CC BY
164
УДК 619:578.832.1
ФАГИ БАКТЕРИЙ BORDETELLA BRONCHISEPTICA: СВОЙСТВА И ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ
Васильева Юлия Борисовна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
432017, г. Ульяновск, Б.Новый Венец -1, e-mail: vet_yulia@mail.ru
Ключевые слова: Bordetella bronchiseptica, бактериофаги, индикация, идентификация, биологические свойства.
В статье представлен материал по истории изучения фагов бактерий рода Bordetella, а также результаты собственных исследований по выделению бактериофагов Bordetella bronchiseptica, изучению их биологических свойств и возможностям применения.
Введение
С 80-х годов XX века отечественными и зарубежными исследователями предпринимаются попытки выделения фагов бактерий рода Bordetella [1-9].
Исследовательской группой НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи описаны бактериофаги бактерий B.pertussis - фТ, фК, 134, 41405, B.parapertussis 6622, B.bronchiseptica - 214, американскими разработчиками - два бактериофага В.avium В1 и В2 и три фага B.bronchiseptica BPP-1, BMP-1 и BIP-1. Авторами изучено строение бордетеллёзных фагов, проведен сравнительный анализ структуры их геномов, выявлены особенности лизогении и конверсии бактерий рода Bordetella, а также спроектирована трёхмерная модель фагов и изучен уникальный механизм доставки ДНК материала в бактериальную клетку [2-6].
На основе структурных характеристик авторы отнесли фаги B.bronchiseptica к семейству Podoviridae - короткохвостовых фагов с изометрической головкой [6, 7, 8, 9].
Все бордетеллезные фаги морфологически идентичны друг другу. Диаметр ико-саэдрической головки составляет 49,5 нм [2, 6, 7, 8, 9].
Бактериофаги нередко участвуют в формировании вирулентных бактерий. Изменение патогенности может достигаться в результате прямого переноса генов, кодирующих факторы вирулентности, или являться следствием более сложных событий, напри-
и
Sä es »1
Si
р Ü ш SS Hi ■ i
00 s!
мер, изменяющих поверхность бордетелл. Приобретение бактерией резистентности к бактериофагу часто приводит не только к изменению во взаимодействии бактерии с фагом, но и бактерии с макроорганизмом [3].
Вследствие этого интерес к бордетел-лёзным бактериофагам, особенно в связи со сложностью регуляции вирулентности бактерий рода Bordetella, постоянно поддерживается.
Результаты исследований показывают, что бактерии B.bronchiseptica и B.pertussis полилизогенны и содержат два профага. Геномы одного из профагов обнаружены в хромосомах клеток-хозяев. Геномы второго профага присутствуют только в части популяции лизогенных бактерий в автономном состоянии и утрачиваются в процессе культивирования in vitro большей частью бактериальной популяции [3]. Ко второй группе относятся и бактериофаги ВРР-1, ВМР-1 и BIP-1 B.bronchiseptica, имеющие различный тропизм к бактериям, находящимся в разных фазовых состояниях [2, 3, 9].
Развитие компьютерных технологий позволило американским исследователям в 2013 году разработать 3D-модель фага BPP-1 B.bronchiseptica, изучить механизм взаимодействия фагов с клеткой-хозяином, сформулировать общие принципы организации фагового генома и провести поиск геномов профагов в секвенированных хромосомах бактерий. Полная трехмерная структура фага ВРР-1 была сконструирована автора-
ми на основании анализа многочисленных электронных 2D-снимков отдельных частиц, находящихся в угловом диапазоне от -70° до 70°, механизм фаговой структурной адаптации к динамически изменяющимся клеткам-хозяевам состоит в строгом сохранении ДНК материала капсида и относительной мобильности и изменчивости хвостового аппарата, что обеспечивает выживание потомства фага [5].
В литературных источниках мы не нашли подробного описания методики выделения фагов бактерий рода Bordetella. Имеются упоминания, что в 2004 году исследователем Minghsun Liu были выделены бактериофаги B.bronchiseptica путем многократного облучения бактерий ультрафиолетовыми лучами [4].
В 2013 году группа американских исследователей разработала методику выделения фагов для разных фаз B.bronchiseptica (вирулентной BVG + и авирулентной BVG -). Для получения жизнеспособного профага из бактерий B.bronchiseptica в вирулентной фазе 3 мл культуры выращивали 16ч при температуре 37°C и центрифугировали при 225 оборотах в минуту. Собранный супер-натант фильтровали через поры 0,2 мкм. Процедуру проводили с использованием отфильтрованных фагов от предыдущего цикла. Пассаж способствовал увеличению титра фага. Для третьего пассажа отфильтрованные фаги были разделены на две порции для заражения вирулентных (BVG+ фаза) и авирулентных (фаза BVG-) бордетелл. Дальнейшее культивирование приводило к повышению титра фага и получению фагов с отличающимся набором белков. Авторы установили, что многообразие белков фага позволяет ему приспосабливаться к различным фазам существования динамически изменяющихся B.bronchiseptica [6].
