CC BY
143
УДК 619:579
DOI 10.18286/1816-4501-2015-3-59-63
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ
AEROMONAS SOBRIA
Горшков Иван Геннадьевич, научный сотрудник НИИЦМиБ
викторов денис александрович, кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
васильев дмитрий аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел.: 8(422)55-95-47
e-mail: [email protected]
ключевые слова: бактериофаги, аэромоноз рыб, биотехнология, микробиология, Aeromonas, выделение, литическая активность, титр, специфичность, чувствительность, устойчивость, морфология.
В результате проведенных исследований из объектов внешней среды (водные источники) было выделено 8 штаммов бактериофагов, специфичных в отношении Aeromonas sobria, исследованы их основные биологические свойства: литическая активность, температурная устойчивость, устойчивость к обработке хлороформом, видовая и родовая специфичность, морфология негативных колоний.
введение
Бактериофаги, активные в отношении бактерий рода Aeromonas, вызывают научный и практический интерес, прежде всего, как средство выявления названных бактерий (методами фаготипирования и реакции нарастания титра фага), а также как средство деконтаминации [1, 2].
Бактерии рода Aeromonas играют существенную роль в инфекционной ихтиопа-тологии. Аэромонозы рыб - это заболевание, встречающееся в рыбоводческих хозяйствах и вызываемое бактериями: Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Aeromonas caveae, Aeromonas sobria [3, 4, 5].
Поскольку существующие методы диагностики не предусматривают типирование возбудителей аэромонозов до вида, лечение заболевания заключается в применении антибиотиков широкого спектра, высокомолекулярных соединений, содержащих йод, формалин [1, 2].
В отечественной литературе нет подробной информации о выделении бактериофагов, активных в отношении A. sobria, разработке и применению биопрепаратов на их основе. Однако есть результаты исследований бактериофагов, активных в отно-
шении других аэромонад, прежде всего A. salmonicida [6, 7] и A. hydrophila [8, 9].
Перечисленные причины обуславливают необходимость в разработке эффективной тест-системы для быстрой и точной индикации и идентификации бактерии A. sobria в патологическом материале рыб и образцах воды из прудов рыбоводческого назначения. В качестве дешевого и доступного метода диагностики аэромонозов правомерно рассматривать реакцию нарастания титра фага [10-17].
Цель исследования: выделение бактериофагов, активных в отношении бактерии A. sobria и изучение их биологических свойств.
Задачи:
1. Выделение бактериофагов, активных в отношении A. sobria,
2. Исследование литической активности выделенных фагов по методу Грациа,
3. Исследование отношения выделенных бактериофагов к температурному воздействию и обработке хлороформом,
4. Исследование видовой и родовой специфичности выделенных бактериофагов,
5. Исследование морфологии негативных колоний выделенных бактериофагов.
Объекты и методы исследований
Объект исследования.
Выделение бактериофагов проводили из образцов воды различных источников: Черное море (близ станции Лоо), река Лоо, стоячий водоем рядом с железнодорожной станцией Лоо, родник в черте города Ульяновска. Всего исследовано 16 объектов.
Штаммы, используемые в работе.
При выделении бактериофагов в качестве индикаторных бактериальных штаммов использовали A. sobria №23, № 22, № +/2, №+/1, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина. Для определения видовой и родовой специфичности выделенных бактериофагов использовали штаммы бактерий следующих видов: A. caveae, A. salmonicida, A. hydrophila, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluores-cens, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica.
Материалы.
ГРМ-бульон (производства ГНЦ ПМБ, п. Оболенск), агар бактериологический (производства ГНЦ ПМБ, п. Оболенск), дистиллированная вода, хлороформ, стандартный набор посуды для микробиологических исследований. Для очистки бактериальных лизатов использовали фильтродержатели и мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм (производства Millipore - Millivac)
Оборудование.
