CC BY
12© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Б.А.Фролов, И.Н.Чайникова, Ю.В.Филиппова,
A.И.Смолягин, Т.В.Панфилова, А.Д.Железнова
МЕХАНИЗМЫ РЕАЛИЗАЦИИ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ МИЛИАЦИНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ: ВЛИЯНИЕ НА ЭНДО-ТОКСИНЕМИЮ И ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ
Оренбургская государственная медицинская академия
Цель. Оценка влияния милиацина на выраженность эндотоксинемии и особенности продукции цитокинов при экспериментальной сальмонеллезной инфекции. Материалы и методы. Исследования выполнены на 128 мышах-самцах (CBAxC57Bl6)F1, разделенных на 4 группы: I — интактные; II — зараженные; III — зараженные после введения растворителя для милиацина: твин 21; IV — зараженные после введения милиацина. Определение эндотоксина в плазме крови проводили с помощью хромогенного LAL-теста. Продукцию цитокинов изучали в культуре спленоцитов методом ИФА. Результаты. Милиацин снижал выраженность эндотоксинемии у мышей IV группы. Сальмонеллезная инфекция повышала спонтанную (у-ИНФ) и индуцированную (ИЛ-12, у-ИНФ, ИЛ-17) продукцию ци-токинов. Милиацин обеспечивал наиболее значимое увеличение спонтанной продукции ИЛ-10, ИЛ-12 и у-ИНФ по сравнению со II и III группами. В то же время, он ограничивал прирост индуцированной продукции ИЛ-17 по сравнению со II и III группами. Заключение. Защитное действие милиацина обусловлено снижением эндотоксинемии, мобилизацией Th-1 ответа, стимуляцией продукции ИЛ-10 и ограничением участия ИЛ-17 в развитии воспалительной реакции.
Журн. микробиол., 2014, № 5, С. 8—12
Ключевые слова: сальмонеллезная инфекция, эндотоксинемия, милиацин, цитокины
B.A.Frolov, I.N.Chainikova, Yu.V.Filippova, A.I.Smolyagin, T.V.Panfilova, A.D.Zheleznova
MECHANISMS OF REALIZATION OF PROTECTIVE EFFECT OF MILIACIN DURING EXPERIMENTAL SALMONELLA INFECTION: EFFECT OF ENDOTOXINEMIA AND CY-TOKINE PRODUCTION
Orenburg State Medical Academy, Russia
Aim. Evaluate the effect of miliacin on the intensity of endotoxinemia and features of cytokine production in experimental salmonella infection. Materials and methods. The studies were carried out in 128 male mice (CBAxC57Bl6)F1 divided into 4 groups: I — intact; II — infected; III — infected after administration of miliacin solvent: tween-21; IV — infected after administration of miliacin. Determination of the endotoxin in blood plasma was carried out by using chromogenic LAL-test. Cytokine production was studied in splenocyte culture by EIA method. Results. Miliacin reduced the intensity of endotoxinemia in mice of group IV. Salmonella infection increased spontaneous (IFNy) and induced (IL-12, IFNy, IL-17) cytokine production. Miliacin ensured the most significant increase ofspontaneous IL-10, IL-12 and IFNy production compared with groups II and III. At the same time it limited the increase of induced IL-17 production compared with groups II and III. Conclusion. Protective effect of miliacin is determined by the reduction of endotoxinemia, mobilization of Th-1 response, stimulation of IL-10 production and limitation of IL-17 participation in the development of the inflammatory reaction.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 5, P. 8—12
Key words: salmonella infection, endotoxinemia, miliacin, cytokines
ВВЕДЕНИЕ
Установленная ранее способность милиацина ослаблять тяжесть течения экспериментальной сальмонеллезной инфекции [8] обусловила необходимость исследования механизмов, лежащих в основе протективного действия тритерпеноида. В настоящее время в качестве универсального фактора патогенеза заболеваний как инфекционной, так и неинфекционной природы рассматривается повышенный уровень эндотоксина в системной циркуляции [2, 4 — 6]. Являясь детерминантой патологического процесса, эндотоксинемия на местном и системном уровне мобилизует ответные реакции организма, среди которых наиболее значимая роль принадлежит воспалению и иммунному ответу [1]. В свою очередь, известно, что оба этих процесса приоритетно регулируются цитокинами. Данные представления обосновывают целесообразность изучения влияния милиацина на эндотоксинемию и продукцию цитокинов как возможных мишеней при реализации его защитного действия.
