CC BY
205
УДК 579.6
DOI 10.18286/1816-4501-2018-1-109-115
ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИОФАГОВ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER SPP. ДЛЯ ОЦЕНКИ ВОЗМОЖНОСТЕЙ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В СОСТАВЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО БИОПРЕПАРАТА
Сульдина Екатерина Владимировна, ассистент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
Мастиленко Андрей Владимирович, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел.: 8937454565; e-mail: e.suldina2006@yandex.ru
Ключевые слова: Enterobacter, бактериофаги, секвенирование, ПЦР, энтеробактер, биологические свойства, геном.
Исследования проводятся при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект «Геномика и биология кандидатных бактериофагов для терапии энтеробактериальных инфекций в ветеринарной медицине» №16-44-732038.
В статье представлены результаты исследований по выделению и изучению биологических и генетических характеристик бактериофагов бактерий рода Enterobacter. Охарактеризованы изоляты бактериофагов, специфичных к Enterobacter spp. по основным биологическим свойствам. Дана молекулярно-генетиче-ская характеристика отобранному для дальнейших исследований энтеробактерному фагу Е4. На основании полученных сиквенсовых данных изучения генома составлена карта его линейной ДНК. Определены продукты экспрессии генов фага Е4 в соответствии с известными аналогами. Разработана система молекулярно-ге-нетической индикации автономных генетических элементов в геноме бактериофага, активного в отношении Enterobacter, с использованием ПЦР. Определена уникальность гена-кандидата, и выбран фрагмент гена toxin RelE, кодирующий локус гена инвазивного белка. Результаты экспериментальных исследований выявления специфического фрагмента гена RelE культур Enterobacter spp. с разработанными системами олигону-клеотидов в геноме энтеробактерного бактериофага Е4 подтвердили вирулентную природу отобранного бактериофага и отсутствие локусов патогенности. Полученные данные позволяют рекомендовать бактериофаг Е4, специфичный к бактериям рода Enterobacter, для конструирования терапевтического биопрепарата с целью профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.
Введение
Энтеробактер (Enterobacter) - род грамо-трицательных палочкообразных перитрихиаль-ных споронеобразующих бактерий, факультативных анаэробов.
Энтеробактеры широко распространены в природе, бактерии выделяют из воды, сточных вод, растений, пищевого сырья животного и растительного происхождения и готовых к употреблению продуктов. Кроме этого, бактерии рода Enterobacter являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных [1].
Однако представители этого рода относятся к условно-патогенным микроорганизмам и способны вызывать заболевания человека и животных при определенных условиях.
Одной из глобальных проблем современной ветеринарии и медицины является вопрос развития устойчивости бактерий к химическим дезинфектантам и химиотерапевтическим препаратам.
Многими исследователями отмечена чрезвычайная устойчивость бактерий рода Enterobacter к применяемым в практике дезин-фектантам. Их находили при контроле стерильности рук у персонала операционной [2].
Согласно литературным данным все энтеробактеры отличаются высокой устойчивостью к антибиотикам: амоксициллину, амоксициллин-клавулановой кислоте, цефалотину, мезлоцили-ну, цефатоксиму, тобрамицину, гентамицину и др. [3-4].
Изучение С.Н. Золотухиным [1] чувстви-
тельности штаммов энтеробактера, выделенных от больных диареей поросят-сосунов, к 10 антибиотикам (пенициллину, стрептомицину, гентамицину, эритромицину, левомицетину, оксациллину, линкомицину, ампициллину, по-лимексину М, тетрациклину) показало, что все культуры были чувствительны только к гентамицину.
При тестировании чувствительности к антибиотикам микроорганизмов, выделенных из продуктов животного происхождения, Ю.А. Ко-роткевич [5] с соавторами установили, что более 30 % исследуемых штаммов Enterobacter spp обладали мультирезистентностью.
Н.Р. Ефимочкина [6] с соавторами опубликовали данные об исследованиях антибио-тикочувствительности 17 штаммов бактерий, выделенных из молочных продуктов. Ученые установили, что два штамма бактерий рода Enterobacter были устойчивы ко всем тетраци-клиновым антибиотикам, ампициллину, и один из них - к хлорамфениколу.
