ нарастала медленно, достигая пика лишь на 7-е сут. Гиперферментемия существенно менее выражена: максимальный прирост активности АлАТ и АсАТ по сравнению с интактными животными составил соответственно 73,7 ± 8,6 % и 28,2 ± 8,6 %. Активность у-ГТ не повышалась. Наконец, отмечалась и более быстрая нормализация АлАТ и АсАТ, которая у животных дан-
ной группы регистрировалась к 21-м сут.
Повреждение печени под влиянием МТ (группа II) проявлялось на 4-е сут наблюдения появлением прямого билирубина и уробилиногена в моче соответственно у 100 % и 93,3 % исследованных животных (табл. 3). К 7-м сут наблюдения частота выявления обоих желчных пигментов составляла 100 % при количественном нарастании их содержания, которое к указанному сроку достигало максимума. Начиная с 14-х сут отмечалось обратное развитие обнаруженных сдвигов, характеризовавшееся снижением частоты обнаружения уробилиногена (на 25,0 %), а также уменьшением уровня прямого билирубина (на 25,0 %) и уробилиногена (на 46,0 %) в моче по сравнению с предшествующим сроком. Такая динамика сохранялась до конца наблюдения (21 сут), когда показатели частоты обнаружения билирубина (58,3 %) и уроби-линогена (37,5 %), как и их средние содержания у животных данной группы, были минимальными. Комбинация «растворитель+МТ» (группа III) не влияла на частоту обнаружения, содержание желчных пигментов и их динамику, по сравнению с группой II. Ми-лиацин же вызывал выраженный защитный эффект, характеризовавшийся значительно меньшей частотой обнаружения прямого билирубина и уробилиногена. Менее значимым оказалось и повышение содержания желчных пигментов. На 7-е сут билирубинурия в группе IV была ниже по сравнению с группами II (на 34,6 %) и III (на 41,1 %). Содержание уробилиногена к 7-м сут составляло 38,9 % от показателя в группе II и 34,6 % от группы III (р < 0,05).
Таким образом, гепатотоксическое действие МТ носит продолжительный характер с наибольшей выраженностью некробиотических изменений к концу 2-й нед после введения препарата. Регенераторные процессы выявляются с 14-х сут и достигают максимальной выраженности к 21-м сут. Плотность клеточного ин-
Таблица 2
Влияние милиацина на показатели ферментемии в сыворотке крови мышей (СВА х С57В1б)Р1, подвергнутых воздействию метотрексатом (М ± т)
Группы жи- Исследуемые показатели
вотных АлАТ, ед/л АсАТ, ед/л у-ГТ, ед/л
4 сутки 7 сутки 14 21 4 сутки 7 сутки 14 21 4 7 14 21
сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки сутки
I интактные 33,43 ± 3,41 (14)* 118,60 ± 10,53 (14) 3,19 ± 0,28 (11)
II МТ 149,01± 137,79± 65,67± 48,52± 307,10± 230,99± 198,22± 146,60± 5,63± 4,97± 3,27± 3,05±
25,411,2 9,391,2 5,291,2 1,6112 32,481,2 18,131,2 13,451,2 5,63^2 1,091 0,882 0,58 0,53
(8) (9) (8) (19) (8) (9) (8) (19) (8) (8) (8) (19)
III МТ + 188,40± 123,36± 73,96± 46,06± 328,14± 220,19± 204,85± 152,63± 5,31± 4,88± 3,11± 2,87±
растворитель 28,421,2 9,371,2 8,911,2 3,221 26,201,2 11,041,2 9,921,2 11,211 0,82! 0,55^2 0,66 0,51
(10) (12) (9) (11) (10) (12) (9) (11) (8) (12) (10) (11)
IV МТ + 42,99± 58,07± 47,64± 38,91± 122,77± 152,05± 153,56± 128,10± 3,94± 2,79± 3,15± 2,56±
милиацин 4,17 2,86' 2,871 1,98 12,0 10,17х 9,56! 6,82 0,60 0,35 0,41 0,43
(10) (9) (9) (17) (10) (9) (9) (17) (10) (8) (9) (14)
*В скобках указано количество животных.