По нашему мнению, необходимо разработать методику выделения фагов с испытанием их диагностической и лечебно-профилактической эффективности. По результатам этих испытаний традиционные методы диагностики бордетеллёза животных можно дополнить проведением СПОТ-теста или «метода стекающей капли» с использовани-
ем специфических бордетеллёзных бактериофагов. В этом случае после выделения чистой культуры отпадает необходимость в проведении биохимической идентификации «полевых» штаммов B.bronchiseptica, что значительно сокращает время постановки окончательного диагноза (минимум в 2 раза), снижает трудоёмкость и стоимость анализов. Другой возможностью использования бордетеллезных фагов в диагностических целях является разработка реакции нарастания титра фага (РНФ). С помощью РНФ возможна ускоренная индикация штаммов B.bronchiseptica от животных без этапа выделения чистой культуры при наличии сопутствующей носо-глоточной микрофлоры.
Мы считаем, что комплексное лечение бордетеллёза животных, включающее применение этиотропной, патогенетической и симптоматической терапии, возможно дополнить использованием специфических бордетеллёзных бактериофагов. Препараты в виде капель, крема, геля или мази для носа и глаз необходимо апробировать в лабораторных и клинических условиях на разных стадиях проявления заболевания у животных. Перспективно также исследование возможности применения специфических фагов с профилактической целью для предотвращения переноса возбудителя от больных и заражения восприимчивых животных и людей, а также для санации организма бордетеллоносителей. Интересен вопрос изучения возможности применения бордетеллезных фагов в качестве дезинфицирующих препаратов для санации помещений и предметов окружающей среды.
Для изготовления фаговых биопрепаратов необходимо разработать схему выделения фагов, провести отбор фагов-синерги-стов, обладающих высокой литической активностью, спектром литического действия и высокой устойчивостью к действию физико-химических факторов. Отобранные фаги не должны подавлять активность друг друга при хранении и применении.
Исходя из анализа литературных источников, исследования в данных направлениях не ведутся, но, по нашему мнению, весьма актуальны и требуют дальнейшего
Таблица l
Морфология негативных колоний бактериофагов B.bronchiseptica
№ п/п Морфология негативных колоний
Бактериофаг размер, 0 мм форма зона неполного лизиса
1 B.br. -100 УГСХА 1,5±0,2 округлые прозрачные нет
2 B.br . - 107 УГСХА 3,0±0,4 округлые прозрачные полупрозрачная, шириной 0,7±0,2 мм
3 B.br . - 110 УГСХА 1,6±0,2 округлые прозрачные в центре нет
4 B.br . -111 УГСХА 2,0±0,4 округлые прозрачные в центре нет
5 B.br . - 113 УГСХА 1,5±0,2 округлые прозрачные нет
6 B.br. - 122 УГСХА 3,2±0,3 округлые прозрачные полупрозрачная, шириной 3,5±0,5 мм
7 B.br . - 124 УГСХА 3,6±0,1 округлые, мутные полупрозрачная, шириной 1,5±0,5 мм
8 B.br . - 183 УГСХА 1,9±0,1 округлые прозрачные нет
Литическая активность фагов B. bronchiseptica Таблица 2
№ п/п Фаг Индикаторная культура Активность по Ап-пельману, степень разведения Активность по Гра-циа, количество корпускул в 1 мл
1 B.br. -100 УГСХА B.bronchiseptica № 120 10-7 3,1х108±1,2х108
2 B.br . - 107 УГСХА B.bronchiseptica № 120 10-8 g 4,3х10 ±0,1х109
3 B.br . - 110 УГСХА B.bronchiseptica № 120 10-7 1,8х108±1,3х108
4 B.br . -111 УГСХА B.bronchiseptica № 120 10-6 5,3х107±2,2х107
5 B.br . - 113 УГСХА B.bronchiseptica № 120 10-7 3,1х108±0,3х108
6 B.br. - 122 УГСХА B.bronchiseptica № 120 10-7 2,5х108±0,2х108
7 B.br . - 124 УГСХА B.bronchiseptica № 120 10-8 1,4х10 ±0,1х109
8 B.br . - 183 УГСХА B.bronchiseptica № 120 10-6 5,9х107±1,7х107
изучения.
Целью нашего исследования явилась разработка методов выделения фагов B.bronchiseptica, изучение их основных биологических свойств и возможностей практического применения в ветеринарии.