Исследования, проведенные Шипицыной И.В. [7] с соавторами на 18 клинических штаммах бактерий E. cloacae, выделенных из свищей в дооперационном периоде и из очага воспаления во время операции у пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей, показали наличие 100 % устойчивости их к ампициллину, цефтриаксону, амоксиклаву. Среди 16 используемых антибактериальных препаратов наибольшей эффективностью в отношении штаммов E. cloacae, по мнению ученых, обладали карбопенемы - имипенем и меропенем.
A. Hernandez, R. Mellado [8] определили, что рост в присутствии ванадия приводит к фенотипу множественной лекарственной устойчивости штаммов. Имеются данные о резистентности штаммов E.aerogenes и E.cloacae к токсичности кадмия, хрома, соединениям мышьяка
[9].
Чувствительность к солевому стрессу у штаммов Enterobacter изучали R. Rai, G. Kieder
[10]. Штаммы показывали оптимальный рост при 0.5-1 % NaCl на минимально безазотной среде с глюкозой в течение 28 ч инкубации, хотя лучший рост наблюдается при 3-2 % NaCl спустя 52 и 100 ч инкубации, по сравнению с 28-часовой культурой.
B.И. Сергевнин [11] с соавторами экспериментально установили, что штамм E. cloacae, обладающий неполной чувствительностью к де-зинфектантам группы четвертично-аммониевых соединений, приобретает устойчивость к препаратам в концентрации, являющейся по отношению к эталонным штаммам микроорганизмов
бактерицидной, после 2-12-го воздействия.
При изучении толерантности энтеробакте-рий к хлорсодержащим биоцидным средствам Н.Р. Ефимочкина [12] с соавторами установили, что только концентрации 200 и 150 мг/дм3 активного хлора подавляли рост бактерий рода Enterobacter либо значительно ингибировали рост штаммов на 3,5-4,7 логарифмического порядка.
В связи с такой обширной распространённостью энтеробактеров в окружающей среде и их значительной устойчивостью к антимикробным препаратам и химическим дезинфектан-там, целью наших исследований было выделение и изучение биологических и генетических характеристик бактериофагов бактерий рода Enterobacter для оценки возможностей их использования в составе терапевтического биопрепарата.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать новые изоляты бактериофагов Enterobacter по основным биологическим свойствам.
2. Дать молекулярно-генетическую характеристику отобранному для дальнейших исследований энтеробактерному фагу.
3. Подтвердить вирулентную природу отобранного бактериофага и установить отсутствие в его геноме локусов патогенности.
Объекты и методы исследований
В работе было использовано 7 изолятов бактериофагов, специфичных к бактериям рода Enterobacter: Е1, Е2, Е3, Е4, Е5, Е6, Е7, выделенных и селекционированных авторами.
Бактерии рода Enterobacter - 21 штамм (E.dissolvens -10, E.cloacae -11).
Бактерии гетерологичных родов - 90 штаммов бактерий Klebsiella, Citrobacter, Escherihia, Proteus, Yersinia, Salmonella, Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Rhodococcus, Listeria, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновского ГАУ и выделенные нами из объектов окружающей среды и санитарного надзора. Культуры бактерий обладали типичными для данных видов культуральными, морфологическими и биохимическими свойствами.
Работа с бактериофагами проводилась по методикам, ранее апробированным сотрудниками кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ ФГБОУ ВО Ульяновского ГАУ [13-14].
Для получения полноразмерных нуклео-тидных последовательностей геномов бактериофагов использовали полногеномное секвени-рование ДНК бактериофагов второго поколения
(Ion Torrent, Thermo Fisher Scientific, США). Каждый штамм бактериофага был секвенирован троекратно. Данные каждого раунда секвениро-вания были проанализированы методами биоинформатики. Фильтрация качества прочтений (ридов) позволила собрать геномы бактериофагов с высокой достоверностью.
