CC BY
231
УДК 619:578
ВЛИЯНИЕ ФИЗИЧЕСКИХ, ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ И РЕЖИМОВ ХРАНЕНИЯ НА ЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ АЭРОМОНАДНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ
Насибуллин Ильдар Равильевич, соискатель кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ» ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
Швиденко Инна Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии
ФГБОУ ВПО «Саратовский ГМУ имени В.И. Разумовского Минздравсоцразвития России» 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел.: +7(8422)55-95-47, e-mail: dav_ul@mail.ru
Ключевые слова: Aeromonas hydrophila, бактериофаги, инактивация, литическая активность, температура, устойчивость, хлороформ.
Статья посвящена изучению литической активности новых изолятов бактериофагов Aeromonas hydrophila, выделенных из объектов окружающей среды Ульяновской области, а также влиянию на них высокой температуры, хлороформа и режимов хранения. Выделенные бактериофаги проявили различную литическую активность, варьирующую в пределах от 10-5до 10-8по методу Аппельмана и от 0,6x106 до 2,5х108 БОЕ/мл по методу Грациа. Изучаемые бактериофаги чувствительны к температурной обработке выше 64 в течение 30 минут и к обработке хлороформом в соотношении 1:10 в течение 15 минут. Хранение в течение 12 месяцев незначительно снижало их литическую активность.
Введение
Литическая активность является одним из решающих критериев при селекции бактериофагов и их включения в состав биопрепаратов для индикации и идентификации микроорганизмов, а также для декон-таминации [1]. Литическая активность бактериофага оценивается по его способности вызывать лизис бактериальной культуры в жидких или на плотных питательных средах. При определении литической активности по методу Аппельмана её выражают тем максимальным разведением, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литиче-ское действие [1-5]. Более точным методом оценки активности бактериофага является определение количества бляшкообразу-ющих единиц (БОЕ) фага в 1 мл суспензии (метод Грациа) [1,4,6]. Активность бактериофага определяется в конкретных, стандартных условиях. Бактериофаг по отношению к одной и той же культуре, но при отличающихся условиях, так же как и при испытании его в одинаковых условиях на разных штам-
мах одного и того же вида бактерий, может проявлять разную литическую активность и формировать неодинаковое число бляшек (негативных колоний) на плотной питательной среде [6,7].
Одними из важных факторов внешней среды, которые могут снижать литическую активность бактериофагов, является повышенная температура, хлороформ и длительность хранения.
Ввиду того, что для работы с бактериофагами важным этапом исследования является подбор метода инактивации жизнеспособных бактерий в фаголизате, применяемый для этих целей метод не должен снижать литическую активность бактериофагов [2,3,6,8].
Поэтому задачей наших исследований явилось изучение влияния вышеперечисленных факторов на изменение литической активности выделенных нами новых штаммов фагов Aeromonas hydrophila.
Объекты и методы исследований
В работе были использованы: 3
■I
Таблица 1
Результаты исследований литической активности фагов бактерий А. Ну^орЫ!а.
№ Штамм фага Титр по Аппельману Титр по Грациа, БОЕ/мл
1 Фаг F43-УГСХА 10"8 2,5х108±0,2х108
2 Фаг 1р-УГСХА 10"6 4,2х106±0,3х106
3 Фаг F43g-УГСХА 10"7 3,7х107±0,5х107
4 Фаг 13а-УГСХА 10"5 0,6х106±0,7х106
5 Фаг АЬ^-УГСХА 10"8 1,5х108±0,4х108
референс-штамма Aeromonas hydrophila А1^, 43-УГСХА, АТСС 7966, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-сани-тарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия им. П.А. Столыпина», 14 полевых штаммов А. 1^горЫ1а и 5 штаммов бактериофагов, выделенных нами из объектов окружающей среды (озер и рек) Ульяновской области. Культуры бактерий А. hydrophila выращивали на стандартном питательном бульоне в течение 18-24 часов при 289С. Ли-тическую активность селекционированных бактериофагов определяли по методам Ап-пельмана и Грациа [1,2,6,7,9].
Определение температурной устойчивости бактериофагов проводили при прогревании пробирок с бактериофагами А. 1пу-drophila на водяной бане в течение 30 минут при температуре от 58 9С до 66 9С с интервалом 29С.
