CC BY
32
Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума
Инфекция и иммунитет
пыриной, M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski, Э. Каттер, А. Сулаквелидзе, C.P. Sword, M.J. Pickett, С.Н. Золотухина.
В качестве тест-штамма для оптимизации параметров индукции использовали вирулентный штамм L. Monocytogenes — 766, индикаторным служил референс-штамм L. monocytogenes 9-127. В качестве индуцирующего агента использовали ультрафиолетовые лучи (УФ-лучи), источником которых служила ртутно-кварцевая лампа, дающая не менее 90 % излучаемой энергии в виде УФ-лучей с длиной волны 254 нм. Плотность среды при облучении, время экспозиции и расстояние до источника света варьировали.
В результате проведенных исследований выделены три листериозных бактериофага, разработана оптимальная схема выделения методом индукции УФ-лучами. Экспериментально установлено, что для облучения наилучшим образом подходит жидкая слабощелочная среда, время экспозиции — 30 с, расстояние до источника излучения — 40 см.
Т018 АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОРДЕТЕЛЛЁЗА ЖИВОТНЫХ И БРОНХОСЕПТИКОЗА ЛЮДЕЙ
Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова
ФГБОУВПО УГСХА им. П.А Столыпина
В России отсутствуют официальные статистические данные по распространению бордетеллёза животных и бронхосептикоза людей, что, по-нашему мнению, обусловлено отсутствием эффективных мер детекции возбудителя.
Мы разработали тест-систему индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica (ТСИИ), включающую бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты.
Бактериологическая детекция бактерий B. bronchiseptica включает взятие глубоких мазков из глотки на 2 чашки Петри с дифференциально-диагностической средой с селективными компонентами и без них и культивирование в течение 24—48 ч при t 35—37°С. Далее проведение отбора характерных колоний и дополнительное изучение их свойств. Срок проведения исследования 72—96 ч. Иммунологическая детекция бактерий B. bronchiseptica проводится как дополнение бактериологической идентификации при помощи пластинчатой реакции агглютинации на предметном стекле или реакции диффузной пре-цепитации. Максимальный срок проведения анализа в течение часа. Молекулярно-генетическая детекция бактерий B. bronchiseptica включает выделение нуклеиновых кислот из культур сорбентным способом, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с системами праймеров, детекция с помощью горизонтального электрофореза и в режиме «реального времени». Программа проведения ПЦР с электрофоретической детекцией — 1) 95°С—5 мин,
2) 95°С—10 сек, 62°С—10 сек, 72°С—20 сек — 40 циклов,
3) 72°С—2 мин; для детекции в режиме реального времени — 1) 95°С - 5 мин, 2) 95°С - 10 сек, 62°С -15 сек — 40 циклов, 3) 72°С — 1 мин. Детекция бактерий B. bronchiseptica специфическими фагами осуществляют с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ) с использованием биопрепарата «ББР-117 УГСХА». РНФ позволяет обнаружить бордетеллы в концентрации от 103 м.к. в 1 мл исследуемого биома-
териала за 26 часов без выделения чистой культуры. В качестве дополнения к бактериологической детекции проводят реакцию «стекающей капли». Срок исследования составляет до 66 ч.
ТСИИ возможно использовать для подтверждения клинического диагноза, выявления атипичных форм заболевания, обнаружения бактерионосителей в окружении больных животных, а также для установления ретроспективного диагноза.
Т019 БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ BORDETELLA BRONCHISEPTICA
Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова
ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина
Для детекции бактерий Bordetella bronchiseptica мы разработали биопрепараты.
Для выделения чистой культуры бактерий B. bronchiseptica сконструирована дифференциально-диагностическая среда (состав г/л: пептон ферментативный 20,0; сернокислое железо — 0,02 г/л, сернокислый магний — 0,4 г/л, хлорид натрия 4,5—6,5 г/л, крахмал 5,0 г/л, мочевина 5,0 г/л, лактоза — 0,7; бромтимоловый синий — 0,02; хлорид бария — 0,4); селективные добавки (цефазолин — 0,004 г/л, ампициллин — 0,0025 г/л, флуконазол, миконазол — 0,002 г/л. рН среды 7,0+0,2. Для антигенной детекции возбудителя бордетеллёза предлагаем использовать антиген B. bronchiseptica, получаемый методом ультразвуковой дезинтеграцией (частота 23 кГц, амплитуда колебаний 7 микрон, в течение 1 мин. на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом) и иммунную сыворотку, получаемую гипериммунизацией кроликов (предварительное внутримышечное введение смеси адъюванта Фрейнда с бордетеллёзным антигеном 1:1 в дозе 0,5 мл с последующим внутривенным введением антигена кроликам в дозах 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл с интервалом 3 дня и забором крови через 20 дней).