В исследованиях были использованы библиотеки баз данных GeneBank (США), EMBL (Европейская молекулярно-биологическая библиотека), DDBJ (Японская база данных нуклео-тидных последовательностей).
Для оптимизации протокола полимераз-ной цепной реакции использовали электрофорез.
Результаты исследований
Из более 50 проб объектов окружающей среды нами было выделено и селекционировано 7 бактериофагов бактерий Enterobacter.
Установлено, что по морфологии негативных колоний полученные фаги можно разделить на два вида. К первому относятся изо-ляты Е1, Е3, Е6 с округлыми, прозрачными, без зон неполного лизиса колониями, диаметром до 1 мм. Ко второму виду отнесли круглые, прозрачные, без зон неполного лизиса, до 3-4 мм в диаметре колонии, образуемые фагами Е2, Е4, Е5, Е7. Литическая активность исследуемых бактериофагов варьировала от 1,2±0,2 х 107 до 1,8±0,2 х 1010 корпускул в 1 мл по Грациа и от 10-7 до 10-10 по Аппельману. Наибольшим диапазоном лизиса изучаемых культур обладали бактериофаги Е4 и Е7, суммарный спектр которых составлял более 95 %. Специфичность действия выделенных бактериофагов проверялась на 90 штаммах бактерий - представителей родов Staphylococcus, Streptococcus, Rhodococcus, Listeria, Klebsiella, Citrobacter, Escherihia, Proteus, Yersinia, Salmonella, Pseudomonas. Энтеробак-терные бактериофаги специфичны по отношению к гомологичным бактериям.
Изучаемые фаги обладали выраженной устойчивостью к воздействию температуры до 65 оС и хлороформу в течение 40 минут [13].
При анализе результатов совокупности проведенных исследований бактериофаг Е4 был отобран нами для дальнейшей работы как наиболее производственно-перспективный.
Определяя латентный период внутриклеточного развития фага Е4 на клетках E. dissolvens 1, установили, что он составляет 22-23 минуты. При этом среднее количество негативных колоний на чашках при высеве из четвертой пробирки с 15-й по 21-ю минуту опыта было равно 14, а при высеве с 24-й по 60-ю минуту из пятой пробирки - 18,78. Средняя урожайность бакте-
риофага Е4 составила 1878:14=134,1 вирусных частиц на одну микробную клетку индикаторной культуры.
Молекулярно-генетическая характеристика бактериофага включает в себя определение размера фагового генома, процента его идентичности с таксономически наиболее близкими бактериофагами и проверку отсутствия в составе ДНК генов, кодирующих токсины, интегразы, репрессоры транскрипции и другие нежелательные локусы. Исследования такого рода позволят подтвердить оригинальность и вирулентную природу отобранного штамма энтеробактерно-го бактериофага Е4.
Для определения кодирующих областей генома сравнили собранный геном бактериофага Е4 с известными фаговыми ДНК, депонированными в GenBank NCBI. Результаты представлены на рисунке 1.
По результатам проведенных исследований была составлена карта линейной ДНК отобранного нами ранее энтеробактерного бактериофага Е4. Далее были определены продукты экспрессии его генов в соответствии с известными аналогами. Качественный состав протеинов фага Е4 соответствует белкам аннотированных аналогов, имеет четкие гомологии нуклеотид-ного и аминокислотного наборов. В структуре протеинов наблюдается закономерность, присущая данным вирусным частицам - наличие как структурных, так и неструктурных компонентов. Также выявлены продукты генов, не имеющие четко определенных функций (гипотетические белки), имеющие аналогии в аннотированных геномах других бактериофагов, активных в отношении бактерий рода Enterobacter. В таблице 1 представлен биоинформатический анализ соответствия известных генов с данными секвени-рования энтеробактерного фага. На основе био-информатического анализа данных сиквенса было установлено отсутствие локусов патоген-ности. Так как сама процедура секвенирования довольно финансово затратная и трудоемкая, в данной работе мы показали возможность использования метода полимеразно-цепной реакции для доказательства отсутствия локусов па-тогенности в геноме бактериофага.