Термостат лабораторный ТС-180, центрифуга лабораторная MULTI CENTRIFUGE CM 6 M, водяная баня KL-2, холодильник (+4...+8 °С).
Работа проводилась на лабораторной базе кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина.
Методы.
Выделение бактериофагов проводили методом накопления по схемам, описанным в работах Викторова Д.А., Золотухина С.Н., Насибуллина И.Р. и оптимизированным нами с учётом биологических особенностей A. sobria и их бактериофагов [6-12].
В 16 колб на 200 мл с 50 мл стерильного концентрированного (2х) мясопептонного
бульона добавляли по 50 мл исследуемых образцов воды. В каждую из колб добавляли по 0,5 мл суточных индикаторных культур штаммов A. sobria №23, № 22, № +/2, №+/1. Полученную смесь перемешивали и помещали в термостат на 24 часа при 27 °С (оптимум роста A. sobria) [11]. После инкубации из полученной в колбах суспензии отбирали по 10 мл в стерильные центрифужные пробирки, центрифугировали 20 минут при 3000 об/мин. Супернатант фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм (Millipore - Millivac), после чего фильтрат помещали в стерильные пробирки для хранения и дальнейшего исследования.
Первичные фаговые стоки пассировали для получения чистых линий бактериофагов путём 5-10 кратного пересева их бляшек [2, 3, 6].
Определение спектра литической активности, а также родовой и видовой специфичности бактериофагов проводили методом спот-теста [2]. Для этого на чашки Петри, засеянные газонами суточных бактериальных культур (A. sobria, A. salmonicida, A. hydrophila, A. caveae, A. sobria, P. aeruginosa, P. fluorescens, P. mirabilis, E. coli, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica) по каплям пипеткой наносили суспензии исследуемых фагов. Посевы A. sobria, A. salmonicida, A. hydrophila, A. caveae, A. sobria, P. fluorescens, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica культивировали 24 часа при температуре 27 °С, P. aeruginosa, P. mirabilis, E. coli - при 37 °С (оптимум роста бактерий).
Литическую активность бактериофагов, а также морфологию негативных колоний изучали по методам Грациа [2].
Для исследования устойчивости выделенных бактериофагов к обработке хлороформом использовали методику, предложенную Золотухиным С.Н. и Викторовым Д.А. [11, 12]. Определение чувствительности бактериофагов проводили путем обработки суспензий бактериофагов хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Контролем служили пробирки с суспензиями бактериофагов, не обработанными хлороформом. После воздействия хлороформа различной продолжительностью (5, 10, 15, 20 минут) активность бактериофагов определяли по методу Грациа.
Таблица 1
Литическая активность выделенных бактериофагов (по методу Грациа).
№ Штамм бактериофагов Литическая активность
1 Aer.sobr.1- УГСХА 3,0(±0,1)х109
2 Aer.sobr.2 -УГСХА 4,0(±0,4)х107
3 Aer.sobr.3 -УГСХА 5,0(±0,1)х109
4 Aer.sobr.4 -УГСХА 2,0(±0,2)х1010
5 Aer.sobr.5 -УГСХА 5,0(±0,2)х109
6 Aer.sobr.6 -УГСХА 4,0(±0,2)х107
7 Aer.sobr.7 -УГСХА 0,6(±0,1)х106
8 Aer.sobr.8 -УГСХА 4,0(±0,6)х109
Для изучения температурной устойчивости, ряд пробирок с суспензиями исследуемых бактериофагов, разведёнными мясопептонным бульоном 1:10, прогревали на водяной бане в течение 20 минут при температуре от 20 °С до 60 °С с интервалами 10 и 2 °С. Контрольные пробирки не прогревали [2, 3, 6]. После воздействия температуры активность исследуемых фагов определяли по методу Грациа.
Исследования по определению количественных показателей проводили в 3-5 повторностях. При статистической обработке данных использовали программу Statistica 8.
результаты исследований
Было выделено 8 бактериофагов, активных в отношении индикаторных штаммов A. sobria №23, № 22, № +/2 и №+/1.
