CC BY
60
УДК 602.3:579.6
DOI 10.18286/1816-4501-2018-3-184-188
БАКТЕРИОФАГИ БАКТЕРИЙ LISTERIA SPP. И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Сульдина Екатерина Владимировна1, ассистент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Васильев Дмитрий Аркадьевич1, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Обухов Игорь Леонидович2, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник
1 ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
2 Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии — филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской академии наук» (ВНИИВСГЭ — филиал ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН)
1432017. г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 89374545651, e-mail: e.suldina2006@yandex.ru
2123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5.
Ключевые слова: Listeria, Listeria monocytogenes листерии, листериоз, пищевые патогены, фаг, бактериофаги, бактерии, биологические свойства.
В статье представлены результаты исследований по изучению биологических свойств 5 изолятов бактериофагов бактерий рода Listeria и отбору наиболее перспективного штамма фага с целью конструирования биопрепарата для деконтаминации рыбного, мясного сырья и готовой продукции. Установлено, что все 5 штаммов изучаемыхлистериозных бактериофагов L.m 1 УлГАУ, L.m 2 УлГАУ, L.m 4 УлГАУ, L.m 6 УлГАУ, L.m 12 УлГАУ имеют различную морфологию негативных колоний. Литическая активность изучаемых фагов находится в пределах от 1,2±0,1х107 до 2,9±0,1х1010 по Грациа и от Шдо 10-9 по методу Аппельмана. Установлено отсутствие активности изучаемых бактериофагов в отношении бактерий гетерологичных родов, однако, бактериофаг L.m 4 УлГАУ кроме культур L.monocytogenes, лизировал культуры других гемолетически активных видов листерий L.ivanovii и L.seeligeri. Диапозон литического действия фагов находится в пределах 37,5 % до 86,8%. Бактериофаги умеренно устойчивы к воздействию температуры и устойчивы к 45 минутному воздействию хлороформа. При хранении в течение 6 месяцев литическая активность исследуемых бактериофагов снижалась в пределах одного порядка. При хранении бактериофагов в лиофильновысушенном состоянии титр фага снижался в пределах одного порядка, даже при хранении в течение 12 месяцев. Таким образом, опираясь на полученные данные, по совокупности изученных биологических свойств для дальнейших исследований нами был отобран бактериофаг L.m 4 серии УлГАУ, обладающий свойствами, позволяющими использовать его в составе биопрепарата для деконтаминации рыбного, мясного сырья и готовой продукции.
Исследования проводятся в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ, выполняемых по заданию МСХ РФ в 2018 году.
Введение
Listeria monocytogenes - опасный пищевой патоген [1]. Этот бактериальный вид - вездесущ по своей природе и может загрязнять производственные линии пищевой промышленности в любой критической контрольной точке. Возрастающее сопротивление этих микроорганизмов дезинфицирующим средствам при определенных условиях требует использования более высоких концентраций химических продуктов [2]. Кроме того, бактерии, подверженные воздействию дезинфицирующих средств, могут с большей вероятностью развивать устойчивость к антибиотикам [3].
Поиск альтернативных решений для преодоления этих проблем вызвал интерес к бактериальным вирусам (бактериофагам) в области сельского
хозяйства [4], аквакультуры [5], безопасности пищевых продуктов [6] и инфекционных заболеваний [7, 8].
Использование бактериофагов, активных в отношении Listeria spp. в качестве биодезинфек-танта, представляет собой альтернативу, которая могла бы уменьшить использование химических соединений в пищевой промышленности и снизить концентрации токсичных отходов в окружающей среде [9]. Специфические биодезинфецирую-щие средства, состоящие из суспензий высоковирулентных фагов с широким спектром действия, позволят элиминировать (разрушить) патогенные микроорганизмы [10] с поверхности пищевого сырья и готовых к употреблению пищевых продуктов в т.ч. рыбной и мясной продукции.
В связи с этим целью нашей работы было изучение биологических свойств бактериофагов бактерий Listeria spp. и отбор перспективных штаммов фагов для конструирования биопрепарата для де-контаминации рыбного, мясного сырья и готовой продукции.
Задачи исследования:
1. Изучить морфологию негативных колоний бактериофагов бактерий рода Listeria spp.
2. Определить литическую активность листе-риозных фагов.
3. Изучить спектр литического действия фагов бактерий Listeria spp.
4. Определить специфичность фагов Listeria
spp.
5. Изучить устойчивость листериозных бактериофагов к воздействию температуры и хлороформа.
6. Отобрать штаммы фагов для конструирования биопрепарата.