Нами была разработана система молеку-лярно-генетической индикации автономных генетических элементов (островков патогенности) в геноме бактериофага, активных в отношении Enterobacter, с использованием ПЦР.
Для Enterobacter spp. в библиотеке баз данных GeneBank (США), EMBL (Европейская молекулярно-биологическая библиотека), DDBJ (Японская база данных нуклеотидных последо-
!AXI7G_gp59i
\
|AXI7B_gp26;
Рис. 1 - Карта линейной ДНК бактериофага Е4 c расшифровкой кодирующих областей генома
вательностей) была определена уникальность гена-кандидата и выбран фрагмент гена toxin RelE, кодирующий локус гена инвазивного белка.
После анализа в библиотеках баз данных нуклеотидных последовательностей гена toxin RelE они были просканированы системой Blast на предмет совпадения с последовательностями ДНК известных микроорганизмов. Установлено, что данные генетические последовательности являются уникальными для Enterobacter phage toxinRelE и не имеют совпадений с другими видами микроорганизмов.
После выбора специфичного гена для молекулярно-генетической идентификации локуса патогенности, носителем которого могут быть бактериофаги, активные в отношении Enterobacter spp., были определены наиболее консервативные участки гена-мишени путем их сравнения у различных штаммов энтеробактер-ного фага в базе данных GeneBank.
На эти консервативные участки приложением Primer BLAST были предложены прай-меры, отвечающие определенным условиям: длина праймеров от 18 до 24 пар нуклеотидов, температура плавления праймера в интервале 55-70 °С, размер фланкируемого участка от 100 до 1000 п.о.
После выбора прямого и обратного праймеров, они были выровнены с помощью программы GeneRunnerVersion 3.05. Кроме того, мы убедились, что димеры на З'-конце, образовывающиеся либо при гибридизации праймера с самим собой, либо с партнером, исключены. Также исключены праймеры с удлиняемым
Таблица 1
Биоинформатический анализ соответствия известных генов с данными секвениро-вания бактериофага Е4
iiit.Tii ЕииЬш1J .inIHWbiil
&j veil, ij LOU I
Fiiibll ЬшВД M □ t щ
i к j :: 1 „ 3!iOÜ 31013 bp □ и ¡сита
i uns gpDt та .. 1777 033 bp El C-DS
t Ш78 ait та .. 172? 933 bp G gene
! uns 01« 162! .. 343! LÎC3 bp В сне
i uns poi 1B2S .. 1431 i юз t.p □ gene
t uns «юз I«? .. 3717 321 bp г 4- CDS 1 hvpcî.eticBlarocein
t uns 4PC3 Z4fl7 .. 1717 321 bp □ Ф- gens
i uns p>M 379! . (МБ 312 bp ■ *- Cffi 1 hypMtvtfloi srotein
t uns goût 17)5 .. 4№ 332 bp □ 5ЕГ.С
> uns gpOS (Kl . 4245 191 bp 1 #- CDS hypothetical protobi
i uns 0P45 ((SI . 4245 191 bp □ gene
i uns gpOS (31! .. (503 114 bp в фг Cffi 1 h ypoThetical protein
t uns gpG6 (M! .. (Я! 114 bp □ f- gene
i uns gpOT 4414 . SDS 512 bp в 4- Cffi 1 OADC.JLCJIE
t uns gp07 4434 . 53)5 StZbp р gene
t Uns gpGl ¡31! . 5574 161 bp и Cffi inlhlliitDr ai reiSCD_.