Результаты исследования литической активности бактериофагов представлены в табл. 1.
Установлено, что выделенные бактериофаги устойчивы к воздействию температуры до 48°С в течение 20 минут и полностью инактивируются при 54°С (табл. 2).
Результаты исследования устойчивости бактериофагов к обработке хлороформом приведены в табл. 3.
После 5 минут обработки фаголизатов хлороформом существенного изменения титра бактериофагов не наблюдалось, после 10 минут наблюдалось резкое падение титра, после 15
минут - полная инактивация бактериофагов.
Результаты исследований специфичности бактериофагов представлены в таблицах 4 и 5.
Морфология негативных колоний выделенных бактериофагов имеет следующие характеристики:
- негативные колонии бактериофагов Aer.sobr.1-yrCXA, Aer.sobr.3-yrCXA, Aer. sobr.5-yrCXA имели диаметр 1-2 мм, полностью прозрачны, без зоны вторичного лизиса;
- негативные колонии бактериофагов Aer.sobr.2-yrCXA, Aer.sobr.7-yrCXA, Aer. sobr.8-yrCXA - диаметр 0,5-1 мм с мутным центром, без зоны вторичного лизиса;
- негативные колонии бактериофагов Aer.sobr.4-yrCXA, Aer.sobr.6-yrCXA - диаметр 3-4 мм с прозрачным центром и мутной зоной вторичного лизиса на периферии.
выводы
1. Из 16 водных источников выделено
таблица 2
устойчивость выделенных бактериофагов к тепловому воздействию.
t,°C Aer.sobr.1- УГСХА Aer.sobr.1- УГСХА Aer.sobr.1- УГСХА Aer.sobr.1- УГСХА Aer.sobr.1- УГСХА Aer.sobr.1- УГСХА Aer.sobr.1- УГСХА Aer.sobr.1- УГСХА
20 3,0(±0,1)х109 4,0(±0,4)х107 0,6(±0,1)х1010 2,0(±0,2)х1010 5,0(±0,2)х109 4,0(±0,2)х107 0,6(±0,1)х106 4,7(±0,6)х109
30 3,0(±0,1)х109 4,0(±0,4)х107 0,6(±0,1)х1010 2,0(±0,2)х1010 5,0(±0,2)х109 4,0(±0,2)х107 0,6(±0,1)х106 4,7(±0,6)х109
40 2,8(±0,1)х109 4,0(±0,4)х107 0,6(±0,1)х1010 1,6(±0,2)х1010 5,0(±0,2)х109 4,0(±0,2)х107 3,0(±0,1)х105 4,7(±0,6)х109
46 2,8(±0,1)х109 4,0(±0,4)х107 0,6(±0,1)х1010 1,6(±0,2)х1010 5,0(±0,2)х109 3,9(±0,2)х107 3,0(±0,1)х105 4,5(±0,6)х109
48 2,6(±0,1)х109 4,0(±0,4)х107 0,6(±0,1)х1010 1,6(±0,2)х1010 4,9(±0,2)х109 3,9(±0,2)х107 3,0(±0,1)х105 4,2(±0,6)х109
50 4,9(±0,1)х107 0,6(±0,4)х106 0,6(±0,1)х108 0,7(±0,2)х108 4,3(±0,2)х106 0,6(±0,2)х106 2,5(±0,1)х104 3,9(±0,6)х106
52 0,5(±0,1)х104 0,7(±0,4)х103 0 0,8(±0,2)х104 0,6(±0,2)х103 3,4(±0,2)х102 0 0,6(±0,6)х104
54 0 0 0 0 0 0 0 0
56 0 0 0 0 0 0 0 0
58 0 0 0 0 0 0 0 0
60 0 0 0 0 0 0 0 0
Таблица 3
Устойчивость выделенных бактериофагов к хлороформу
№ Штамм бактериофагов Время обработки хлороформом, мин.
