CC BY
90
УДК 602.3:579.6
DOI 10.18286/1816-45-2017-4-94-97
бактериофаги бактерий Enterobacter и их основные биологические характеристики
сульдина Екатерина владимировна, ассистент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
васильев дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Золотухин сергей николаевич, доктор биологических наук, профессор кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Богданов ильгизар исмаилович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017. г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 89374545651; e-mail: [email protected]
ключевые слова: Enterobacter, бактериофаги, объекты окружающей среды, бактерии, энтеробактер, биологические свойства.
В статье представлены результаты исследований по изучению биологических свойств 7 новых изо-лятов бактериофагов бактерий рода Enterobacter и отбору наиболее перспективных штаммов фагов для конструирования на их основе биопрепарата для деконтаминации пищевого сырья и продуктов питания. Установлено, что морфология негативных колоний энтеробакторных фагов представлена двумя типами: округлые, прозрачные, без зоны неполного лизиса, диаметром до 1 мм, формируемые фагами Е1, Е3, Е6. И круглые, прозрачные, без зоны неполного лизиса, до 3-4 мм в диаметре, образуемые фагами Е2, Е4, Е5, Е7. Литическая активность исследуемых бактериофагов варьировала от 1,2±0,2 х 107 до 1,8±0,2 х 1010 корпускул в 1 мл по Грациа и от 10-7 до 10-10 по Аппельману. Наибольшим диапазоном лизиса изучаемых культур обладали бактериофаги Е4 и Е7, суммарный спектр которых составлял более 95 %. Проверка специфичности действия выделенных бактериофагов осуществлялась на 90 штаммах бактерий родов Klebsiella, Citrobacter, Escherihia, Proteus, Yersinia, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Rhodococcus, Listeria и показала, что фаги являются специфичными по отношению к бактериям рода Enterobacter. Изучаемые фаги обладали выраженной устойчивостью к температурному воздействию до 65 оС и трихлорметану в течение 40 минут. Полученные результаты позволяют отобрать для дальнейшей работы бактериофаги Е4 и Е7, обладающие всеми свойствами, необходимыми для использования их в составе биопрепарата для деконтаминации пищевого сырья и продуктов питания.
Исследования проводятся в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ, выполняемых по заданию МСХ РФ в 2017 году.
введение
Как отмечает Продовольственная сельскохозяйственная организация Объединенных Наций, одной из существенных проблем сегодняшнего дня является потеря продовольственного сырья в виде мясной и рыбной продукции из-за его порчи в процессе транспортировки [1].
Несмотря на то что порча продукции животного происхождения - это сложный биохимический процесс, она в первую очередь зависит от количества и видов микроорганизмов, контаминирующих продукцию [2].
Многочисленные данные ученых по изучению основных контаминантов пищевой продукции свидетельствуют о том, что третье место по распространенности бактерий семейства Enterobacteriaceae, сразу после Escherichia и Klebsiella, занимают бактерии рода Enterobacter [3].
Бактерии данного рода довольно часто встречаются в естественных водоемах, сточных водах, в пищеварительном тракте животных и человека, на растениях [4, 5, 6], что обусловливает высокую степень загрязнения ими пищевого сырья и продуктов питания.
Следует отметить, что использование в пищевой промышленности средств повышения сохранности продукции, в частности химиотерапевтических препаратов, приводит к развитию у патогенов устойчивости. Кроме того, данные препараты могут накапливаться в сырье и продуктах питания.
Решить эту проблему от части позволит разработка и применение бактериофаговых биопрепаратов в качестве безопасного средства для деконтаминации пищевого сырья и продуктов питания [7, 8].
Проблеме выделения и изучения бактериофагов посвящено большое число работ, однако бактериофаги бактерий рода Enterobacter изучены недостаточно.
В связи с этим целью нашей работы было изучение биологических свойств новых изолятов бактериофагов бактерий рода Enterobacter и отбор перспективных штаммов фагов для конструирования биопрепарата для деконтаминации пищевого сырья и продуктов питания.
Задачи исследования:
1. Изучить морфологию негативных колоний бактериофагов бактерий рода Enterobacter.
