CC BY
146
УДК 597.67 А. Э. Эльхедми
ЗАЩИТА ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ОТ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПОРЧИ
Ключевые слова: пищевые продукты, микробиологическая порча, бактерии, бактериофаги.
Изучена способность бактериофагов, специфичных к бактериям рода Pseudomonas, предотвращать микробиологическую порчу белоксодержащих пищевых продуктов не подвергавшихся тепловой обработке (говядины, свинины, птицы и рыбы). Показано, что бактериофаги защищают указанные продукты от микробиологической порчи под действием бактерий-хозяев, а также свободно развивающейся микробиоты.
Keywords: foods, microbiological spoilage, bacterial, bacteriophages.
The article has been studied the ability of bacteriophages, specific to bacteria of the genus Pseudomonas to prevent microbiological spoilage of protein-containing food products not subjected to heat treatment (beef, pork, poultry and fish). It is shown that bacteria protects these products from microbiological damage under the influnence of host bacteria, as well as free-developing microbiota.
Введение
Микробиологическая порча белоксодержащих пищевых продуктов является одной из самых серьезных проблем, ведущих к потере продовольствия. Расширение арсенала средств защиты пищевых продуктов от порчи представляется актуальной задачей. Одним из таких средств могут стать препараты на основе фагов, специфичных к бактериям, вызывающим порчу пищевых продуктов.
В порче пищевых продуктов доминирующим родом является Pseudomonas spp. В сыром молоке наиболее часто встречаются бактерии P. fluorescens, которые продуцируют термоустойчивые липолити-ческие и протеолитические ферменты, выдерживающие пастеризацию. При этом липазы и протеазы, разрушающие липиды и белки молока с образованием жирных кислот и пептидов, обуславливают прогорклый и фруктовый побочный привкус молока, а также его свертывание и желирование [1].
Порча охлажденного свежего мяса и птицы, хранящихся в условиях доступа кислорода, инициируется в первую очередь бактериями рода Pseudomonas за счет содержания эндогенной глюкозы, быстрое превращение которой в 2-оксо-глюконат или глюконат по пути Энтнера-Дудорова дает серьезные конкурентные преимущества псевдомонадам [2]. После исчерпания запасов глюкозы в мясе с нормальным значением рН (5,5-5,8) доминирующие Pseudomonas и близкородственные им бактерии начинают утилизировать аминокислоты с продуцированием летучих сульфидов, эфиров и аминов с неприятным запахом, которые зачастую приводят к гнилостному типу порчи мяса [3]. При охлаждении мяса основным возбудителем порчи являются бактерии рода Pseudomonas. Основным возбудителем ослизнения и гниения являются P. fluorescens, P. pyocyanea [2].
Одним из способов защиты скоропортящихся пищевых продуктов является понижение температуры. Однако это не решает проблемы, поскольку температура холодильника тормозит рост основной микрофлоры и способствует развитию психрофиль-ных микроорганизмов, таких как бактерии рода Pseudomonas [4]. Температурные границы развития большинства видов довольно широки 4 - 43°С.
Многие виды этого рода являются мезофилами и развиваются при 27 - 30°С, также встречаются термофильные и психрофильные штаммы [5]. Поэтому при анализе активности фагов специфичных к бактериям рода Pseudomonas используют температуры 4°С и 30°С.
Рыба — продукт, еще более подверженный порче, чем мясо животных. Бактериальная биота испорченной рыбы состоит в основном из бактерий родов Pseudomonas, Moraxella-Acinetobacter, Aeromonas, Shewanella, Vibrio [6]. Наиболее восприимчивая к порче часть рыбы — область жабр, включая сами жабры. На поверхности чешуи, жабрах свежевылов-ленной рыбы обнаруживаются бактерии родов Pseudomonas (P. lundensis, P. fluorescens, P. fragi, P. putida), Achromobacter и др. [1]. Самые ранние признаки органолептической порчи могут быть замечены при исследовании жабр на посторонний запах.
При этом P. aeruginosa, P. fluorescens и P. putida способны к формированию биопленок на поверхностях [7]. Бактерии в биопленках более устойчивы к негативным воздействиям окружающей среды (изменение температурного оптимума, влажности, pH, осмолярности, доступности источников питания) и выживают в присутствии многих антибиотиков [4, 8].
Употребление пищевых продуктов, контамини-рованных псевдоманадами, при наличии предрасполагающих факторов может привести к инфекциям [9]. Поэтому в настоящее время разрабатывают препараты на основе бактериофагов для увеличения срока хранения фруктов, овощей, мяса, рыбы в процессе их переработки перед упаковкой продукции на предприятиях (фаговый биопроцессинг) [10].
Целью настоящей работы является оценка способности бактериофагов, специфичных к бактериям рода Pseudomonas, сдерживать процесс порчи бе-локсодержащих продуктов.