Целью настоящей работы являлась оценка влияния милиацина на выраженность эндотоксинемии и особенности продукции цитокинов при экспериментальной саль-монеллезной инфекции.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования выполнены на 128 мышах-самцах (CBAxC57Bl6)Fi массой 22 — 25 г из питомника «Столбовая» РАМН. Эксперименты проведены в соответствии с рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными. Эвтаназию мышей осуществляли дислокацией шейных позвонков или декапитацией под эфирным наркозом.
Заражение животных выполняли внутрибрюшинным введением госпитального штамма Salmonella enteritidis в дозе 2х106 бактерий на мышь.
Пентациклический тритерпеноид милиацин: 3^-метокси-А18-олеанен вводили трехкратно внутрибрюшинно с интервалами в 3 дня между введениями в разовой дозе 2 мг/кг. Заражение животных проводили через 24 часа после последнего введения тритерпеноида.
Использовано 4 группы животных: I — интактные (положительная группа сравнения); II — зараженные (отрицательная группа сравнения); III — зараженные после предварительного трехкратного введения растворителя для милиацина: твин 21 в конечной концентрации 1,6х10-7 моль/кг (контроль); IV — зараженные после предварительного введения милиацина (опыт). Животных II — IV групп выводили из эксперимента на 10 сутки после заражения — в период, соответствующий наибольшей микробной обсемененности их внутренних органов [8]. В эти же сроки осуществляли эвтаназию интактных мышей.
Определение эндотоксина в плазме крови мышей проводили с помощью хромо-генного LAL-теста по конечной точке, основанного на способности эндотоксинов грамотрицательных бактерий активировать сериновые протеазы в лизате амебоцитов Limulus с последующим отщеплением хромофора: р-нитроанилина от хромогенного субстрата с развитием желтого окрашивания. Интенсивность последнего после остановки реакции измеряли на фотометре «Multiskan» (Labsystems, Финляндия) при длине волны 405 нм. Количественное содержание эндотоксина в исследуемых пробах рассчитывали с помощью стандартной кривой, полученной при использовании серийных разведений референс-эндотоксина, и выражали в ЕД/мл. Выполнение данных исследований осуществляли с использованием наборов НЫ LAL (Hycult biotech, Нидерланды).
Продукцию цитокинов изучали в культурах спленоцитов после 48-часовой инкубации клеток (2х106) при 37°C в атмосфере 5% СО2 в полной культуральной среде RPMI-1640 с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотке (Sigma, США) и 80 мкг/мл гентамицина. Оценивали спонтанную и индуциро-
ванную Кон А (5мкг/мл) продукцию ИЛ-12, у-ИФН, ИЛ-17, ИЛ-10 и ИЛ-4 путем определения их содержания в супернатантах культур спленоцитов методом ИФА («Bender MedSystems», Австрия).
Статистическую обработку данных проводили методами вариационной статистики из пакета прикладных программ Microsoft Excel и Statistica 10 [7] с оценкой различий между средними величинами по t-критерию Стьюдента. Статистические результаты выражали в виде медианы (Ме), нижних (Q25) и верхних (Q75) квартилей. Уровень статистической значимости различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия считались статистически достоверными при р<0,05.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Установлено, что сальмонеллезная инфекция (группа II) обусловливает значимое возрастание содержания эндотоксина в плазме крови зараженных мышей, уровень которого на 10 сутки после заражения (0,31±0,037 ЕД/мл) превосходит показатель, определяемый у интактных (группа II) животных (0,111+0,047 ЕД/мл) в 2,8 раза. Использование растворителя, предшествовавшее заражению (группа III), не оказало влияния на выраженность эндотоксинемии (0,324+0,043 ЕД/мл). Предварительное введение милиацина (группа IV), напротив, обеспечивало существенное снижение эндотоксинемии по отношению к другим группам зараженных животных: II (на 35,5%) и III (на 38,3%) до уровня (0,200+0,033 ЕД/мл), превосходящего показатель интактных мышей (группа I) лишь в 1,8 раза.