2. Определить литическую активность энтеро-
Рис. 1 - Негативные колонии фага Е-3 Рис. 2 - Негативные колонии фага Е-4
Рис. 3 - Изучение спектра лити-ческой активности энтеробактер-ных бактериофагов
бактерных фагов.
3. Изучить спектр литической активности фагов бактерий рода Enterobacter.
4. Определить специфичность фагов Enterobacter.
5. Изучить устойчивость энтеробактерных бактериофагов к воздействию температуры и хлороформа.
6. Отобрать штаммы фага с высокой литической активностью, выраженной специфичностью и широким спектром действия.
Объекты и методы исследований
Бактериофаги, специфичные к бактериям рода Enterobacter - 7 изолятов: Е1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7, выделенные и селекционированные авторами в 2016-2017 годах. В работе использованы: 21 штамм бактерий рода Enterobacter (E.dissolvens -10, E.cloacae -11), 90 штаммов гетерологичных родов Klebsiella, Citrobacter, Escherihia, Proteus, Yersinia, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Rhodococcus, Listeria, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновского ГАУ и выделенные нами из объектов окружающей среды и санитарного надзора. Культуры бактерий обладали типичными для данных видов культуральными, морфологическими и биохимическими свойствами.
В работе использовали питательные среды: мясопептонный бульон (TM Media, Rajasthan, India); мясопептонный агар (TM Media, Rajasthan, India) 0,3%-ный, 0,7%-ный; 1,5%-ный.
Работа с бактериофагами проводилась по методикам, ранее апробированным сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновского ГАУ [9, 10].
Морфологию негативных колоний и литиче-скую активность фагов бактерий рода Enterobacter определяли методом агаровых слоев по A. Gratia.
Литическую активность фагов в жидкой питательной среде определяли методом серийных разведений по Аппельману.
Диапазон литической активности и специфичность селекционированных фагов изучали методом нанесения фага на газон гомологичных или гетерологичных бактериальных культур по Отто.
Результаты исследований
Для определения морфологии негативной ко-
лонии мы высевали фаг в разведении 10-7 - 10-9 по Аппельману на чашки методом агаровых слоев. Для формирования газона на поверхности агара использовали индикаторный штамм Enterobacter, на который фаг был выделен. Посевы культивировали в термостате при температуре 37 0С. Изучение морфологии негативных колоний проводили через 18-24 часа (рис. 1-2).
Негативные колонии, образуемые бактериофагами, по наличию зоны неполного лизиса, вторичного роста и величине колоний мы разделили на два типа. К первому относятся негативные колонии - округлые, прозрачные, без зоны неполного лизиса, диаметром до 1 мм. Негативные колонии первого типа формируют фаги Е1, Е3, Е6. Колонии второго типа круглые, прозрачные, без зоны неполного лизиса, имеют диаметр до 3-4 мм. Колонии второго типа образуются фагами Е2, Е4, Е5, Е7.
Литическую активность бактериофага оценивают по его способности вызывать лизис бактериальной культуры и выражают это тем максимальным разведением, в котором испытуемый фаг проявил свое литическое действие. Более точным методом оценки активности бактериофага является определение количества активных корпускул фага в единице объема. Результаты исследования литической активности выделенных фагов представлены в таблице 1. Литиче-ская активность исследуемых бактериофагов варьировала от 1,2±0,2 х 107 до 1,8±0,2 х 1010 корпускул в 1 мл по Грациа и от 10-7 до 10-10 по Аппельману.