Экспериментальная часть
Методы исследования. Ранее из говядины и рыбы, подвергшихся микробиологической порче, были выделены и идентифицированы штаммы бактерий P. аeruginosa 410 и P. fluorescens 220. Они являются аэробами (окисляют глюкозу до
глюконовой кислоты), образуют специфические пигменты, представляют собой грамотрицательные палочки, обладают каталазной активностью, восстанавливают нитраты и нитриты, не гидролизуют крахмал [11]. Затем из испорченного мяса говядины, свинины, птицы и рыбы выделяли бактериофаги, специфичные к отобранным штаммам бактерий.
Выделение бактериофагов. Для выделения бактериофагов навески испорченного мяса говядины, свинины, птицы и рыбы обрабатывали следующим образом: брали навеску исследуемого материала 20 г, наносили 20 мкл разведенной суспензии суточной культуры бактерий и инкубировали при 30°С в течение 2 суток, чтобы увеличить численность фагов, специфичных к хозяевам. Полученный материал гомогенизировали в 10 мл физиологическогораствора, осаждали клетки и грубые частицы центрифугированием при 6000 мин-1 в течение 15 мин. К супернатанту приливали хлороформ (20:1), интенсивно встряхивали в течение 1 мин оставляли на 60 мин при 20°С, после чего еще раз центрифугировали для получения осветленного лизата.
Урожай фагов определяли следующим образом: в конические колбы с 10 мл питательного бульона вносили по 0,5 мл суточной индикаторной культуры и инкубировали при 30°С с аэрацией. Спустя 2 ч, в начале экспоненциальной фазы роста, культуры инфицировали фагами (0,1 мл) и продолжали культивирование еще 4-5 ч до наступления лизиса культуры.
Титр фаголизатов и форму негативных колоний бактериофагов определяли с помощью метода агаровых слоев по Грациа [12].
Очистка и концентрирование бактериофагов. Осаждение бактериофагов из суспензии осуществляли сульфатом аммония (конечная концентрация 3,85 М) при 4°С в течение 30 мин. Полученный осадок отделяли, ресуспендировали в 0,05 М фосфатном буферном растворе рН 7,6 и центрифугировали 30 мин при 8000 мин-1. Супернатант отделяли и центрифугировали 2,5 часа при 36000 мин-1. Полученный осадок бактериофагов ресуспендировали в небольшом объеме стерильной питательной среды.
Анализ активности фагов. Для оценки эффективности защиты пищевых продуктов от микробиологической порчи с помощью бактериофагов использовали модельную систему. Образцы белоксо-держащих пищевых продуктов, не подвергавшихся тепловой обработке, в виде кусочков говядины, свинины, птицы и рыбы массой около 2 г помещали в чашки Петри и подвергали следующим видам обработки: инфицировали бактериями P. fluorescens 220 и P. aeruginosa 410, обрабатывали суспензиями бактериофагов (BVi2 - выделен из говядины; BV25 - выделен из мяса птицы; BV55 - выделен из рыбы); обрабатывали суспензиями бактериофагов с клетками своих хозяев (BVB 12 - бактериофаги с клетками Pseudomonas aeruginosa 410, BVB 25 - бактериофаги с клетками Pseudomonas aeruginosa 410 и BVB55 - бактериофаги с клетками Pseudomonas fluorescens 220). Затем чашки Петри с образцами помещали на хранение
при 4°С (9 суток) и 30°С (5 суток). Контрольные образцы ничем не обрабатывали. Ежесуточно образцы подвергали органолептическому анализу, оценивали:
- характер поверхности;
- цвет;
- запах.
Результаты и их обсуждение
Использованные в работе бактериофаги BV12, BV25, BV55 обладают наиболее широким спектром литического действия по отношению к различным штаммам бактерий P. fluorescens и P. aeruginosa. В таблицах 1-2 приведены временные интервалы, в течение которых изменялись органолептические показатели.
Органолептические показатели изменялись следующим образом: поверхность образцов сначала увлажнялась, затем на ней появлялась слизь, цвет чаще всего становился более светлым, иногда образовывались желтые пятна, появлялся легкий запах, который со временем усиливался.
Таблица 1 - Изменение органолептических показателей образца говядины после обработки суспензиями бактерий и бактериофагов (при 4°С и 30°С)
Bременной интервал
изменения органолеп-
Обработка образцов тических показателей образцов (сутки)
Поверхность Цвет Запах
Контроль 3 5 3
P. aeruginosa 410 3 6 3
P.fluorescence 220 3 6 4
и О BV12 6 8 8
BV25 8 8 8
BV55 8 7 8
BVB12 8 7 7
BVB25 7 9 7
BVB55 7 9 8
Контроль 2 3 1
P. aeruginosa 410 2 2 2
P.fluorescence 220 2 2 1
и BV12 2 3 3
о о BV25 3 4 4
m BV55 3 5 5
BVB12 3 4 3
BVB25 3 4 2
BVB55 4 5 5
Примечание: BV12 - бактериофаги из говядины, BV25 -бактериофаги из птицы, BV55 - бактериофаги из рыбы, BVB12-бактериофаги из говядины + P. aeruginosa 410, BV^-бактериофаги из птицы + P. aeruginosa 410, BVB55-бактериофаги из рыбы + P .fluoresces 220.