Данные о влиянии милиацина на спонтанную и индуцированную продукцию ци-
Влияние милиацина на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов токинов сплен°цитами спленоцитами мышей (CBAxC57Bl6)F1 при сальмонеллезной инфекции различнЫХ групп инфи-
цированных животных представлены в табл. Как следует из табл., сальмонеллезная инфекция (группа II) характеризуется повышением способности спленоцитов в системе in vitro как к спонтанной (у-ИФН), так и к индуцированной (ИЛ-12, у-ИФН, ИЛ-17) продукции цито-кинов по сравнению с аналогичной продукцией культурой спле-ноцитов от интактных мышей (группа I). Ин-фек ци онный процесс со провождается также повышением митоге-ниндуцированной продукции ИЛ-10. Содержание ИЛ-4 в культу-ральной среде нести-мулированных сплено-
Примечание. * р<0,05 с группой I, р<0,05 между группами IV и III, I — интактные, II — заражение, III — растворитель+заражение, IV цитов от зараженных — милиацин+заражение. мышей (группа II) со-
Срок Продукция цитокинов
Группы наблюдения спонтанная индуцированная
(сутки) МС (Q25-Q75) n МС (Q25-Q75) n
ИЛ- 12
I — 6,48 (0,03- 8,89) 8 8,81 (53,5— 10,41) 8
II 10 16,96 (6,22— -20,65) 11 33,63* (17,25 —51,75) 11
III 10 14,26 (9,5— 17,78) 11 28,14*(19,31 —52,28) 11
IV 10 30,82* (20,43 —50,77) 10 38,64* (27,7— 48,16) 10
у-ИФН
I — 6,03 (3,86— 11,08) 10 23,32 (20,38— 31,41) 10
II 10 24,60* (19,69 —31,9) 11 369,8* (234,3 —843,9) 11
III 10 17,38 (15,20— 22,79) 11 395,1* (256,1 —460,5) 11
IV 10 35,36*° (33,79 —38,53) 10 296,65* (256,1 —880,8) 10
ИЛ- 17
I — 3,88 (2,87— 4,80) 8 5,40 (4,71 — 6,28) 8
II 10 3,85 (1,34— 6,02) 11 54,50* (27,15 —60,20) 11
III 10 2,67 (0,28— 4,51) 11 51,37* (24,53 —101,4) 11
IV 10 4,30 (0,36— 5,89) 10 38,70* (16,67 —52,21) 10
ИЛ- 10
I — 4,93 (1,50— 5,97) 8 5,19 (4,33— 5,81) 8
II 10 5,1 (3,11— 5,86) 11 22,95* (17,63 —32,69) 11
III 10 7,14 (0,94— 9,24) 11 9,48 (6,87— 25,29) 11
IV 10 9,42* (7,21 — 10,81) 10 30,54* (20,43 —50,77) 10
ИЛ-4
I — 1,64 (1,27— 1,89) 8 20,11(11,63— 30,85) 8
II 10 1,56 (1,41— 2,02) 11 9,13 (2,53— 12,68) 11
III 10 1,42 (1,12— 1,67) 11 2,96* (2,15— 3,67) 11
IV 10 1,37 (1,24— 2,01) 10 3,48*(3,38— -3,76) 10
ответствовало значениям, определяемым для спленоцитов от неинфицированных животных (группа I). Вместе с тем, заражение характеризовалось четкой тенденцией к снижению индуцированной продукции данного цитокина (в 2 раза).