Объекты и методы исследований
Объектами исследований явились ре-ференс-штаммы B.bronchiseptica № 1, № 7, № 214, № 22-067, № 8344, близкородственные штаммы B.parapertussis № 119 и B.pertussis № 12, 14а, 38; референс-штаммы бактерий других родов: Yersinia pseudotuberculosis № 0630, Morganella morganii, Staphylococcus aureus №АТСС 25923, Escherichia coli № 4, №АТСС 25922, Proteus mirabilis № 1, № 523, № 491, Salmonella typhimurium № 82,
Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis № 189, Providencia rett-geri № 104а, № 102д, № 175, Aeromonas hy-drophila № 01, № 02, Pseudomonas putida № 12633, № 901, Enterobacter cloacae № 1487, № 10005, Bacillus cereus № 2527, Bacillus sub-tillis № 6633, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина», которые, в соответствии с паспортными данными, обладали типичными для бактерий этих видов морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами; 52 штамма B.bronchiseptica, выделенных из клинических образцов биоматериала от собак и кошек (с клинически-
1!
SEIS ES SS »1
Si
Р О Ш Sä i H ■ i
са s!
ми проявлениями респираторных заболеваний); 8 штаммов индуцированных фагов B. bronchiseptica.
Для выделения фагов использовали разработанную нами схему, включающую трёхдневное воздействие ультрафиолетовым излучением (УФЛ) на суточную культуру B.bronchiseptica [10]. Методы работы с фагами включали изучение их основных биологических свойств: морфологию колоний, литическую активность, спектр литического действия, специфичность, устойчивость к физическим и химическим факторам [1015].
Результаты исследований
В процессе работы из 52-х «полевых» штаммов B.bronchiseptica нами было выделено 8 фагов.
По морфологии негативные колонии выделенных фагов разделили на два типа. К первому типу отнесли колонии круглые, прозрачные, диаметром более 3 мм, с зоной неполного лизиса по периферии 0,5 - 4 мм или без неё. Ко второму типу причислили круглые, прозрачные или полупрозрачные колонии, с ровными краями, диаметром до 2 мм (табл. 1).
Литическая активность исследуемых бактериофагов варьировала от 10-6 до 10-9 по методу Аппельмана и от 5,3 х 107 до 4,3 х 109 по методу Грациа (табл. 2).
Спектр литического действия выделенных фагов, использованный на 52 штам-
мах бактерий B.bronchiseptica, составил диапазон от 21,1 % до 82,7%.
Исследования показали, что изучаемые фаги характеризуются различным спектром литического действия. Бактериофаг B.br.-107 УГСХА проявил самый большой спектр литического действия, который составил 82,7%. В результате подсчетов наибольшим совместным спектром литическо-го действия обладали бактериофаги B.br.-107 УГСХА и B.br.-110 УГСХА - 92,5 %.
Далее определили специфичность бактериофагов по отношению к референс-штаммам B.bronchiseptica, а также к близкородственным бордетеллам и возможным носоглоточным ассоциантам.
Выделенные бактериофаги были строго специфичны по отношению к штаммам бактерий B.bronchiseptica, не лизировали бактерии других видов и родов.
n ww
В результате исследований устойчивости выделенных фагов к физико-химическим факторам было установлено, что прогревание фагов при температуре 60°С в течение 30 минут не оказало влияния на активность фагов, все штаммы бордетелл погибали при данной температуре. Нагревание бактериофагов свыше 65°С приводило к потере их активности.
Бактериофаги проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа в течение 30 минут, тогда как все штаммы B.bronchiseptica инактивировались при
Таблица 3
Спектр литического действия выделенных бактериофагов B.bronchiseptica
Бактериофаги
§ § § § § § § §
Штаммы бактерий ё £ ё £ £ £ £ £
B.bronchiseptica (n=52) о о ч 1 гч о ч 1 о ч ч 1 ч ч ч 1 по ч ч 1 <м <ч ч 1 <ч ч 1 по 00 ч 1
.r .b .r .b .r .b .r .b .r .b .r .b .r .b .r .b
CQ CQ со CQ CQ CQ CQ CQ
Количество положительных результатов 25 43 23 29 11 14 14 20
Процент лизируемых культур (%) 48,0 82,7 44,2 55,8 21,1 26,9 26,9 38,5
Таблица 4
Специфичность бордетеллезных фагов
Бактериофаги
fi fi fi Si Si fi fi g
B.bronchiseptica Количество штаммов g о g 14 g о g »4 g rn g <N «N 1 g «N 1 £ 00 4 1