Объекты и методы исследований
Бактериофаги, специфичные к бактериям рода Listeria spp. - 5 изолятов: L.m 1 УлГАУ, L.m 2 Ул-ГАУ, L.m 4 УлГАУ, L.m 6 УлГАУ, L.m 12 УлГАУ, выделенные и селекционированные авторами.
В экспериментах использовали чистые штаммы культур бактерий, полученые из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ в количестве 67 штук. Из них 53 принадлежали Listeria spp и 14 штаммов гете-рологичных родов: Erysipelothrix spp, Jonesia spp, Staphylococcus spp, Rhodococcus spp, Enterobacter spp, Pseudomona spp, Proteus spp. Культуры бактерий обладали типичными для данных видов биологическими свойствами.
Работа с бактериофагами проводилась по методикам, ранее апробированным сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновского ГАУ [11-13].
Результаты исследований
Морфологию негативных колоний фагов изучали при посевах фагов методом агаровых слоев. Негативные колонии, образуемые изучаемыми
Описание морфологии негативных колоний
бактериофагами, имели различную морфологию (табл. 1, рис. 1-2).
Для размножения бактериофагов на плотной питательной среде фаг и культуру засевали методом агаровых слоев в таком соотношении, при котором наблюдается сплошной лизис бактерий. Верхний слой агара, в котором сконцентрированы фаговые частицы, освободившиеся из клеток в результате лизиса, осторожно снимали шпателем и переносили в пробирку, куда добавляли мясо-пептонный бульон из расчета 5 мл на одну чашку. Содержимое пробирки ресуспендировали и оставляли на 30-40- минут при комнатной температуре, затем центрифугировали 20 минут при 3000 об/ мин, (ELMI Центрифуга медицинская СМ-6М, Латвия), что позволяло освободить фаголизат от крупных частичек агара. Для более полной очистки фа-гализата от остатков агара и бактериальных клеток жидкость повторно центрифугировали при 3000 об/мин 30 мин. С целью получения безбактериального лизата последний подвергали стерилизующей фильтрации, пропуская через бактериальные мембранные фильтры «Millipore» с диаметром пор 0,22 мкм.
Полученные таким образом листериозные бактериофаги хранили в условиях холодильника.
Литическую активность листериозных бактериофагов серии УлГАУ определяли методом титрования на жидкой среде (по Аппельману) и диффузии в верхнем слое полужидкого агара (методом агаровых слоев по A. Gratia). Посев последовательных разведений бактериофагов с целью повышения точности эксперимента проводили в трех повторностях. Результаты исследований отражены в таблице 2.
Изучение специфичности листериозных бактериофагов серии УлГАУ проводили на культурах рода Listeria: L.monocytogenes, L.ivanovii, L.grayi, L.murrayi, L.innocua, L.seeligeri, L.welshimeri и культурах гетерологичных родов: Erysipelothrix spp, Jonesia spp, Staphylococcus spp, Rhodococcus spp, Enterobacter spp, Pseudomona spp, Proteus spp (табл. 3).
Экспериментально установлено, что на чашках Петри, засеянных культурами гетерологичных
Таблица 1
фагов Listeria
№ фага Колонии фага Индикаторная культура
L.m 1 УлГАУ Мелкие колонии, диаметром до 0,1 прозрачные, без зоны неполного лизиса L.m 9-127
L.m 2 УлГАУ Колонии диаметром 0,3-0,4, округлые, прозрачные, без зоны неполного лизиса L.m 9-72
L.m 4 УлГАУ Колонии диаметром 0,5-0,7, округлые, прозрачные, без зоны неполного лизиса L.m 56
L.m 6 УлГАУ Колонии диаметром 0,2-0,3, округлые с прозрачным центром и узкой зоной неполного лизиса L.m 139
L.m 12 УлГАУ Колонии диаметром 0,2-0,3, округлые, прозрачные, без зоны неполного лизиса L.m 9-72
Рис. 1. - Формирование негативных колоний бактериофагом L.m 6 УлГАУ на индикаторной культуре время термостатирования 18 часов при температуре 28±1 0С
родов зон лизиса, при нанесении выделенных и селекционированных нами фагов серии УлГАУ при визуальном осмотре выявлено не было. Однако бактериофаг L.m 4 кроме культур L.monocytogenes, лизировал культуры других гемолетически активных видов листерий L.ivanovii и L.seeligeri.