Для обнаружения ДНК бактерий B.bronchiseptica в биоматериале без выделения чистой культуры или как подтверждение бактериологического исследования рекомендуем праймеры (Pr1-1 (5' ccttccagcacctggcggtacgagttgctcc 3'), Pr1-2 (5' ccccgtgccggggtgcctggacctgggcg 3') для гена BfrAДHКB.bronchisepft'ca; Pr3-1 (5'ggacgaccaggatcacatcttcc 3'), Pr3-2 (5' gctttcctggtagttgg-cgtagg 3') для гена BfrZ; Pr4-1 (5' gcattgctccatcctgttgtgcg 3'), Pr4-2 (5' gatgggttatctgagcgcgc 3') для гена Cytochrom—C—oxidase и Pr5-1 (5' ctacgggggaaagcggggga 3'), Pr5-1 (5' gaccgtactccccaggcggt 3') для гена 16S rRNA), флуоресцентный зонд для системы праймеров участка гена bfrZ.
Для обнаружения бактерий B. bronchiseptica реакцией нарастания титра фага (РНФ) без выделения чистой культуры или в качестве подтверждения бактериологического исследования методом «стекающей капли» рекомендуем применять фаговый биопрепарат ББР—117 УГСХА. Технологические параметры изготовления препарата: получение борде-теллёзных фагов ультрафиолетовой детекцией культуры, соотношение количества фаговых корпускул и бактериальных клеток индикаторных штаммов В. bronchiseptica — 1:2, время инкубации при температуре 37°С — 7 ч, обработка хлороформом в пропорции 1:10 в течение 15 мин.
2014. Специальный выпуск
Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума
Разработанные биологические препараты позволяют осуществить раннюю и точную детекцию бактерий Bordetella bronchiseptica.
Т020 БАКТЕРИОФАГИ, АКТИВНЫЕ В ОТНОШЕНИИ ОСНОВНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БОЛЕЗНЕЙ РЫБ, И ПЕРСПЕКТИВЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В ЦЕЛЯХ ДИАГНОСТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ
Д.А. Викторов, Т.А. Гринева, Д.А. Васильев, И.Г. Горшков, Н.Г. Куклина
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. ПА.Стольтина»
Бактериальные инфекции рыб, в наибольшей степени аэромонозы и псевдомонозы, наносят ощутимый экономический ущерб интенсивно развивающейся аквакультуре. К экономическим потерям приводят повышенные уровни смертности рыбы, уменьшение темпов роста из-за инфекции и потеря товарного вида рыбы.
В настоящее время лечение бактериальных заболеваний рыб заключается в применении антибиотиков широкого спектра действия, высокомолекулярных соединений, содержащих йод, а также формалина. Для диагностики используются трудоемкие и продолжительные по времени схемы. Альтернативным диагностическим методом может стать применение бактериофагов, позволяющих надежно дифференцировать возбудителей бактериальных инфекций, а порой проводить детальную дифференциацию отдельных типов и вариантов внутри вида. Применение бактериофагов не ограничивается диагностикой, рассматриваются перспективы их применения как профилактических и лечебных средств.
В ходе проведенных исследований из объектов внешней среды были выделены бактериофаги, специфичные для бактерий Aeromonas hydrophila, Aeromonas sal-monicida, Aeromonas sobria, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida. Исследованы их основные биологические свойства: морфология негативных колоний, устойчивость к обработке хлороформом, температурная устойчивость, видовая и родовая специфичность, литическая активность.