После прогревания активность бак-
териофагов определяли по методу Грациа. Учет результатов проводили после 12-18 часового термостатирования чашек при температуре 28 9С [1,2,3,4,7].
Для определения чувствительности бактериофагов к воздействию хлороформа пробирки с фаговой суспензией бактерий А. hydrophila обрабатывали хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании в течение 15, 30 и 40 минут. Контролем служили пробирки с фагами, необработанные хлороформом. После воздействия хлороформа активность бактериофагов определяли по методу Грациа [1,2,6,7].
Бактериологические исследования проводили по общепринятым методам [9]. Результаты исследований Результаты исследований литической активности изучаемых бактериофагов представлены в табл. 1.
Установлено, что прогревание пробирок с бактериофагом при температуре 60-629С в течение 30 минут несколько снижало активность фагов (таб. 2, рис.1). Дальнейшее повышение температуры приводило к резкому снижению активности фагов. Воздействие температуры выше 649С полностью инактивировало все изучаемые бактериофаги в течении 30 минут (табл. 2, рис.1).
Таблица 2
Температурная устойчивость бактериофагов А. Ьу^орЬИа
Температурный Активность штаммов, подвергнутых температурной обработке, БОЕ/мл
режим, 9С ИШ F43-УГСХА 1р-УГСХА F43g-УГСХА 13а-УГСХА Ahd-УГСХА
58-60 2,0х108 2,0х108 3,0х106 2,0х107 4,0х105 3,0х107
±0,2х108 ±0,4х108 ±0,6х106 ±0,5х107 ±0,3х105 ±0,4х107
60-62 1,0х108 1,0х108 1,0х105 1,0х106 1,0х104 1,0х106
±0,3х108 ±0,5х108 ±0,7х105 ±0,2х106 ±0,4х104 ±0,5х106
62-64 3,0х107 2,0х105 2,0х105
±0,4х107 ±0,6х105 ±0,3х105
64-66 - - - - - -
Контроль 4,0х108 2,5х108 4,2х106 3,7х107 0,58х106 1,5х108
(без обработки) ±0,2х108 ±0,2х108 ±0,3х106 ±0,5х107 ±0,1х106 ±0,4х108
Примечание: «иш» - индикаторный бактериальный штамм А. hydrophila
I
57
59
61
63
65
-ИШ
-Фаг-43
Фаг -1п
Фаг-43г
-Фаг-13
- Фаг-аИс1
Рис. 1 - Температурная устойчивость бактериофагов А. ЬувгорЬНа
Результаты исследований устойчивости фагов к воздействию хлороформа свидетельствовали, что наблюдаются существенные изменения количества БОЕ в 1 мл при обработке хлороформом. Данные опытов позволяют сделать вывод о чувствительности изучаемых бактериофагов к обработке их хлороформом. Воздействие хлороформом на культуры индикаторных штаммов А. hydrophila Ahd, 43-УГСХА, ATCC 7966 в течение 15 минут приводила к их полной инактивации (табл. 3, рис. 2).
В связи с тем, что изучаемые бактериофаги не устойчивы к изученным режимам, инактивирующим бактериальные клетки, методы прогревания и обработки хлороформом нельзя использовать при работе с вышеперечисленными штаммами бактериофагов.
Дальнейшие эксперименты были направлены на изучение изменения
литической активности Рис. 2 - Устойчивость бактериофагов А. Ьу^орЬИа к воз-
штамма бактериофага М3- действию хлороформа
Таблица 3
Устойчивость бактериофагов А. Ьу^орЬИа к воздействию хлороформа в течение 30 минут.
1,Е+09
1,Е+08
15
30
45
-ИШ
-Фаг-43
Фаг -1п
Фаг-43г
-Фаг-13
-Фаг-аИс1
Время воздействия хлороформа, мин Активность штаммов подвергнутых обработке хлороформом, БОЕ/мл
ИШ F43-УГСХА 1р-УГСХА F43g-УГСХА 13а-УГСХА Ahd-УГСХА
15 - 4,0х105 ± 0,2х105 5,0х102 ± 0,4х102 5,0х103 ± 0,3х103 7,0х102 ± 0,2х102 3,0х104 ± 0,5х104
30 - - - 4,0х102 ±0,3х102 - 3,0х102 ± 0,5х102
45 - - - - - -
Контроль 4,0х108 ± 0,3х108 2,5х108 ± 0,2х108 4,2х106 ± 0,3х106 3,7х107 ± 0,5х107 0,58х106 ± 0,1х106 1,5х108 ± 0,4х108
Примечание: «иш»-индикаторный бактериальный штамм А. hydrophila
Таблица 4 литературным данным, является до-Изменение литической активности бактерио- пустимым при создании биопрепа-фага F43-УГСХА при хранении в течении 12 месяцев рата [1,2,7].