Опираясь на морфологию негативных колоний и способность полученных бактериофагов к лизису листериозных культур, 4 бактериофага мы отнесли к С-мутантам умеренных фагов. У фага L.m 4 УлГАУ отмечена литическая активность в отношении штамма-продуцента, на основании чего мы отнесли его к V-мутантам умеренных фагов.
Спектр литического действия бактериофагов устанавливался на 53 культурах бактерий рода Listeria.
Культуры для исследований готовили стандартным образом, исследования проводили методом «стекающая капля» по Отто. Бактериофаги для эксперимента культивировались на соответствующих индикаторных культурах.
Полученные данные свидетельствуют о том, что диапазон литического действия выделенных и селекционированных листериозных бактериофагов серии УлГАУ находится в пределах от 37,5 % до 86,8% (табл. 3).
Нами была изучена устойчивость выделенных бактериофагов к воздействию температуры в диапазоне 50-90 0С с интервалом в 3 0С. Нагревание фага проводили на водяной бане в течение 30 минут. Установлено, что температура выше 58
s а
Н
в ii £SES l8
ш во US Ii
Рис. 2. - Формирование негативных колоний бактериофагом Ь.т 4 УлГАУ на индикаторной культуре время термостатирования 18 часов при температуре 28±1 0С
0С резко снижает литическую активность фагов в среднем на 2-3 порядка. Температурный диапазон 63-67 0С не снизил титр фага, который был зафиксирован при 63 0С. При температуре выше 70 0С бактериофаг перестал существовать как морфологическая единица.
Эмпирическим путем установлено, что титр исследуемых бактериофагов снижался в пределах одного порядка при 45 - минутном взаимодействии с трихлорметаном в соотношении 10:1.
Для изучения изменения литической активности листериозных бактериофагов в процессе хранения брали закрытые в стерильные флаконы без добавления консерванта монофаги, которые хранились в условиях бытового холодильника (2-4 0С).
Опытным путем нами установлено, что в течение 6 месяцев показатели литической активности исследуемых бактериофагов снижались в пределах одного порядка. Последующие исследования свидетельствуют об относительно высокой скорости снижения показателя литической активности в пределах 12 месяцев, пока велся мониторинг данного показателя. К окончанию анализируемого периода - 12 месяцев с момента укупорива-ния - нами было зафиксировано снижение титра фагов на 2-3 порядка. Последующее 5-6 кратное пассирование бактериофагов на индикаторных культурах позволяло восстановить их исходный титр, который был установлен при укупоривании в стерильные флаконы.
При хранении бактериофагов в лиофильно высушенном состоянии титр фага снижался в пре-
Таблица 2
Литическая активность листериозных бактериофагов серии УлГАУ
№ Название изучаемого биологического свойства бактериофага Результат изучения характерных биологических свойств сибиреязвенного бактериофага на бактериальной культуре
L.m 1 УлГАУ L.m 2 УлГАУ L.m 4 УлГАУ L.m 6 УлГАУ L.m 12 УлГАУ
1 Литическая активность, БОЕ (бляшкообразующих единиц) / мл (по методу агаровых слоев по Грациа) 1,2±0,1x107 1,8±0,1x109 2,9±0,1x1010 2,1±0,1x108 4,2±0,1x107
2 Литическая активность (по методу Аппельмана) Ю-6 10-8 10-9 10-7 10-6
3 Спектр литического действия на культуре (по Отто) + +++ +++ ++ ++
Таблица 3
Изучение диапазона литической активности и специфичности листериозных бактериофагов серии УлГАУ
Род (вид) бактерии Количество исследуемых штаммов Бактериофаг
L.m 1 УлГАУ L.m 2 УлГАУ L.m 4 УлГАУ L.m 6 УлГАУ L.m 12 УлГАУ
Процент лизируемых культур
Listeria spp 53 37,5 62,5 86,8 67,8 43,7
Erysipelothrix insidiosa 1 - - - - -
Jonesia dentrificans 2 - - - - -
Staphylococcus aureus 4 - - - -
Rhodococcus equi 1 - - - - -
Enterobacter cloacae 1 - - - - -
Pseudomonas aureginosa 2 - - - - -
Proteus vulgaris 3 - - - - -
делах одного порядка, даже при хранении в течение 12 месяцев.
Выводы
Нами были изучены основные биологические свойства 5 бактериофагов активных по отношению к бактериям рода Listeria spp. -: L.m 1 УлГАУ, L.m 2 УлГАУ, L.m 4 УлГАУ, L.m 6 УлГАУ, L.m 12 УлГАУ.
Литическая активность фагов составила от 1,2±0,1х107 до 2,9±0,1х1010 по Грациа и от 10-6 до10-9 по методу Аппельмана.