К основным биологическим свойствам бакте-
Таблица 1
Литическая активность бактериофагов бактерий рода Enterobacter
Фаг Индикаторная культура Активность по Аппельману Активность по Грациа, корпускул в 1 мл
Е1 E.cloacae 1 10-8 7,4±0,2 х 108
Е2 E. dissolvens 3 10-6 1,2±0,2 х 107
Е3 E. dissolvens 3 10-7 1,6±0,2 х 108
Е4 E. dissolvens 1 10-9 3±0,2 х 109
Е5 E. dissolvens 3 10-7 3 ±0,2 х 108
Е6 E. dissolvens 3 10-9 2,8 ±0,2 х 109
Е7 E.cloacae 1 10-10 1,8 ±0,2 х 1010
таблица 2
результаты исследования спектра лити-ческой активности выделенных бактериофагов
Фаг Испытанные штаммы Enterobacter Чувствительные к фагу % лизируемых штаммов
Е1 21 8 38
Е2 21 11 52
Е3 21 4 19
Е4 21 16 76
Е5 21 13 62
Е6 21 12 57
Е7 21 17 81
таблица 3 специфичность бактериофагов Е4 и Е7
Род Количество исследуемых штаммов Фаг Е4 Фаг Е7 Контроль (МПБ)
Klebsiella 2 - - -
Citrobacter 6 - - -
Escherihia 12 - - -
Proteus 6 - - -
Yersinia 34 - - -
Salmonella 2 - - -
Listeria 19 - - -
Pseudomonas 4 - - -
Rhodococcus 1 - - -
Staphylococcus 4 - - -
Enterobacter 21 + + -
Примечание: «+» - лизис культуры; «-» - от-
сутствие лизиса.
риофага, имеющим важное практическое и теоретическое значение, относится диапазон литической активности - это спектр лизиса гомологичных фагу бактерий. Определение спектра литической активности проводили методом нанесения капель бактериофага на газон изучаемой культуры по методу Отто.
Для этого на поверхность МПА в чашках Петри наносили 0,5 мл 18-20-часовой культуры. Бактериальную культуру раскатывали равномерно по поверхности среды для получения газона. Для подсушивания ставили в термостат на 20 минут. На дне чашек карандашом отмечали одинаковые сектора (по 2 сектора на каждой чашке). На поверхность подсушенной среды наносили капли исследуемых бактериофагов и наклоняли чашки, чтобы капли стекли. Каждый сектор используется для одного фага. В качестве контроля наносили каплю стерильного МПБ. Результаты представлены в таблице 2 и на рисунке 6.
Исследования показали, что изучаемые фаги характеризуются различным спектром литической активности, а также перекрестным лизисом. Бактериофаги Е1 и Е3 являются видоспецифичными. Наибольшим диапазоном лизиса изучаемых культур обладают бактериофаги Е4 и Е7, который составляет более 75 %. А суммарный лизис двух этих бактерио-
фагов составляет более 95 %.
По сочетанию показателей проведенных тестов нами для дальнейших исследований отобрано 2 бактериофага - Е4 и Е7. В сумме они оказывают лити-ческое действие на более 95 % имеющихся у нас культур и обладают высокой литической активностью.
Необходимым условием применения фагов для деконтаминации пищевого сырья и готовых к употреблению продуктов является отсутствие литическо-го действия в отношении гетерологичных бактерий (специфичность). В качестве гетерологичных культур использовали бактерии родов Klebsiella, Citrobacter, Escherihia, Proteus, Yersinia, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Rhodococcus, Listeria, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновского ГАУ.
Проверка специфичности действия выделенных бактериофагов осуществлялась нами на 90 штаммах гетерологичных культур и показала, что бактериофаги Е4 и Е7 являются специфичными по отношению к бактериям рода Enterobacter и не активны к представителям других родов и семейств бактерий.
При изучении температурной устойчивости бактериофагов Е4 и Е7 установили, что прогревание фагов при температуре 63-65 оС не оказало влияния на их активность, при более высокой температуре фаги теряют свою физиологическую активность и погибают при 83-85 оС.
Для изучения устойчивости бактериофагов Е4 и Е7 к хлороформу фаголизат обрабатывали трих-лорметаном в соотношении 1:10 при постоянном помешивании в течение 10-40 минут. После чего определяли активность фаголизата исследуемых бактериофагов методом агаровых слоев. Установили, что устойчивость к хлороформу бактериофагов Е4 и Е7 выражена и в течение 40 минут составляет 100 %.
выводы
Нами были изучены основные биологические свойства энтеробактерных бактериофагов Е1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7, выделенных и селекционированных авторами в 2016-2017 годах.
Морфология бляшкообразующих единиц бактериофагов представлена двумя типами: округлые, прозрачные, без зоны неполного лизиса, диаметром до 1 мм, формируемые фагами Е1, Е3, Е6. И круглые, прозрачные, без зоны неполного лизиса, до 3-4 мм в диаметре, образуемые фагами Е2, Е4, Е5, Е7.