Как видно из результатов, представленных в таблице 1, при температуре хранения образцов 4°С изменения органолептических показателей в необработанном контроле и в образцах говядины, инфицированных бактериями P. aeruginosa 410 и P. fluorescence 220 происходили практически синхрон-
Таблица 2 - Изменение органолептических показателей образца свинины после обработки суспензиями бактерий и бактериофагов (при 4°С и 30°С)
Временной интервал
изменения органолеп-
Обработка образцов тических показателей образцов (сутки)
Поверхность Цвет Запах
Контроль 3 5 3
P. aeruginosa 410 3 4 3
P. fluorescence 220 2 6 4
и О BV12 6 8 8
BV25 8 8 8
BV55 8 9 8
BVB12 7 8 7
BVB25 7 9 8
BVB55 9 7 8
контроль 2 3 1
P. aeruginosa 410 2 3 2
P. fluorescence 220 2 3 1
Ç ) BV12 2 4 4
о О BV25 4 4 5
m BV55 2 5 5
BVB12 3 4 3
BVB25 3 4 2
BVB55 3 5 3
Примечание:обозначения см. в таблице 1.
но. На третьи сутки на поверхности образцов появилась слизь, а также запах. На пятые-шестые сутки образцы светлели. Наличие бактериофагов примерно в два раза увеличивало сроки появления признаков микробиологической порчи. При температуре хранения 30°С результаты менее выражены. Но обращает на себя внимание бактериофаг, выделенный из рыбы В^5, который оказался более эффективным, чем BVl2 и В^5.
Данные, которые были получены для образцов говядины, воспроизвелись при анализе свинины, птицы и рыбы. Однако, наиболее эффективными бактериофагами при защиты от порчи свинины ока-
зались BV55 и BV25, для птицы - BV25, а рыбы - BV12 и BV55.
Таким образом, выполненные исследования показали, что обработка образцов белоксодержащих продуктов суспензиями бактериофагов, специфичных к выделенным штаммам бактерий рода Pseudomonas защищает эти продукты не только от инфекций бактерий штаммов P. aeruginosa 410 и P. fluorescence 220, но и спонтанно развивающейся микробиоты.
Полученные результаты могут быть использованы для разработки биопрепарата, защищающего от микробиологической порчи белоксодержащие пищевые продукты, не подвергавшиеся тепловой обработке.
Литература
1. L. Franzetti, M. Scarpellini, Ann. Microbiol., 57, 1, 39-47 (2007)
2. Y. Zhang, Y. Mao, K. Li, P. Dong, R. Liang, X. Luo, Asian-Aust. J. Anim. Sci., 24, 5, 713-722 (2011)
3. Д.А. Васильев, Д.А. Викторов, А.М. Артамонов, Т.А. Гринева, Е.А. Ляшенко, Фундаментальные исследования, 5, 55-58 (2014)
4. J.M. Jay, M.J. Loessner D.A. Golden, Modern Food Microbiology. Springer, New York, 2005. 790 p.
5. И.О. Коцофляк, Укр. антаркт. журн., 4-5, 214-218 (2006)
6. P. Tryfinopoulou, Appl. Environ. Microbiol., 68, 1, 65-72 (2002)
7. М.В. Кузнецова. Дисс. докт. мед. наук, Ин-т экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, 2014. 244 с.
8. С. Чжун. Дисс. канд. вет. наук, МГУПП, Москва, 2015. 119 с.
9. А.В. Костылева, О.Ю. Кузнецов, Педиатрические аспекты синегнойной инфекции: Методические разработки. ИвГМА, Иваново, 2011. 38 с.
10. И.А. Киселева. Дисс. канд. биол. наук, Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии, Москва, 2015. 207 с.
11. А.Э. Эльхедми, Х.М. Элькаиб, В.Н. Леонтьев, Труды БГТУ, 4, 251-255 (2015)
12. E. Kutter, A. Sulakvelidze, Bacteriophages: Biology and Applications. CRC Press, New York, 2005. 527 p.
© А. Э. Эльхедми - аспирант кафедры биотехнологии и биоэкологии, Белорусский государственный технологический университет, [email protected].
© A. E. Elhedmi - Ph. D. course student of the Department of Biotechnology and Bioecology, Belarasian State Technological University, [email protected]
