CC BY
44
УДИ 619:579.62
10.18286/1816-4501-2015-4-73-77
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ДЕТЕКЦИИ BORDETELLA BRONCHISEPTICA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕЦИФИЧЕСКИХ БАКТЕРИОФАГОВ
Васильева Юлия Борисовна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
Богданов Ильгизар Исмаилович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»
ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1, тел.: 8(8422)55-95-47, e-mail: vet_yulia@mail.ru
Ключевые слова: Bordetella bronchiseptica, индикация, бактериологическая схема, фаги, идентификация.
В статье представлены материалы по разработке новых схем бактериологической индикации и идентификации бактерий вида Bordetella bronchiseptica. Авторами предложены усовершенствованные схемы с применением разработанной дифференциально-диагностической среды, селективной добавки и биопрепарата, содержащего фаги бактерий Bordetella bronchiseptica.
Введение
Сложность лабораторной диагностики бордетеллеза, его распространённость среди животных актуализируют поиск и разработку схем, пригодных для быстрой и точной индикации и идентификации возбудителя.
Истинная заболеваемость бордетел-лезом домашних животных (кошки, собаки, грызуны) значительно выше за счет частого протекания инфекции в атипичных формах (латентная, абортивная, носительство). Трудности клинической диагностики инфекции на ранних стадиях заболевания или его проведение на поздних сроках, а также после продолжительного лечения антибиотиками, отсутствие обследования кашляющих более 1-2 недель взрослых животных приводит к низкому проценту выявляемое™ возбудителя бордетеллёза. Уровень бактериологического подтверждения диагноза составляет 10 - 20% [1, 2].
Современные экспрессные, высокочувствительные и специфичные методы лабораторной диагностики крайне необходимы в связи с эпизоотологической возможностью межвидовой передачи возбудителя среди животных (собаки, кошки, свиньи, грызуны) и эпидемиологическим значением в инфи-
цировании людей [3-13].
Метод фа годна гностики широко используется в лабораторной практике для идентификации различных видов микроорганизмов. Фагоидентификация возбудителей инфекций основана на учете лизиса выделяемых культур, вызванного фагом с известным диапазоном действия. Феномен лизиса является основой для использования фага в диагностических целях. Следовательно, бактериофаг представляет собой инструмент, устанавливающий видовую принадлежность микроорганизма, выделенного из исследуемого материала при помощи бактериологического метода.
В настоящее время проба с бактериофагами, в силу их специфичности и избирательности действия, является надёжным методом детекции возбудителей инфекций животных и человека из доступных рядовой лаборатории [14,15,16].
В связи с этим, целью нашего исследования явилась разработка новых бактериологических схем детекции, бактерий вида Bordetella bronchiseptica.
Объекты и методы исследований
Работа выполнена на базе научно-исследовательского инновационного центра
Рис. 1 - Схемы бактериологической детекции бактерий вида B.bronchiseptica, где: а -
разработанная нами схема №1; б-схема, изложенная в МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикоз-ных бактерий» [1 ]
микробиологии и биотехнологии (НИИЦ-МиБ) ФГБОУ ВО Ульяновская ГСХА.
Объектами исследований были 5 ре-ференс-штаммов B.bronchiseptica, 3 штамма
B.pertusis, 1 штамм B.parapertusis, 2П рефе-ренс-штаммов близкородственных бактерий из музейной коллекции кафедры. Использовали тонзиллитные и назофагингеальные мазки от животных, искусственно контами-нированные индикаторными штаммами концентрации 105 — IC^m.к. в 1 мл. Пробы предварительно исследовали бактериологическим методом на отсутствие B.bronchiseptica.
В работе использовали общепринятые микробиологические методы, а также авторские усовершенствованные методики [2-17].
Нами были апробированы схемы бак-
териологической детекции B.bronchiseptica в сравнении с изложенной в МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий» [1].
Результаты исследований
На первом этапе экспериментальной работы испытания проводили на лабораторных штаммах. Схема №1 включала следующие исследования (рис. 1).
1- е сутки: исследуемый материал высевали на 2 чашки с дифференциально-диагностической средой без и с селективной добавкой. Инкубировали 24-48 ч в термостате при температуре 36-37°С до появления визуально различимых колоний.