Литическая активность исследуемых бактериофагов варьировала от 1,2±0,2 х 107 до 1,8±0,2 х 1010 корпускул в 1 мл по Грациа и от 10-7 до 10-10 по Аппельману.
Установлено, что изучаемые фаги характеризовались различными диапазонами литического действия, а также перекрестным лизисом. Бактериофаги Е1 и Е3 оказались видоспецифичными. Наибольшим диапазоном лизиса изучаемых культур обладали бактериофаги Е4 и Е7, который составлял 75 %. А суммарный лизис двух этих бактериофагов составлял более 95 %.
Проверка специфичности действия выделен-
ных бактериофагов Е4 и Е7 осуществлялась нами на 90 штаммах бактерий родов Klebsiella, Citrobacter, Escherihia, Proteus, Yersinia, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Rhodococcus, Listeria и показала, что бактериофаги Е4 и Е7 являются специфичными по отношению к бактериям рода Enterobacter и не активны к представителям других родов и семейств бактерий.
Изучаемые фаги обладали выраженной устойчивостью к температурному воздействию до 65 оС, при более высокой температуре фаги теряли свою физиологическую активность и погибали при 83-85 оС. Устойчивость к хлороформу бактериофагов Е4 и Е7 выражена и в течение 40 минут составляет 100%.
Таким образом, для дальнейшей работы нами отобраны бактериофаги Е4 и Е7, обладающие всеми свойствами, необходимыми для использования их в составе биопрепарата для деконтаминации пищевого сырья и продуктов питания.
Библиографический список
1. FAO (2014): Food balance sheets. (Available at http://faostatfaoorg/site/610 (Accessed 26 May 2014).
2. Wang, H., Qi, J., Dong, Y., Li, Y., Xu, X., Zhou, G., Characterization of attachment and biofilm formation by meat-borne Enterobacteriaceae strains associated with spoilage, LWT - Food Science and Technology, Volume 86, 2017, Pages 399-407, ISSN 0023-6438, https://doi. org/10.1016/j.lwt.2017.08.025.
3. Phenotypic characterization of ESBL- and AmpC-type beta-lactamases in Enterobacteriaceae from chicken meat and dairy products / Ozpinar, H. et al // Ankara Üniv
Vet Fak Derg, 64, 267-272, 2017.
4. Золотухин Сергей Николаевич Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов энтеробактерий: дис. ... докт. биол. наук: 03.00.07, 03.00.23 /С.Н. Золотухин. - Ульяновск, 2007. - 341с.
5. Золотухин, С.Н. Малоизученные энтеробак-терии и их роль в патологии животных / С.Н. Золотухин. - Ульяновск: Копиринг, 2004. - С.67-77.
6. Бактериофаги микроорганизмов значимых для животных, растений и человека. Научное издание / Д.А. Васильев [и др.]; под. ред. Васильева Д.А., Золотухина С.Н. - Ульяновск, НИИЦМиБ, 2013. - 316 с.
7. Каттер, Э. Бактериофаги: биология и практическое применение / под общ. ред. Э. Каттер, А. Сулак-велидзе (пер. с англ. коллектив переводчиков; науч. ред. А.В. Летаров). - М., Научный мир, 2012. - 640 с.
8. Алешкин, А.В. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств деконтаминации в области питания/ А.В. Алешкин, М.В. Зейгар-ник // Вопросы диетологии. - 2012. - Т.2, №4. - С.24 - 34
9. Выделение бактериофагов бактерий рода Listeria / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. - 2014. - сентябрь, специальный выпуск - С. 69-70.
10. Основные биологические свойства листе-риозных бактериофагов / Е.В. Сульдина, Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева // Материалы VI Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения». Часть III / Ульяновск, ГСХА им. П.А.Столыпина. - 2015. - С.125-127.
BACTERIOPHAGES OF ENTEROBACTER BACTERIA AND THEIR MAIN BIOLOGICAL CHARACTERISTICS
Suldina E.V., Vasilyev D.A., Zolotukhin S.N., Bogdanov I.I.