Контроль (0 минут) 5 10 15 20
Титр бактериофагов, БОЕ/мл
1 Aer.sobr.1- УГСХА 3,0(±0,1)х109 2,8(±0,1)х109 4,2(±0,1)х103 0 0
2 Aer.sobr.2 -УГСХА 4,0(±0,4)х107 3,7(±0,4)х107 3,5(±0,4)х102 0 0
3 Aer.sobr.3 -УГСХА 0,6(±0,1)х1010 0,6(±0,1)х1010 0,6(±0,1)х104 0 0
4 Aer.sobr.4 -УГСХА 2,0(±0,2)х1010 1,7(±0,2)х1010 2,2(±0,2)х104 0 0
5 Aer.sobr.5 -УГСХА 5,0(±0,2)х109 4,7(±0,2)х109 0,6(±0,2)х103 0 0
6 Aer.sobr.6 -УГСХА 4,0(±0,2)х107 3,7(±0,2)х107 4,1(±0,2)х103 0 0
7 Aer.sobr.7 -УГСХА 0,6(±0,1)х106 5,0(±0,1)х105 1,2(±0,1)х102 0 0
8 Aer.sobr.8 -УГСХА 4,7(±0,6)х109 4,0(±0,6)х109 1,3(±0,6)х102 0 0
Таблица 4
Активность бактериофагов по отношению к гетерогенным бактериальным культурам
№ пп Штамм бактериофагов Штаммы исследуемых бактерий
P aeruginosa «О С си О «о си о 3 СС .to 5 S3 5 СС *о о uj .to to .о *5 о си -о ■4—J о ~сз 3 си 8 S3 о *о о о си +-| с: си
1 Aersobr.1- УГСХА - - - - - -
2 Aer.sobr.2 -УГСХА - - - - - -
3 Aer.sobr.3 -УГСХА - - - - - -
4 Aer.sobr.4 -УГСХА - - - - - -
5 Aer.sobr.5 -УГСХА - - - - - -
6 Aer.sobr.6 -УГСХА - - - - - -
7 Aer.sobr.7 -УГСХА - - - - - -
8 Aer.sobr.8 -УГСХА - - - - - -
«+» наличие зон лизиса , «-» отсутствие зон лизиса.
8 штаммов бактериофагов, активных в отношении A. sobria,
2. Литическая активность выделенных бактериофагов (по методу Грациа) составила от 0,6(±0,1)х106 до 2,0(±0,2)х1010 БОЕ/мл,
3. Выделенные бактериофаги устойчивы к воздействию температуры до 48 °С в течение 20 минут и полностью инактивируются при 54 °С; неустойчивы к обработке хлороформом в соотношении 1:10 продолжительностью свыше 5 минут,
4. Выделенные фаги обладают видо-
таблица 5
специфичность выделенных штаммов бактериофагов по отношению к бактериям рода Aeromonas
№ Штамм бактериофагов Штамм бактерий рода Aeromonas
A. sobria № 23 ГМ + Ol О ‘С -О О A. sobria № +/1 A. sobria № 22 -2 5 а о -с A. salmonicida QJ О QJ О О
1 Aer.sobr.1- УГСХА + + + + - - -
2 Aer.sobr.2 -УГСХА + + + + - - -
3 Aer.sobr.3 -УГСХА + + + + - - -
4 Aer.sobr.4 -УГСХА + + + + - - -
5 Aer.sobr.5 -УГСХА + + + + - - -
6 Aer.sobr.6 -УГСХА + + + + - - -
7 Aer.sobr.7 -УГСХА + + + + - - -
8 Aer.sobr.8 -УГСХА + + + + - - -
«+» наличие зон лизиса, «-» отсутствие зон лизиса.
вой специфичностью,
5. Определена морфология негативных колоний выделенных бактериофагов.
Библиографический список
1. Инструкция о мероприятиях по борьбе с аэромонозом карповых рыб, 1998 г.