Установлено отсутствие активности изучаемых бактериофагов по отношению к бактериям гетерологичных родов, однако, бактериофаг L.m 4 УлГАУ кроме культур L.monocytogenes, лизировал культуры других гемолетически активных видов листерий L.ivanovii и Lseeligeri.
Диапазон литического действия фагов находится в пределах 37,5 % до 86,8%.
Бактериофаги умеренно устойчивы к воздействию температуры и устойчивы к 45 - минутному воздействию хлороформа.
При хранении в течение 6 месяцев литическая активность исследуемых бактериофагов снижалась в пределах одного порядка. При хранении
бактериофагов в лиофильно высушенном состоянии титр фага снижался в пределах одного порядка, даже при хранении в течение 12 месяцев.
Таким образом, опираясь на полученные данные по совокупности изученных биологических свойств, мы для дальнейших исследований отобрали бактериофаг L.m 4 серии УлГАУ, обладающий всеми свойствами, необходимыми для использования его в составе биопрепарата для деконтами-нации пищевого сырья и продуктов питания.
Библиографический список
1. Radoshevich, L.; Cossart, P. Listeria monocytogenes: Towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 2018, 16, 32-46.
2. Directorate-General for Health and Consumers. Assessment of the Antibiotic Resistance Effects of Biocides, 28th Plenary; Commission Européenne, Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks: Bruxelles, Belgium, 2009.
3. Pearce, H.; Messager, S.; Maillard, J.-Y. Effect of biocides commonly used in the hospital environment on the transfer of antibiotic-resistance genes in
Staphylococcus aureus. J. Hosp. Infect. 1999, 43, 101108. [CrossRef] [PubMed]
4. Buttimer, C.; McAuliffe, O.; Ross, R.P.; Hill, C.; O'Mahony, J.; Coffey, A. Bacteriophages and bacterial plant diseases. Front. Microbiol. 2017, 8, 34.
5. Stalin, N.; Srinivasan, P. Efficacy of potential phage cocktails against Vibrio harveyi and closely related Vibrio species isolated from shrimp aquaculture environment in the south east coast of India. Vet. Microbiol. 2017, 207, 83-96.
6. Bai, J.; Kim, Y.-T.; Ryu, S.; Lee, J.-H. Biocon-trol and rapid detection of food-borne pathogens using bacteriophages and endolysins. Front. Microbiol. 2016, 7, 474.
7. Abedon, S.T. Phage therapy of pulmonary infections. Bacteriophage 2015, 5, e1020260.
8. Hagens, S.; Loessner, M.J. Phages of Listeria offer novel tools for diagnostics and biocontrol. Front. Microbiol. 2014, 5, 159.
9. Lin, D.M.; Koskella, B.; Lin, H.C. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-
drug resistance. World J. Gastrointest. Pharmacol. Ther. 2017, 8, 162-173.
10. Алешкин, А.В. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств деконтаминации в области питания / А.В. Алешкин, М.В. Зейгарник // Вопросы диетологии. -2012. - Т.2, № 4. - С. 24 - 34.
11. Васильев, Д.А. Выделение бактериофагов бактерий рода Listeria / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. -2014. - сентябрь, специальный выпуск - С. 69-70.
12. Выделение листериозных бактериофагов и изучение их основных биологических свойств / Е.В. Сульдина, Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, Б.И. Шморгун // Аграрный научный журнал. -2015.- № 3.- С. 37-41.
13. Выделение бактериофагов Listeria monocytogenes методом индукции/Е.Н. Ковалева, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Е.В. Сульдина, М.А. Имамов, И.Г. Швиденко//Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. -2013. -№ 1. -С. 76-80.
BACTERIOPHAGES OF LISTERIA SPP. BACTERIA AND THEIR BIOLOGICAL PROPERTIES Suldina E. V.1, Vasiliev D.A.1, Obukhov I.L.2 1FSBEI HE Ulyanovsk SAU
2 All-Russian Scientific Research Institute of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology - a branch of the Federal State Budget Scientific Institution "Federal Scientific Center - All-Russian Scientific Research Institute of Experimental Veterinary Medicine named after K.I. Scriabin and Ya. R. Kovalenko, Russian Academy of Sciences " 1432017 Ulyanovsk, Novyy Venets Boulevard, 1; 89374545651, e-mail: e.suldina2006@yandex.ru 2123022, Moscow, Zvenigorodskoe rd., 5.
Key words: Listeria, Listeria monocytogenes listeria, listeriosis, food pathogens, phage, bacteriophages, bacteria, biological properties.