Выделенные группой авторов бактериофаги F43-УГСХА, Аге25-УГСХА, Aer.sobrJ-УГСХА, PfOlFl-УГСХА, Рс55F-УГСХA, PsplO-УГСХА обладают широким спектром литического действия, относительно просты в получении в высоком титре, устойчивы к процедурам очитки от бактерий, и могут быть рассмотрены в качестве потенциальных компонентов при создания препарата для лечения и профилактики бактериальных заболеваний рыб, и использоваться для идентификации A. hydrophila, A. salmonicida, A. sobria, P. chlororaphis, P. fluorescens, P. putida в объектах окружающей среды и при диагностики инфекций рыб.
Т021 ФАГОИНДИКАЦИЯ AEROMONAS HYDROPHILA
Д.А. Викторов, И.Р. Насибуллин, И.Г. Горшков, Н.Г. Куклина, Т.А. Гринева, Д.А. Васильев
ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. ПА.Стольтина»
Бактерии Aeromonas hydrophila широко распространены в окружающей среде и известны как возбудители аэромоноза — инфекционного заболевания многих видов рыб и других гидробионтов. Аэромо-ноз встречается повсеместно и наносит значительный экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам. Контаминированная аэромонадами рыбная
продукция представляет собой источник пищевых инфекций человека.
Индикация и идентификация аэромонад является трудоемким и длительным (до 120 ч) процессом. Типирование до рода Аегошоиаз требует применения сложных и дорогостоящих сред и проведения ряда узких тестов, что обуславливает недостоверность исследования. Внутривидовая идентификация из-за незначительных различий между видами сложна и может служить причиной ошибок.
В результате проведённых исследований из объектов окружающей среды (103 пробы воды из водоемов Ульяновской области) были выделены бактериофаги, активные в отношении бактерий Аегтопая hydrophila, исследованы их основные биологические свойства и разработан диагностический биопрепарат. На основе созданного биопрепарата предложен новый метод индикации Аегошоиаз hydrophila с применением реакции нарастания титра фага.
Препарат бактериофага Б43-УГСХА обладает всеми необходимыми для проведения РНФ свойствами: титр бактериофага 2,0х108, спектр литиче-ской активности 86,7%, строгая специфичность по отношению к бактерии А. hydrophila.
Разработана схема постановки РНФ с использованием биопрепарата бактериофага Б43-УГСХА, которая позволяет проводить индикацию Aeromonas hydrophila в различных объектах количестве от 103 м.к./ мл в течение 24 ч. Реакция обладает высокой чувствительностью, специфичностью, не требует выделения чистой культуры возбудителя, дорогостоящего оборудования и материалов, методика достаточно проста.
Все перечисленное позволяет судить о высокой экономической эффективности метода РНФ в сравнении с существующими методами индикации аэромонад.
Т022 ЭКОЛОГИЯ ПИТАНИЯ - ЭТО ПРОБИОТИЧЕСКИЕ ПРОДУКТЫ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ
А.В. Витавская, Г.Н. Дудикова, Д.Б. Баймуханова, А.Ж. Рустемова, Ю.Г. Пронина
Алматинский технологический университет, Казахский НИИ перерабатывающей и пищевой промышленности, г. Алматы, Республика Казахстан
Почвенные микроорганизмы В. subtilis, попадающие с земли на зерно, а затем в муку в споровой форме при соприкосновении с водой, т.е. на стадии приготовления теста, остаются в физиологически активном состоянии до зоны выпечки, когда при температуре 92—960С они снова переходят из вегетативной формы в спору и ожидают благоприятного момента, когда можно снова дать рост и проявлять ферментативную активность.
Цель — выявить наличие продуктов жизнедеятельности молочнокислых бактерий в тесте, в том числе антибиотико-подобные вещества, подвергающиеся влиянию высоких температур.
В момент выхода горячего хлеба из печи посевы контрольных (без добавления закваски) и опытных проб (с добавлением закваски) выявили одинаковую картину — на чашках Петри дали рост колонии В. subtilis одинаковое количество. Однако, по мере хранения хлеба в провоцирующих условиях (температура 370С, относительная влажность 85%), контрольный вариант заболел через 18 часов, а в опытном, куда добавляли 10% к массе муки высококислотной закваски мезофильных молочнокис-
