CC BY
81
УДК 619:578.832.1
разработка методов детекции бактерий BORDETELLA BRONCHISEPTICA
Басильева Юлия Борисовна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиологиявирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; e-mail: vet_yulia@mail.ru
Научные исследования проводятся при финансовой поддержке государства в лице Минобрнауки России в рамках реализации федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы (соглашение № 8267 от 10.08.2012).
Ключевые слова; Bordetella bronchiseptica, индикация, идентификация, лабораторные исследования.
В статье представлен материал по разработке тест-системы индикации и идентификации Bordetella bronchiseptica, включающей бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты.
Введение. Bordetella bronchiseptica (B.bronchiseptica) - возбудитель бордетел-лёза животных обнаруживается и вызывает заболевание у подавляющего большинства теплокровных животных: собак, лошадей, свиней, коз, кроликов, кошек, хорьков, хомяков, крыс, морских свинок, обезьян, лис, птиц и мн. др. [1, 2, 3, 4]. Важное эпизоо-тологическое и эпидемиологическое значение бордетеллёза обусловлено возможностью межвидовой передачи возбудителя, перемещениями очага из природных в антропоургические зоны [2, 5, 6, 7]. Ареал распространения бактерий данного вида, по-видимому, повсеместен. Однако строгий учет вспышек бордетеллёзной инфекции ведут только в странах Западной Европы и США [4, 8]. В России заболевание недоста-
точно изучено и в основном диагностируется как респираторная патология невыясненной этиологии, что обусловлено слабым изучением указанного микроорганизма.
Согласно МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий» (2008) для учета штаммов В.ЬгопсЫэерИса используют бактериологический метод с серологическим подтверждением в реакции агглютинации [9]. Эти методы имеют ряд существенных недостатков. Эффективность бактериологического метода редко превышает 40%, длительность анализа до 8 суток. Это связано со слабой устойчивостью бордетелл во внешней среде, медленным ростом возбудителя, несвоевременным и неполным
Рис. 1 - Разработка тест-системы индикации и идентификации бактерий Bordetella bronchiseptica (тСИИ ББР)
обследованием животных с затяжным кашлем, нарушением правил забора и транспортировки материала, несовершенной рецептурой питательных сред, в частности, неудовлетворительным выбором селективных компонентов. При этом среды являются достаточно дорогостоящими [10].
Низкая эффективность иммунологической идентификации B.bronchiseptica обусловлена трудностями внутриродовой дифференциации различных видов бордетелл по антигенным свойствам [11, 12]. Следовательно, микробиологические методы недостаточно чувствительны, а серологические
- слабо специфичны.
Все большее распространение находит лабораторная диагностика, основанная на молекулярно-генетических исследованиях. Широкое применение полимеразноцепной реакции (ПЦР) для идентификации B.bronchiseptica в нашей стране ограничено
в связи с отсутствием стандартизированных праймерных систем, позволяющих проводить точную внутривидовую дифференциацию бордетелл [10]. Зарубежные компоненты для ПЦР дорогостоящи, малоспецифичны и доступны. В связи с этим актуальным направлением является проведение ПЦР в моно- и мультиплексном формате, с регистрацией в электрофорезе и в режиме «реального времени».
Перспективна разработка методов фа-гоидентификации B.bronchiseptica, позволяющая быстро и точно выявить возбудителя при минимальных затратах на расходные материалы, оборудование и специалистов.
В связи с этим целью наших исследований явилась разработка тест-системы индикации и идентификации B.bronchiseptica (ТСИИ ББР).
Материалы и методы исследований. Работа выполнена на базе научно-иссле-
довательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии (НИИЦМиБ) ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».
Часть исследований была выполнена совместно с научными сотрудниками кафедры: Д.Г. Сверкаловой, А.В. Мастиленко, Е.Н. Семаниной.
Объектами исследований явились 5 референс-штаммов B.bronchiseptica, 3 штамма B.pertusis, 1 штамм B.parapertusis, 27 референс-штаммов близкородственных бактерий из кафедральной музейной коллекции; а также 52 штамма B.bronchiseptica, выделенных от животных и S полевых штаммов фагов. В работе использовали общепринятые микробиологические методы выделения и типирования бактерий и фагов, соответствующие им среды, оборудование и реагенты [13, 14, 15, 16, 17].