Введение растворителя, предшествовавшее заражению (группа III), не оказало влияния на направленность и выраженность изменений (по сравнению с группой II) спонтанной и митогениндуцированной продукции ИЛ-12, у-ИФН и ИЛ-17. Однако оно сопровождалось уменьшением стимулированной продукции ИЛ-10 (по отношению к группе II) и ИЛ-4 (по отношению к группам I и II).
Использование милиацина (группа IV) не отменяло стимулирующей направленности влияния самой инфекции на продукцию ИЛ-12 и у-ИФН. Более того, милиацин обеспечивал наиболее значительный прирост их спонтанной продукции среди всех групп зараженных мышей. В отношении митогениндуцированной продукции данных цитокинов стимулирующего действия тритепреноида не наблюдали. Применение милиацина обусловливало также наиболее высокие показатели спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-10. В отношении ИЛ-17 эффект милиацина носил противоположную направленность, а именно, в сторону не усиления, а ограничения прироста его митогениндуцированной продукции до минимальных значений по отношению к другим группам зараженных животных. Спонтанная продукция ИЛ-4 спленоцитами мышей IV группы не менялась, а индуцированная — характеризовалась его низким содержанием на уровне значений контроля (III группа).
ОБСУЖДЕНИЕ
Снижение выраженности эндотоксинемии у инфицированных животных под влиянием милиацина может отражать один из значимых механизмов его защитного действия. Наиболее очевидным объяснением такого эффекта тритерпеноида является снижение бактериальной нагрузки [8] в виде уменьшения микробной обсеменен-ности внутренних органов у животных опытной группы (IV) по отношению к контролю (III) и отрицательной группе сравнения (II). Вместе с тем, очевидно, что выраженность эндотоксинемии обусловлена не только поступлением эндотоксина в системную циркуляцию, но и возможностью его элиминации из крови. Последняя в наибольшей степени определяется активностью макрофагальной системы печени — клеток Купфера, характеризующихся высокой экспрессией рецепторов к ЛПС — TLR4 [14]. Клиренсную функцию выполняют и клетки печеночной паренхимы, в которые эндотоксин переносится ЛПВП, после чего подвергается лизосомальному процессингу и выведению с желчью [5]. Принимая во внимание полученные ранее данные [3] о способности милиацина оказывать гепатопротекторный эффект, в том числе и в отношении клеток Купфера, представляется вероятным, что влияние три-терпеноида реализовывалось в отношении этих механизмов антиэндотоксиновой защиты печени.
Увеличение продукции ИЛ-12 и у-ИФН спленоцитами инфицированных животных, прежде всего, свидетельствует о том, что сальмонеллезная инфекция стимулирует ТИ-1 зависимый иммунный ответ. Снижение на этом фоне ИЛ-4 — показателя активации ТИ-2 клеток отражает реципрокные отношения между данными субпопуляциями Т-лимфоцитов и подтверждает существующие представления о значимости клеточных механизмов иммунной защиты при этой патологии [9, 12]. Милиацин усиливает мобилизацию этих клеточных механизмов в виде дальнейшего увеличения спонтанной продукции ИЛ-12 и у-ИФН. Отсутствие значимого прироста их индуцированной продукции спленоцитами животных опытной группы (IV) по отношению к контролю (III) и отрицательной группе сравнения (II) могло отражать эффект митогенной стимуляции, выравнивающий продуктивный потенциал клеток для данных цитокинов.
Возрастание под влиянием милиацина спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-10 можно расценивать как проявление ауторегуляторной функции иммунной системы в виде включения супрессорного фактора (ИЛ-10), лимитирующего избы-
точную цитотоксичность и соответственно выраженность иммунного воспаления через включение апоптотического механизма гибели активированных Т-клеток [13].