2- 3-е сутки: отбирали не менее 3-х ха-
Рис. 2 - Схемы бактериологической детекции бактерий вида B.bronchiseptica, где: а - разработанная схема №2; б - разработанная схема № 1
рактерных колоний бирюзового цвета. Проводили микроскопию окрашенных по Граму мазков с выявлением грамотрицательных мелких коккобацилл, равномерно располагающихся в мазке одиночно, по парам или короткими цепочками. Гемолитическую активность устанавливали на стекле микрометодом. Для выделения чистой культуры и наращивания бактериальной массы отсеивали колонии в МПБ и на МПА. Учитывали предварительный результат. При отсутствии подозрительных колоний продолжали культивирование.
3-4-е сутки исследования: изучали чистую культуру, проводили микроскопию, экспресс-тесты на цитраты и нитритредуктазу. Учитывали окончательный результат.
В результате многократных испытаний установили, что проведение бактериологического анализа по общепринятой
схеме занимает 72-120 ч, тогда как проведение исследования по предлагаемой нами схеме N°l-49-98 4. При использовании разработанной дифференциально-диагностической среды и селективной добавки сокращается количество биохимических идентификационных тестов. Усовершенствованный метод определения гемолитической активности ускоряет анализ. Испытанные схемы показали 100% специфичность по отношении к бактериям B.bronchiseptica.
Следующим этапом исследований явилось включение в разработанную схему №1 метода «стекающая капля» с нанесением специфичных бактериофагов на газон роста культуры - схема №2 (рис. 2).
Посев материала проводили на разработанную нами питательную среду, с инкубацией в течение 20-24 ч при 36-379С. При на-
линии визуально различимых однотипных колоний поводили микроскопию с окраской по Граму и отсев на МПБ с культивацией 18 ч при 36-375С. Для фагоидентификации на поверхность МПА в чашках Петри пипеткой наносили 3-4 капли суточной бульонной культуры исследуемых образцов. Культуру равномерно распределяли по поверхности среды стерильным шпателем. Газоны подсушивали 15-20 мин в термостате. Чашку Петри делили на сектора и на поверхность культуры пипеткой наносили каплю биопрепарата с бактериофагами. В качестве контроля наносили стерильный МПБ. Наклоняли чашку, чтобы капли стекли. Выдерживали образцы в боксе 15-20 мин для подсушивания, затем культивировали в термостате при 36-379С в течение 18 ч.
Наличие зоны лизиса на сплошном газоне роста культуры в месте нанесения фагов указывало на принадлежность исследуемого штамма к бактериям вида B.bronchiseptica. Отрицательным считали результат при отсутствии лизиса на газоне культуры. При наличии отрицательных и сомнительных результатов фагоидентификации проводили дополнительные биохимические тесты.
В результате проведенных исследований установили, что продолжительность анализа при включении в схему «метода стекающей капли» сокращается до 60 ч, при меньшем расходе питательных сред, реактивов, лабораторной посуды.
Испытание схем на близкородственных тест-штаммах во всех экспериментах показало отрицательный результат.
Установили, что аналитическая чувствительность разработанной бактериологической схемы с использованием дифференциальнодиагностической среды с селективной добавкой и схемы, изложенной в МУК 4.2.2317-08 «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий», составляет 104 м.к./мл, схемы с использованием бактериофагов -103 м.к./мл.
Выводы
Усовершенствованная схема бактериологической детекции бактерий вида
B.bronchiseptica с использованием фагоидентификации включает взятие биоматериала на разработанную дифференциально-диагностическую среду с селективной добавкой и
без неё с культивированием 24 ч при 36-379С, отбор не менее 3-х характерных колоний бирюзового цвета, микроскопию мазков, окрашенных по Граму, подтверждение методом «стекающей капли» со специфическими бактериофагами. В сомнительных случаях схему дополняют биохимическими тестами. Гемолиз проводят экспресс-методом на стекле в течение 15-30 мин.
Разработанная схема позволяет идентифицировать возбудителя бордетеллёза в течение 60 ч, тогда как продолжительность исследований по традиционной схеме детекции бактерий вида B.bronchiseptica составляет 72-120 ч.
Библиографический список
1. Методические указания «Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий». МУК 4.2.2317-08.
- М. - 2008.
2. Методические рекомендации «Инфекции дыхательных путей. Диагностика коклюша и паракоклюша». МР 3.1.2.0072-13.
- М. - 2013.
3. Васильев, Д.А. Разработка методов выделения и селекции бактериофагов Вог-detella bronchiseptica / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Е.Н. Семанина // Материалы Международной научно-практической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». -Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина. - 2013. - T.I. - С. 28-32.