'Достоверно по сравнению с группой I (при р < 0,05);
2достоверно по сравнению с группой IV (при р < 0,05).
Таблица 3
Влияние милиацииа на содержание желчных пигментов в моче у мышей (СВА х С^В^^, подвергнутых воздействию метотрексатом (М ± т)
Группы Билирубин, усл. ед.
животных 4 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки
Частота Среднее Частота Среднее Частота Среднее Частота Среднее
обнаруже- содержание обнаруже- содержание обнаруже- содержание обнаруже- содержа-
ния, % среди животных с положительной пробой ния, % среди животных с положительной пробой ния, % среди животных с положительной пробой ния, % ние среди животных с положительной пробой
I интактные Не определяется (17)1 Не определяется (17) Не определяется (17) Не определяется (17)
II МТ 100,0* 1,73+0,2* 100,0* 2,0+0,15* 100,0* 1,5+0,15* 58,3 1,0+0
(15/15)2 (15)3 (14/14) (14) (12/12) (12) (24/14) (14)
III МТ + 92,9 1,62+0,14* 100,0* 2,22+0,15* 100,0* 1,43+0,14* 56,3 1,0+0
раствори- (14/13) (13) (18/18) (18) (14/14) (14) (16/9) (9)
тель
IV МТ + 71,4 1,1+0,1 68,4 1,3+0,13 64,3 1,0+0 41,2 1,0+0
милиацин (14/10) (10) (19/13) (13) (14/9) (9) (17/7) (7)
Уробилиноген, мг/дл
I интактные Не определяется (17) Не определяется (17) Не определяется (17) Не определяется (17)
II МТ 93,3 1,43+0,23 100* 2,57+0,47* 75,0* 1,44+0,29 38 1,0+0
(15/14) (14) (14/14) (14) (12/9) (9) (24/9) (9)
III МТ + 92,3 1,76+0,28* 100* 2,89+0,46* 78,6* 1,36+0,24 43,8 1,0+0
раствори- (14/13) (13) (18/18) (18) (14/11) (11) (16/7) (7)
тель
IV МТ + 64,2 1,0+0 36,8 1,0+0 35,7 1,0+0 29,4 1,0+0
милиацин (14/9) (9) (19/7) (7) (14/5) (5) (17/5) (5)
количество интактных животных;
2в числителе указано количество животных, в знаменателе — количество животных с положительной пробой;
'количество животных с положительной пробой.
*Достоверно по сравнению с показателями животных группы IV, при р < 0,05.
фильтрата наибольшая на 4-е и 21-е сут наблюдения. Вероятно, 1-й пик обусловлен апоптозом гепатоцитов, их атрофией и сморщиванием. Основаниями для такого предположения служат возможность апоптоза медленно пролиферирующей популяции клеток печени [3] и невысокая скорость развития гибели гепатоцитов [7]. Возрастание плотности клеточного инфильтрата на 21-е сут обусловлено клеточной гиперплазией, о чем свидетельствует увеличение количества двуядерных гепатоцитов.