FSBEI HE Ulyanovsk SAU 432017. Ulyanovsk, Novyy Venets bld., 1; 89374545651; e-mail: [email protected]
Key words: Enterobacter, bacteriophages, environmental objects, bacteria, enterobacter, biological properties.
The article presents results of studies on biological properties of 7 new bacteriophage isolates of Enterobacter genus bacteria and selection of the most prospective phage strains for constructing a biopreparation for decontamination of food raw materials and food products on their basis. It is established that the morphology of negative colonies of enterobacterial phages is represented by two types: rounded, transparent, without an incomplete lysis zone, up to 1 mm in diameter, formed by phages E1, E3, E6. And round, transparent, without an incomplete lysis zone, up to 3-4 mm in diameter, formed by phages E2, E4, E5, E7. The lytic activity of the bacteriophages studied varied from 1,2±0,2 x 107 to 1,8±0,2 x 1010 corpuscles in 1 ml by Grazia method and from 10-7 to 10-10 by Appelman. The bacterial phages E4 and E7 possessed the greatest range of lyses of the studied cultures, the total spectrum of which was more than 95%. The specificity of the isolated bacteriophage activity was tested on 90 strains of the bacteria of Klebsiella, Citrobacter, Escherichia, Proteus, Yersinia, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Rhodococcus, Listeria genera and showed that the phages are specific for bacteria of Enterobacter genus. The phages studied had a significant resistance to temperatures up to 65 ° C and trichloromethane for 40 minutes. The obtained results allow to select the bacteriophages E4 and E7 for the further work. They possess all the properties necessary for their use as a part of the biopreparation for decontamination of food raw materials and food products.
Bibliography
1. FAO (2014): Food balance sheets. (Available at http: //faostatfaoorg /site/610 (Accessed on May 26, 2014).
2. Wang, H., Qi, J., Dong, Y., Li, Y., Xu, X., Zhou, G., Characterization of attachment and biofilm formation by meat-borne Enterobacteriaceae strains associated with spoilage, LWT- Food Science and Technology, Volume 86,2017, Pages 399-407, ISSN 0023-6438, https://doi.org/10.1016/j.lwt.2017.08.025.
3. Phenotypic characterization of ESBL- and AmpC-type beta-lactamases in Enterobacteriaceae from chicken meat and dairy products / Ozpinar, H. et al., Ankara Univ Vet Fak Derg, 64,267-272, 2017.
4. Zolotukhin Sergey Nikolaevich. Development and elaboration of application schemes of diagnostic biological preparations on the basis of the isolated and studied bacteriophages of enterobacteria: dissertation of Doctor of Biology: 03.00.07, 03.00.23/S.N. Zolotukhin. - Ulyanovsk, 2007. - 341p.
5. Zolotukhin, S.N. Little studied enterobacteria and their role in the pathology of animals / S.N. Zolotukhin. - Ulyanovsk: Copyring, 2004. - P.67-77.
6. Bacteriophages of microorganisms significant for animals, plants and humans. Scientific publication / DA. Vasilyev [et alt]; edited by Vasilyev D.A., Zolotukhin S.N. - Ulyanovsk, SRICMB, 2013. - 316p.
7. Cutter, E. Bacteriophages: Biology and practical application / edited by E. Cutter, A. Sulakvelidze (translated from English, scientific editor A.V. Letarov). - M., Nauchnyi mir, 2012. - 640 p.
8. Aleshkin, A.V. Possibilities of bacteriophage application as probiotic means of decontamination in nutrition sphere / A.V. Aleshkin, M.V. Zeigarnik // Issues of dietology. - 2012. - V.2, №4. - P.24 -34
9. Isolation of bacteriophages of Listeria genus bacteria / D.A. Vasilyev, E.N. Kovaleva, E.V. Suldina // Infection and immunity. - 2014. - September, special issue - P. 69-70.
10. The main biological properties of listeriosis bacteriophages / E.V. Suldina, D.A. Vasilyev, E.N. Kovaleva // Materials of the VI International Scientific and Practical Conference "Agrarian science and education at the present stage of development: experience, problems and solutions". Part III / Ulyanovsk, SAA named after P.A. Stolypin. - 2015. - P.125-127.
n