Результаты исследований. Для выявления и типизации бактерий B.bronchiseptica мы сочли оптимальным применение комплексного подхода путем создания тест-системы индикации и идентификации B.bronchiseptica (ТСИИ ББР), включающей бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты (рисунок 1).
Разработка бактериологического компонента ТСИИ ББР включала изучение комплекса морфологических, культуральных и биохимических свойств бактерий B.bronchiseptica с подбором минимального набора идентификационных тестов, позволяющих провести максимально точную дифференциацию среди близкородственных бордетелл и возможных носоглоточных ассоциантов. Учитывали существующие внутривидовые различия между штаммами и при выборе идентификационных тестов использовали характерные для вида B.bronchiseptica. Так как сложности выделения возбудителя из биоматериала связаны с ростом сопутствующей микрофлоры, влияющей ингибирующе на возбудителя, мы сочли оптимальной разработку селективно-диагностической питательной среды, позволяющей обеспечить преимуществен-
ный рост бактерий B.bronchiseptica при одновременном подавлении ассоциантов. С помощью тестов и разработанной среды подобрали наиболее эффективные бактериологические схемы индикации и идентификации B.bronchiseptica.
Разработка иммунологического компонента ТСИИ ББР включала подбор оптимальной технологии получения специфического антигена и гипериммунной сыворотки, с помощью которых определяли эффективность идентификации B.bronchiseptica в иммунологических реакциях.
Молекулярно-генетическую идентификацию бактерий B.bronchiseptica проводили на основании исследования геномов референс-штаммов B.bronchiseptica с выявлением видоспецифических участков, не встречающихся у других представителей рода Bordetella и остальных бактерий. На основе уникальных участков «генов-мишеней» конструировали системы праймеров для создания универсального протокола ПЦР. Требования к праймерам: длина 20-32 пары нуклеотидов, температура плавления 60-70°С, размер фланкируемого участка гена - 100-1000 п.о. Праймеры выравнивали и определяли димеры, при возможном их некомплементарном связывании самими с собой или попарно. Далее экспериментальным путем подбирали эффективную методику экстрагирования ДНК, оптимизировали параметры ПЦР, учитывая число циклов, временные и температурные характеристики процесса, концентрацию прай-мерных систем и других компонентов реакции. Апробировали ПЦР с разработанными системами праймеров при использовании моноплексного формата ПЦР с детекцией в горизонтальном электрофорезе или в режиме «реального времени», а также мультиплексного формата реакции с одновременным выявлением двух или трех специфических участков генома.
Фаговый компонент тест-системы включал подбор эффективного способа выделения бактериофагов B.bronchiseptica, изучение их специфичности, литической активности и спектра литического действия.
Затем проводили отбор наиболее вирулентных штаммов для создания диагностического биопрепарата. Качество биопрепарата определяли устойчивостью бактериофагов к воздействию внешних агрессивных факторов (физических, химических). Повышением температуры или обработкой хлороформом фаги освобождали от оставшихся бактериальных клеток и детрита, оказывающих негативное влияние на препарат при хранении. Также изучали совместную активность отобранных фагов, чтобы исключить антагонистический эффект при их взаимодействии и учесть спектр их совместного литического действия. С целью фагоиндикации и идентификации бактерий B.bronchiseptica апробировали СПОТ-тест и реакцию нарастания титра фага.
Разработанная тест-система представлена на рисунке 2.
Разработанная нами методика бактериологического исследования включает
взятие глубоких мазков из глотки животных на селективно-диагностическую среду ББР-7 УГСХА с культивированием 24-4S ч (состав среды г/л: пептон ферментативный 20,0; метионин - 0,3; и цистеин - 0,3; никотиновая кислота - 0,1; цефазолина натриевая соль -
0,004; хлорид бария - 0,4; лактоза - 0,7; сахароза - 0,7; мальтоза - 0,7; маннит - 0,7; бром-тимоловый синий - 0,02). Далее проводят отбор не менее 3-х характерных колоний бирюзового цвета, возможно с темным центром в МПБ и культивирование в течение 24 ч при 37°С. Исследование включает микроскопию мазков, окрашенных по Граму, посев на среду Симмонса, тесты на оксидазу и каталазу, экспресс-метод оценки гемолитической активности. Бактериологическое выделение и типизация B.bronchiseptica занимает 3-4 дня. Заключение возможно на 2-е
- 3-и сутки, с условием сочетанного применения бактериологической идентификации с другими компонентами тест-системы.