The article presents results of studies on biological properties of 5 isolates of bacteriophages of Listeria genus bacteria and selection of the most promising phage strain for constructing a biological preparation for decontamination of fish, raw meat and food products. It was established that all 5 strains of the studied listeriosis bacteriophages L.m 1 ULSAU, L.m 2 ULSAU, L.m 4 ULSAU, L.m 6 ULSAU, L.m 12 ULSAU have different morphology of negative colonies. The lytic activity of the studied phages is in the range from 1.2 ± 0.1 x 107 to 2.9 ± 0.1 x lC" by Gracia and from 10 to 109 according to Appelman method. No activity of the studied bacteriophages to bacteria of heterologous genera is established, however, the L.m 4 UlSAU bacteriophage, except the cultures of L.monocytogenes, lysed cultures of other hemolyticly active species of L.ivanovii and L. seeligeri listeria. The range of the phage lytic activity ranges from 37.5% to 86.8%. Bacteriophages are moderately resistant to temperature and resistant to 45 minutes of chloroform exposure. During storage for 6 months, the lytic activity of the bacteriophages was reduced in one range. During storage of bacteriophages in the freeze-dried state, the phage titer decreased in the same range, even if stored for 12 months. Thus, on the basis of the data obtained, we selected the bacteriophage L.m 4 of ULSAU series for further research, it has the properties which allow it to be used in a biopreparation for decontamination offish, raw meat and food products.
Bibliography
1. Radoshevich, L. Listeria monocytogenes: Towards a complete picture of its physiology and pathogenesis / L Radoshevich, P. Cossart // Nat. Rev. Microbiol. - 2018. - No. 16. - P. 32-46.
2. Directorate-General for Health and Consumers. Assessment of the Antibiotic Resistance Effects of Biocides, 28th Plenary; Commission Européenne, Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks: Bruxelles, Belgium, 2009.
3. Pearce, H. Effect of biocides, commonly used in the hospital environment on the transfer of antibiotic-resistance genes in Staphylococcus aureus / H. Pearce, S. Messager, J.-Y. Maillard //J. Hosp. Infect. -1999. - No. 43. - P. 101-108. [CrossRef] [PubMed]
4. Bacteriophages and bacterial plant diseases / C.Buttimer, O. McAuliffe, R. P. Ross, C. Hill, J. O'Mahony, A. Coffey// Front. Microbiol. - 2017. - No. 8. - P. 34.
5. Stalin, N. Efficacy of potential phage cocktails against Vibrio harveyi and closely related Vibrio species isolated from shrimp aquaculture environment in the south east coast of India / N. Stalin, P. Srinivasan // Vet. Microbiol. - 2017. - No. 207. - P. 83-96.
6. Biocontrol and rapid detection of food-borne pathogens using bacteriophages and endolysins / J. Bai, Y.-T. Kim, S. Ryu, J.-H. Lee // Front. Microbiol. -2016. - No. 7. - P. 474.
7. Abedon, S.T. Phage therapy of pulmonary infections / S.T. Abedon // Bacteriophage. - 2015. - No. 5. - e1020260.
8. Hagens, S. Phages of Listeria offer novel tools for diagnostics and biocontrol / S. Hagens, M.J. Loessner // Front. Microbiol. - 2014. - No. 5. - P. 159.
9. Lin, D.M. Phage therapy: An alternative to antibiotics in the age of multi-drug resistance / D.M. Lin, B. Koskella, H.C. Lin // World J. Gastrointest. Pharmacol. Ther. - 2017. - No. 8. - P. 162-173.
10. Aleshkin, A.V. Possibilities of using bacteriophages as probiotic means of decontamination in the field of nutrition / A.V. Aleshkin, M.V. Zeigarnik // Issues of dietology. - 2012. - Volume 2, №4. - P.24 - 34.
11. Vasiliev, D.A. Isolation of bacteriophages of Listeria genus bacteria / D.A. Vasiliev, E.N. Kovaleva, E.V. Suldina // Infection and immunity. - 2014. -September, special issue. - P. 69-70.
12. Isolation of listeriosis bacteriophages and study of their basic biological properties / E.V. Suldina, E.N. Kovaleva, D.A. Vasiliev, B.I. Shmorgun //Agrarian Scientific Journal. - 2015. - No. 3. - P. 37-41.
13. Isolation of Listeria monocytogenes bacteriophages by induction method / E.N. Kovaleva, D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin, E.V. Suldina, M.A. Imamov, I.G. Shvidenko // Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2013. - No. 1. - P. 76-80.