2. Инструкция по борьбе с фурункулезом лососевых рыб, 1997 г.
3. Блинов, А.И. Аэромонады: выделение, идентификация и дифференциация: учебно-методические рекомендации /А.И. Блинов, Н.А. Глушанова. - Новокузнецк,
1997. - 123с.
4. Austin, B. Taxonomy of bacterial fish pathogens. / B. Austin. // Institute of Aquaculture, Pathfoot Building. University of Stirling, Stirling FK9 4LA, Scotland, UK. 2011; 42(1):20
5. Rahman, M. Identification and Characterization of Pathogenic Aeromonas veronii Bi-ovar Sobria Associated with Epizootic Ulcerative Syndrome in Fish in Bangladesh. / M. Rahman, P. Colque-Navarro, R. Mollby // Appl Environ Microbiol. 2002 February. - 68(2): 650-655.
6. Викторов, Д.А. Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas putida : ав-тореф. дис. ... канд. биол. наук / Д.А. Викторов. - Саратов. - 2011. - 22 с.
7. Выделение бактериофагов Aeromonas salmonicida / И.Г. Горшков, Н.Г. Куклина, Д.А. Викторов, И.Р. Насибуллин, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности: Материалы международной научно-практической конференции, Ульяновск, ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», 23-25 апреля 2013. - Т. 2. - Ульяновск, 2013. - С. 3-4.
8. Горшков, И.Г. Перспективы применения бактериофагов для индикации патогенных бактерий рода Aeromonas / И.Г. Горшков, Н.Г. Куклина, Д.А. Викторов, И.Р. Насибуллин, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин // Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности: Материалы международной научно-практической конференции, Ульяновск, ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», 23-25 апреля 2013. - Т. 2. - Ульяновск, 2013.
9. Применение реакции нарастания
титра фага для индикации аэромонад в рыбной продукции / И.Р. Насибуллин, И.Г. Горшков, Н.Г. Куклина, Д.А. Викторов, Д.А. Васильев, А.А. Нафеев // Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности: Материалы междуна-
родной научно-практической конференции, Ульяновск, ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», 23-25 апреля 2013. - Т. 2. - Ульяновск, 2013. - С. 158-161.
10. Выделение фагов бактерий
Aeromonas hydrophila и изучение их биологических свойств / И.Р. Насибуллин, Д.А. Викторов, Д.А. Васильев, А.А. Нафеев, И.Г. Шви-денко//Вестник ветеринарии. - Ставрополь: «Энтропос», 2013. - № 66 (3/2013). - С. 8-10.
11. Викторов, Д.А. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Pseudomonas fluorescens / Д.А. Викторов, А.М. Артамонов, Д.А. Васильев // Ветеринария и кормление. - Москва: «ВЕТКОРМ», 2012. - №5. - С. 8-9.
12. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: ав-тореф. дис. ... д-ра биологических наук / С.Н. Золотухин. - Ульяновск, 2007. - 39 с.
13. Биосенсорная детекция бактерий рода Bacillus в молоке и молочных продуктах для предупреждения их порчи / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова, А.В. Алешкин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - №4 (24). - С. 36-43.
14. Разработка параметров постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, А.В. Алешкин, Н.А. Феоктистова, С.В. Мерчина, В.В. Батраков, М.А. Юдина, В.А. Макеев, Н.А. Романова // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2012. - №3 (19).-С. 69-73.
15. Васильев, Д.А. Биоиндикация бактерий Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова, М.А. Лыдина, А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, И.Г. Швиденко // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - №3 (23). - С. 52-57.
16. BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology Second Edition. USA 2007.
17. Катер, Э. Бактериофаги: биология и практическое применение / Э. Каттер, А. Сулаквелидзе; пер. с англ.: коллектив пер.; науч. ред. рус. изд. А.В. Летаров. - Москва: Научный мир, 2012. - 636 с.