Рис. 2 - Тест-система индикации и идентификации бактерий B.bronchiseptica
Иммунологическая индикация и идентификация B.bronchiseptica включает получение антигенов ультразвуковой дезинтеграцией (режим: частота 23 кГц, амплитуда колебаний 5 микрон, в течение 1 минуты на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом); иммунной сыворотки гипериммунизацией лабораторных животных (предварительное внутримышечное введение смеси адъюванта Фрейнда с бордетеллёзным антигеном 1:1 в дозе 0,5 мл с последующим внутривенным введением антигена кроликам в дозах 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл с интервалом 3 дня и забором крови через 20 дней) и проведение иммунологических реакций (РА, РИД, РДП). Учет результатов иммунологического исследования производят в течение суток. Возможно проведение массовых обследований подозреваемых в заражении и носительстве животных.
Молекулярно-генетическая индикация и идентификация B.bronchiseptica включает использование праймерных систем (Pr1-1 (5' ccttccagcacctggcggtacgagttgctcc
3'), Pr1-2 (5' ccccgtgccggggtgcctggacctgggcg 3') для гена BfrA ДНК B. bronchiseptica; Pr3-1 (5'ggacgaccaggatcacatcttcc 3'), Pr3-2 (5' gctttcctggtagttgg-cgtagg 3') для гена BfrZ; Pr4-1 (5' gcattgctccatcctgttgtgcg 3'), Pr4-2 (5' gatgggttatctgagcgcgc 3') для гена Cytochrom-C-oxidase и Pr5-1 (5' ctacgggggaaagcggggga 3'), Pr5-1 (5' gaccgtactccccaggcggt 3') для гена 16S rRNA); сорбентный способ экстракции ДНК, температура отжига праймеров 62°С, универсальная концентрация каждого из праймеров - 5 pmol на реакцию объемом 25 мкл; проведение ПЦР в моно- и мультиплексном формате. ПЦР в мультиплексном формате позволяет одновременно выявить 3 участка генов bfrA, bfrZ и ccox, с соотношением праймерных систем - 1:1:3,5 соответственно. Мультиплексный формат ПЦР позволяет проводить массовые исследования, удешевляет и ускоряет лабораторный процесс. ПЦР с регистрацией в режиме «реального времени» с интеркалирующим красителем SYBR Green I дает возможность провести количественную оценку содер-
жания ДНК B.bronchiseptica в биоматериале от 2,3х103 до 6,Sx10S копий ДНК/мл для участка гена bfrZ. Чувствительность ПЦР-исследования с подобранными системами праймеров составила для участков генов bfrA и bfrZ, ccox 5,5х103 бактериальных клеток/мл; для участка гена 16S rRNA - 5,5х102 бактериальных клеток/мл. Современные методы молекулярно-генетической диагностики позволяют получить результаты исследований в течение 1-2 часов.
Индикация и идентификация
B.bronchiseptica с использованием специфичных бактериофагов включает выделение бактериофагов B.bronchiseptica воздействием УФЛ на бордетеллы (1 день: t = 5-7 мин; l = 1м. 2 день: t = 7-10 мин; l = 1м. 3 день: t = 7-10 мин; l = 0,5м); изучение и отбор по биологическим свойствам наиболее активных фагов ББР-110 УГСХА и ББР-107 УГСХА (спектр лизиса 92,5%; литическая активность по Аппельману 10-7-10-S, по Гра-циа 3,^10S - 4,3х109 активных корпускул в 1 мл); изготовление препарата ББР-117 УГСХА (технологические параметры: соотношение количества фаговых корпускул и бактериальных клеток индикаторных штаммов B.bronchiseptica - 1:2, время инкубации при температуре 37°С - 7 ч, обработка хлороформом в пропорции 1:10 в течение 15 мин); фагоиндикацию СПОТ-тестом или реакцией нарастания титра фага. СПОТ-тест позволяет идентифицировать B.bronchiseptica бактерии за 66 ч, реакция нарастания титра фага - за 26 ч. с детекцией бордетелл в концентрации от 103 м.к. в 1 мл.