4. Васильев, Д.А. Технология конструирования диагностического биопрепарата на основе бактериофагов Bordetella bronchiseptica и перспективы его применения / Д.А. Васильев, Ю.Б. Васильева, Е.Н. Семанина // Материалы Международной научнопрактической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности». - Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина. - 2013. - T.II. - С. 99-104.
5. Васильева, Ю.Б. Изучение аналитической чувствительности и диагностической эффективности тест-системы индикации и идентификации бактерий B.bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, Д.А. Васи-
льев, Р.Р. Бадаев, С.В. Мерчина, И.Г. Швиден-ко, А.С. Скорик // Современные проблемы науки и образования. - 2014. - С. 596.
6. Васильева, Ю.Б. Биопрепараты для детекции бактерий Bordetella bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Масти-ленко, Д.Г. Сверкалова // Инфекция и иммунитет. - 2014.-№ S. - С. 70-71.
7. Актуальные вопросы лабораторной диагностики бордетеллёза животных и брон-хосептикоза людей/Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова // Инфекция и иммунитет. 2014. - N° S. - С. 70.
8. Ломакин, А.А. Чувствительность к антимикробным средствам бактерий вида Bordetella bronchiseptica / А.А. Ломакин, А.В. Мастиленко, Ю.Б. Васильева // Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии: материалы 1-ой Международной заочной научно-практической конференции. - Ульяновск: УлГПУ. - 2014. - С. 144147.
9. Комплексный биопрепарат на основе фагов / А.Г. Семанин, Е.И. Суркова, А.С. Скорик, Ю.Б. Васильева, Н.А. Феоктистова, А.Н. Пирюшова, Н.Р. Уралов // Фундаментальные и прикладные исследования по приоритетным направлениям биоэкологии и биотехнологии: материалы 1-ой Международной заочной научно-практической конференции. - Ульяновск: УлГПУ. - 2014. - С. 79-82.
10. Проблемы лабораторной диагностики бордетеллёза животных и пути их решения / Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, А.Г. Семанин, А.С. Скорик, Е.И. Суркова // Аграрная наука - сельскому хозяйству: сборник статей IX-й Международной научно-практической конференции. - Барнаул: РИО АГАУ. -2014.-С. 257-259.
11. Наборы для детекции бактерий вида В.bronchiseptica / Ю.Б.Васильева, А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, А.Г. Семанин, Е.И. Суркова, А.С. Скорик, А.Н. Пирюшова, Н.Р. Уралов // Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных: матери-
алы Международной научно-практической конференции, посвященной 55-летию ВНИ-ИВВиМ,-2014.-С. 48-53.
12. Алгоритмы использования тестсистемы индикации и идентификации бактерий В.bronchiseptica / Ю.Б. Васильева, А.В. Мастиленко, Д.А. Васильев, Р.Р. Бадаев, С.В. Мерчина, И.Г. Швиденко, Е.И. Суркова // Современные проблемы науки и образования. -2014.-С. 606.
13. Vasylyeva, Yu.В. Selection of the complex of microbiological tests for Bordetella bronchiseptica typing / Yu.B. Vasylyeva // Вестник Орловского государственного аграрного университета. - 2013. - Т. 43. - N° 4. - С. 44-46.
14. Феоктистова, Н.А. Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов бактерий Bacillussubtilis / Н.А. Феоктистова // В книге: «Бактериофаги микроорганизмов значимых для животных, растений и человека». - Ульяновск, 2013. - С. 186-197.
15. Биоиндикация бактерий Bacillus ту-coides в объектах санитарного надзора / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Н.А. Феоктистова, М.А. Лыдина, А.И. Калдыркаев, В.А. Макеев, И.Г. Швиденко // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 3 (23). - С. 52-56.
16. Распространение Bacillus cereus и Bacillus mycoides в объектах санитарного надзора / Н.А. Феоктистова, А.И. Калдыркаев, ДА Васильев, С.Н. Золотухин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2014. - N° 1 (25). - С. 68-76.
17. Разработка параметров постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий Bacillus mesentericus в объектах санитарного надзора / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, А.В. Алешкин, Н.А. Феоктистова,
С.В. Мерчина, В.В. Батраков, М.А. Юдина, В.А. Макеев, Н.А. Романова // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2012. - N° 3. - С. 69-73.