i i i ч 1 1
vi -О vi -О vi -О vi -О vi -О с -O с -O с -о
B. B. B. B. B. B. B. B.
Bordetella bronchiseptica 5 ± ± ± ± ±
Bordetella parapertus- 1
sis
Bordetella pertussis 3 - - - - - - - -
Yersinia pseudotuber- 1
culosis
Morganella morganii 1 - - - - - - - -
Staphylococcus aureus 1 - - - - - - - -
Escherichia coli 2 - - - - - - - -
Proteus mirabilis 3 - - - - - - - -
Salmonella typhimuri- 1
um
Citrobacter freundii 1 - - - - - - - -
Klebsiella pneumonia 1 - - - - - - - -
Enterococcus faecalis 1 - - - - - - - -
Providencia rettgeri 3 - - - - - - - -
Aeromonas hydrophila 2 - - - - - - - -
Pseudomonas putida 2
12633, 901
Enterobacter cloacae 2 - - - - - - - -
Bacillus cereus 1 - - - - - - - -
Bacillus subtillis 1 - - - - - - - -
Примечание: «—» - отсутствие лизиса; «+» - лизис более 75% исследованных штаммов; «+» - лизис 50%-75% исследуемых штаммов
10-минутной обработке.
Выводы
В результате проведенных исследований нами изучены основные биологические свойства выделенных 8-ми фагов B.bronchiseptica. Литическая активность их варьировала от 10-6 до 10-9 по методу Ап-пельмана и от 5,3 х 107 до 4,3 х 109 по ме-
тоду Грациа, а спектр литического действия составил от 21,1 % до 82,7 %. Выделенные бактериофаги обладали специфичностью, проявляли устойчивость при обработке хлороформом (1:10) в течение 30 минут и выдерживали 30-минутное нагревание при 60°С.
Мы считаем перспективной дальней-
SI
SEIS es »1
Si
p Ü Ш IS i H ■ i
ca s!
шую селекцию выделенных фагов с последующей разработкой диагностических и лечебно-профилактических биопрепаратов.
Библиографический список
1. Результаты научных исследований сотрудников кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА им. П.А. Столыпина / Под ред. Васильева Д.А., Золотухина С.Н. - Ульяновск: ГСХА, 2013. - 316 с.
2. Каратаев, Г.И. Мигрирующие генетические элемены Bordetella pertussis, как генетические и эпидемиологические маркеры / Г.И. Каратаев, Л.Н. Синяшина, И.Г. Сивов // Вестник РАМН. - 2000. - №1. - С.34-38.
3. Каратаев, Г.И. Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша: дис... докт. биол. наук, - М. -2008. - 254 с.
4. Синяшина, Л.Н. Характеристика основных биологических свойств бактериофагов Bordetella / Л.Н. Синяшина, И.А. Лапаева, С.М. Мебель // Микробиология. -1982. - Т.8. - С.66-69.
5. Shelton, C.B. Purification and Characterization of a Temperate Transducing Bacteriophage lor Bordetella avium /C.B. Shelton [et al.] //Journal of Bacteriol. - 2000. - V. 82. - P. 6130-6136.
6. Liu, M. Reverse Transcriptase-Mediat-ed Tropism Switching in Bordetella Bacteriophage / M. Liu // Science. - 2002. - V. 295. - P. 2091-2094.
7. Wei, D. Three-dimensional structure of tropism-switching Bordetella bacteriophage / D. Wei // PNAS. - 2010. - V. 107. - №. 9. - P. 4347-4352.
8. Overstreet, C.M. Self-made phage libraries with heterologous inserts in the Mtd of Bordetella bronchiseptica Protein Engineer-
ing / C.M. Overstreet // Design & Selection. -2012. - V. 25. - №. 4. - P. 145-151.
9. Yuan, T.Z. Protein Engineering with Biosynthesized Libraries from Bordetella bronchiseptica Bacteriophage / T.Z. Yuan // PLoS ONE. - 2013. - 8(2): e55617. doi:10.1371/jour-nal.pone.0055617.
10. Васильев, Д.А. Изучение основных биологических свойств бактериофагов Bordetella bronchiseptica, выделенных методом индукции / Д.А. Васильев, Е.Н. Семани-на, С.Н. Золотухин, Ю.Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - №1 (13).
- С. 59-62.
11. Золотухин, С.Н. Разработка оптимальных количественных параметров соотношения культуры и фага для получения препаратов с высокой активностью / С.Н. Золотухин, Л.П. Пульчеровская, Д.А. Васильев // Вестник УГСХА. - 2004. - № 12. - С. 50-53.
12. Васильева, Ю.Б. Разработка методов детекции бактерий Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - №3 (23). - С. 46-52.
13. Васильева, Ю.Б. Сравнительная характеристика методов лабораторной диагностики бордетеллёза / Ю.Б. Васильева // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 4; URL: http://www.science-education.ru/110-9751.
14. Васильева, Ю.Б. Конструирование биопрепаратов для лабораторной диагностики бордетеллёзной инфекции / Ю.Б. Васильева // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
- 2013. - №2 (22). - С. 25-29.
15. Каттер, Э. Бактериофаги. Биология и практическое применение / Э.Каттер, А. Сулаквелидзе. - М.: Научный мир, 2012. - С. 588-593.