Выводы. Таким образом, рекомендуем применять тест-систему индикации и идентификации бактерий B.bronchiseptica, включающую бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты для подтверждения клинического диагноза, выявления атипичных форм заболевания, обнаружения бактерионосителей в окружении больных животных, а также для установления ретроспективного диагноза.
Для эффективной индикации и идентификации бактерий B.bronchiseptica воз-
можно использование как отдельных компонентов тест-системы, так и их сочетанное применение.
Библиографический список
1. McGowan, J.P. Some observations on a laboratory epidemic, principally among dogs and cats, in which the animals affected presented the symptoms of the disease called "distemper" / J.P. McGowan // J. Pathol. Bacteriol. - 1911. - V.15. - P.372-430.
2. Woolfrey, B.F. Human infections associated with Bordetella bronchiseptica / B.F. Woolfrey, and J.A. Moody // Clin. Microbiol. Rev. - 1991. - V.4. - P.243-255.
3. Guzman, C.A. Invasion and intracellular survival of B.bronchiseptica in mouse dendritic cells / C.A. Guzman, M. Rohde, M. Bock, K.N. Timmis // Infect. Immun. - 1994. - V.62. -P.5528-5537.
4. Yuk, M.H. Modulation of host immune responses, induction of apoptosis and inhibition of NF-кВ activation by the Bordetella type III secretion system / M.H. Yuk, E.T. Harvill, P.A. Cotter, J.F. Miller // Mol. Micmbiol. - 2000. -V.35. - Р.991-1004.
5. Gueirard, P. Intranasal inoculation of B.bronchiseptica in mice induces long-lasting antibody and T cell-mediated immune responses / P. Gueirard, P. Minoprio, N. Guiso // Scand. J. Immun. - 1996. - V.43. - P.181-192.
6. Dworkin, M.S. B.bronchiseptica infection in human immunodeficiency virus-infected patients / M.S. Dworkin, P.S. Sullivan, S.E. Buskin et al. // Clin Infect Dis. - 1999. -V.28. - P1095-1099.
7. Kattar, M.M. Application of 16S rRNA gene sequencing to identify Bordetella hinzii as the causative agent of fatal septicemia / M.M. Kattar, J.F. Chavez, A.P. Limaye et al. // J Clin Microbiol. - 2000. - V.38. - P.789-794.
8. Методические указания «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий». - М. - 2008.
9. Борисова, О.Ю. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов B.pertussis, обладающих различными ptx генами / О.Ю. Борисова, С.Ю. Ком-барова, Н.Т. Гадуа, И.К. Мазурова // Журнал микробиологии. - 2008. - №5. - С80-83.
10. Мастиленко, А.В. Разработка методики серологической идентификации Bordetella bronchiseptica с помощью электрофореза // А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова, Е.Г. Семанин, Ю.Б. Васильева / Материалы III-й Международной научно-практической конференции молодых ученых / Молодежь и наука XXI века // Актуальные вопросы микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и биотехнологии. - Ульяновск.- 2010. - Т. 1. - С. 47-49.
11. Васильев, Д.А. Использование количественной ПЦР для идентификации Bordetella bronchiseptica / Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева, Д.Г. Сверка-лова // Молекулярная диагностика - 2010: Сборник трудов VII Всеросиийской научнопрактической конференции с международным участием. - Москва, 2010. - С.68-70.
12. Адамс, М. Бактериофаги / М. Адамс // М.: Медгиз, 1961. - 521 с.
13. Габрилович, И.М. Общая характеристика бактериофагов / И.М. Габрилович // Основы бактериофагии. -Минск. - 1973. - С. 5-24.
14. Лабинская, А.С. Микробиология с техников микробиологических исследований. М.: Медицина, 2004. - 394с.
15. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. Пер. с англ. / С. Херрингтон [и др.] - М.: Мир, 1999. - 193 с.
16. Тимаков, В.Д. Реакция нарастания титра фага (РНФ) / В.Д. Тимаков, Д.М. Голь-дфарб // М., 1962. - С. 65-71.
17. Золотухин, С.Н. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий /
С.Н. Золотухин // Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. - Ульяновск, 2007. - 39 с.