Фаг Срок хранения Литическая активность, БОЕ/мл
F43-УГСХА Момент укупоривания 2,5х108±0,2х108
3 месяца 2,5х108±0,2х108
6 месяцев 4,5х107±0,3х107
9 месяцев 3,7х107±0,2х107
12 месяцев 3,5х107±0,2х107
УГСХА при хранении в холодильнике при температуре 4 9С, во флаконах в течение 12 месяцев, как наиболее перспективного. Эти исследования были связаны с необходимостью изучения сроков годности биопрепаратов и кратностью пересева. При хранении показатели литической активности определяли методом агаровых слоев [3,5,6,7,8].
Результаты исследований представлены в табл. 4.
В течение 3 месяцев литическая активность бактериофага F43-УГСХА оставалась без изменений, через 6 месяцев она снизилась и составила 4,5х107±0,3х107 БОЕ/ мл, через 9 месяцев хранения составляла 3,7х107±0,2х107 БОЕ/мл, а через 12 месяцев - 3,5х107±0,2х107БОЕ/мл. При однократном пассировании фага F43-УГСХА на индикаторном штамме бактерий А. hydюphila он восстанавливает литическую активность до исходного уровня, что подтверждается литературными данными по свойствам бактериофагов других видов [1,2,5,6,7].
Выводы
Литическая активность выделенных нами бактериофагов бактерий А. hydrophila по Аппельману находится в пределах от 10 5 до 10"8, а по Грациа - от 0,58 х 106 до 2,5 х 108 БОЕ/мл. Максимальный титр наблюдается у бактериофага F43-УГСХА: по Аппельману 10 8, по Грациа 2,5 х 108 БОЕ/мл. Изучаемые бактериофаги термолабильны в условиях выше 609С и чувствительны к обработке хлороформом в соотношении 1:10 в течение 15 минут. Хранение бактериофага F43-УГСХА в течение 12 месяцев в условиях холодильника при температуре 4 9С снижает литическую активность на один порядок, что, согласно
Библиографический список
1. Биоиндикация бактерий Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Васильев Д.А., Золотухин С.Н., Феоктистова Н.А., Лыдина М.А., Калдыркаев А.И., Макеев В.А., Швиденко И.Г. // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 3 (23). - С. 52-56.
2. Васильева, Ю.Б. Фаги бактерий Bordetella bronchiseptica: свойства и перспективы применения // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. -2013. - №3 (23). - С.44-49.
3. Викторов, Д.А. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Pseudomonas fluorescens // Д.А. Викторов, А.М. Артамонов, Д.А. Васильев // Ветеринария и кормление. - Москва: «ВЕТКОРМ», 2012. - №5. - С. 8-9.
4. Горшков, И.Г. Сравнительный анализ роста бактерий родов Aeromonas и Pseudomonas на средах с красителями / И.Г. Горшков, Н.Г. Куклина, Д.А. Викторов, Д.А. Васильев // Вестник ветеринарии. - Ставрополь: «Энтропос», 2012. - № 63 (4/2012). - С.38-39.
5. Ковалева, Е.Н. Фагоидентификация бактерий рода Listeria monocitogenes /Ковалева Е.Н., Васильев Д.А., Золотухин С.Н.// Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных. Материалы Международной научно-практической конференции. - Москва, 2013. - С. 97.
6. Адамс, М. Бактериофаги (перевод с английского) / М. Адамс.- М., - 1961. - 521 с.
7. Габрилович, И.М. Основы бактериофагии / И.М. Габрилович. - Минск: Высшая школа, 1973.
8. Clokie, M.R.J. Bacteriophages: methods and protocols, volume 1: isolation, characterization, and interactions / M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski. - 2009, Humana Press. - 301 p.
9. Васильев, Д.А. Методы общей бактериологии: учебное пособие / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.М. Никишина. - Ульяновск, 1998. - 170с.