Механизм гепатотоксического действия МТ связывают с индукцией свободнорадикального окисления [12; 13] и повышением проницаемости клеточных мембран. Проявлением нарушения проницаемости сарколеммы могут служить опережающие (по отношению к некробиотическим изменениям) гиперфер-ментемия и билирубинурия (максимальные значения соответственно на 4-е и 7-е сут). Регистрируемые при этом менее значимый подъем и более быстрая нормализация у-ГТ по сравнению АлАТ и АсАТ обусловлены, по всей вероятности, прочной связью у-ГТ с клеточной мембраной, что ограничивает выход фермента в межклеточное пространство при повреждении по-
следней [2]. Вместе с тем полученные данные характеризуют нарушение стабильности под влиянием МТ и внутриклеточных структур: МТХ и микросом. В пользу этого свидетельствуют возрастание активности АсАТ (являющейся не только цитозольным, но и ми-тохондриальным ферментом), а также уробилинурия, отражающая несостоятельность ферментов микросо-мального окисления в расщеплении мезобилиногена до моно- и дипирролов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Милиацин способствует регрессии морфологических нарушений, значительно ослабляет гиперфер-ментемию и нарушения пигментного обмена, а также стимулирует регенерацию печени. Защитное действие тритерпеноида могло обеспечиваться его антиокси-дантным эффектом и стабилизацией клеточных мембран [10]. Полученные результаты обусловливают необходимость дальнейшего детального исследования механизмов защитного влияния милиацина и открывают новые возможности его практического использования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г.Г. Морфометрия в патологии. -М.: Медицина, 1973. - 248 с.
2. Ашмарин И.П., Антипенко А.Е., Ашапкин В.В. и др. Нейрохимия. - М.: Изд-во Института Биомедицинской химии РАМН, 1996. - 470 с.
3. Белушкина H.H., Северин С.Е. Молекулярные основы патологии апоптоза // Архив патологии. -2001. - № 1. - С. 51-60.
4. Железнова А.Д., Железное Л.М., Штиль А.А., Фролов Б.А. Морфологические проявления защитного влияния милиацина в органах иммуногенеза при действии метотрексата // Бюлл. эксп. биол. мед. 2007. - Т. 144, № 10 - С. 458-463.
5. Жукова Н.А., Семенов Д.Е., Сорокина И.В. и др. Влияние бетулиновой кислоты и ее производного [3-оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовой кислоты на структуру печени мышей с лимфомой RLS // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2005. - Т. 140, № 9. - С. 348-351.
6. Кириллова А.В., Скачков М.В., Панфилова Т.В. и др. Стимуляция иммунитета к столбнячному анатоксину милиацином // Эпидемиология и вакцино-профилактика. - 2003. - № 6. - С. 36-38.
7. Лушников Е.Ф., Абрамов А.Ю. Морфология клетки (Апоптоз). - М.: Медицина, 2001. - 192 с.
8. Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Химическая природа и биологическая активность ми-лиацина // Вопросы питания. - 1991. - № 2. - С. 57-59.
9. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Полосухина Е.Р. и др. Влияние тритерпеноида милиацина на чувстви-
тельность лимфоцитов тимуса и селезенки к апоптозу, индуцированному дексаметазоном // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2003. - Т. 136, № 10. - С. 382-385.
10. Панфилова Т.В., Штиль А.А., Фролов Б.А. Тритерпеноид милиацин снижает индуцируемое стрессом ПОЛ // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2006. - Т. 141, № 6. - С. 633-635.
11. Baughman R.P., Koehler A., Bejarano P.A. et al. Role of liver function tests in detecting methtrexate-induced liver damage in sarcoidosis // Arch. Intern. Med. - 2003. - Vol. 163, № 5. - P. 615-620.
12. Cetinkava A., Bulbuloglu E., Kurutas E. et al. N-acetylcysteine ameliorates methotrexate-induced oxidative liver damage in rats // Med. Sci. Monit. - 2006. -Vol. 12, № 8. - P. 274-278.
13. Jahovic N. Cevik H., Schirli A.O. Melatonin prevents methotrexate-induced hepatorenal oxidative injury in rats // J. Pineal Res. - 2003. - Vol. 34, № 4. -P. 282-287.
14. Lahdenne P., Rapola J., Ylijoki H. et al. Hepato-toxicity in patients with juvenile idiopathic arthritis receiving longterm methotrexate therapy // J. Rheumatol. -2002. - Vol. 29, № 11. - P. 2442-2445.
15. van Outrvve S., Schrijvers D., van den Brande et al. Methotrexate-associated liver toxicity in a patient with breast cancer: case report and literature review // Neth. J. Med. - 2002. - V. 60. - № 5. - P. 216-222.
Поступила 04.04.2008.