Понижающий эффект милиацина в отношении ИЛ-17 мог быть обусловлен стимулирующим действием тритерпеноида на продукцию ИЛ-12, лимитирующего продукцию другого представителя данного семейства цитокинов — ИЛ-23, имеющего с ИЛ-12 общую субъединицу (р40). Очевидно, что при такой конверсии на фоне активации под действием ИЛ-12 Th-1 хелперов — источников у-ИФН, дефицит ИЛ-23 ограничил бы индукцию Th-17 хелперов — источников ИЛ-17. Этот вопрос остается открытым. Однако в любом случае снижение продукции ИЛ-17 выступает существенным механизмом защитного действия милиацина через ограничение участия данного цитокина в стимуляции синтеза провоспалительных цитокинов, а также в мобилизации гранулоцитов, поддерживающих остроту воспалительной реакции и отражающих специфику Th-17 опосредованного воспаления [10, 11].
ЛИТЕРАТУРА
1. Бондаренко В.М., Лиходед В.Г., Яковлев М.Ю. Определение эндотоксина грамотри-цательных бактерий в крови человека. Журн. микробиол. 2002, 2: 83-89.
2. Зюзина В.П., Демидова Г.В., Соколова Е.П. и др. Эндотоксиновая толерантность мышей к действию липополисахарида и комплекса липополисахарид-мышиный токсин вирулентного штамма Yersinia pestis 231. Журн. микробиол. 2013, 5: 74-80.
3. Калинина О.В., Красиков С.И., Шехтман А.М. и др. Гепатопротекторное действие милиацина при техническом поражении печени метотрексатом. Росс. биотерапевт. журн. 2009, 8 (1): 48-54.
4. Лиходед В.Г., Аниховская И.А., Аполлонин А.В. Fc-зависимое связывание эндотоксинов грамотрицательных бактерий полиморфноядерными лейкоцитами крови человека. Журн. микробиол. 1994, 2: 76-79.
5. Панченко Л.Ф., Пирожков С.В., Теребилина Н.Н. и др. Механизмы антиэндотоксино-вой защиты печени. Пат.физиол. и эксп.терапия. 2012. 2: 62-69.
6. Петухов В.А., Магомедов М.С. Современный взгляд на проблему эндотоксиновой агрессии и дисфункции эндотелия в хирургии. Хирургия, реанимация и интенсивная терапия. 2008, 2: 37-46.
7. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ «Статистика». М., Медиа Сфера, 2012.
8. Фролов Б.А., Чайникова И.Н., Железнова А.Д. и др. Защитный эффект милиацина при экспериментальной сальмонеллезной инфекции. Журн. микробиол. 2013, 6: 3-8.
9. Чайникова И.Н. Инфектологическая характеристика сальмонеллеза. Автореф. дисс. д-ра.мед.наук. Оренбург, 2006.
10. Damsker J.M., Hansen A.M., Caspi R.R. Th1 and Th17 cells: adversaries and collaborators. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2010, 1183: 211-221.
11. Fossiez F., Djossou O., Chomarat P. et al. T cell interleukin-17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines. J. Exp. Med. 1996, 183: 2593-2603.
12. Lessard M., Hutckings D.L., Spencer J.L. Cell-mediated and humoral immune responses in chickens infected with Salmonella typhimurium. Avian Dis. 1995, 39: 230-238.
13. Liu Y.Y. Sun L.C., Wei J.J. et al. Tumor cell-released TLR4 ligands stimulate Gr-1+CD11b+F4/80+ cells to induce apoptosis of activated T cells. J. Immunol. 2010, 185 (5): 2773-2782.
14. Lu Z., Li M., Qiu Q. et al. Effect of antimicrobial agents on the toll-like receptors and inflammatory cytokines in liver tissue on the alcohol-induced liver disease in rats with Vibrio vulnificus sepsis. Chinese Med. J. 2009, 122 (16): 1910-1916.
Поступила 27.02.14
Контактная информация: Смолягин Александр Иванович, д.м.н., проф., 460000, Оренбург, ул. Советская, 6, р.т. (3532)77-71-72