i uns gpGl 5574 161 bp i gene
t uns Jfll 5S71 . 5710 311 bp El 4й- Cffi 1 HifibftJhç prcttin
t Uns g(M S571 .. Srts 2 Id bp □ ger-c
i Uns gpi» 577? . (CT5 за bp 01 CDS ! HVS brdinç prcnln
i uns gpll 5777 .. 303 bp D gen-e
i uns gpJt SWS .. g;ii llllbp в Пг- Cffi i МИ p&l^flierase
i uns gpJi («i . 1210 lllSbp □ 4- gene
i uns gpJ2 S27S .. SÜ2 ЗБ1 bp 1 *- Cffi ! h^pcl.ctiu1 arotem
t uns ,gpi2 SÎ7I .. ÎH; 361 bp □ 4* gen-c
> uns gpll 5":75 .. 5 717 3J1 bp в Cffi 1 hïpcïfltlcaiûroîeln
i uns gpJJ !S7i .. 3717 313 bp □ *- gen-e
i uns ggJt 0611 .. 13 430 tltlbp в Cffi
t uns gpl* JElt .. f'v 430 ts LE bp □ *- gene
i Ш78. gpJS 10 761 . 1122! (51 bp ш 4— Cffi
i uns.ggis 11717 .. 11223 (51 bp п 4" gene
i uns gpi6 11215 . 11670 467 bp в CDS cncoruccaic
i wùjiii 11215 . 11670 462 bp р gene
i uns gpi7 11 675 .. 12 374 19) bp 0 Cffi
i uns gpi? 11(75 . 12 374 £9) bp □ gene
i uns gpn 11477 . 1)613 337 bp в f- Cffi
t uns gpll 11427 . 11613 337 bp □ 4- gene
i Uns gpil 11 «CD .. 117)7 111 bp 1 CDS h ypcücctal prateln
t Uns gpJJ 12 MO . 127)7 111 bp □ gene
t uns gpll 12 714 . 13 213 461 bp в 4- Cffi 1 h vpeihetical protein
i uns gp2D 12 784 .. 11213 463 bp □ 4- gene
t uns gp:i 13 2i) .. iis;o 133 bp в Фг Cffi ! hvpctftcni'praKin
t uns. gpll 11263 . 13170 313 bp □ *- gene
i uns gpll Util .. H 735 1017 bp в 4- Cffi 1 DMAUjase
/ uns gplî UHU . 14 731 ¡OI7bp □ 4- gene
i uns gp23 H 703 .. 15115 (17 bp 0 Cffi ! h^pci.fltm1 srotem
t uns.gp23 14 703 .. 15 US 417 bp □ фг gen-e
J uns gp24 15 115 .. 15 471 371 bp в *- Cffi
i uns gp24 15 145 .. 15 421 371 bp я gen-c
t uns.gp2! 15411 .. 15 ill 141 bp в 4- Cffi 1 h ypcfrretical protein
J uns gp2S 15471 .. 15 Ml 141 bp D gene
i uns gp2i 15 654 .. 15 525 373 bp а *- Cffi ! h^pci.fltm1 srotem
i uns gp2S 15 654 .. 15 925 371 bp □ gene
1..................... Yltpfr. fil i/.vtf (ГЗ i'jyc
3'-концом, а самый стойкий общий димер нестабилен.
Данные по подобранным праймерам представлены на рисунке 2 и в таблице 2.
Результаты экспериментальных исследований выявления специфического фрагмента гена RelE культур Enterobacter spp. с разработанными системами олигонуклеотидов представлены на рисунке 3.
Рис. 2 - Варианты праймерных систем для амплификации гена toxin RelE генома фагов, активных в отношении Enterobacter spp.
Таблица 2
Характеристика праймеров к участкам гена toxin RelE генома фагов, активных в отношении Enterobacter spp.
Параметр Характеристика
участок гена toxin RelE
Прямой праймер (А 5'-3' TCATTCGTTCGCTTGCCAGA
Обратный праймер (г) 5'-3' GCAAAGCTGCGTGGGATAAA
Расчетная температура плавления прямого праймера 59.0 °С
Расчетная температура плавления обратного праймера 59.0 °С
Теоретическая специфичность Enterobacter sp. plasmid pENTE01 toxin RelE gene
Длина амплифицируемого участка (п.о.) 160
Таким образом, в геноме выделенного и селекционированного нами фага Е4 локусов па-тогенности выявлено не было.
Выводы
В результате проведенных исследований нами были охарактеризованы новые изоляты бактериофагов, специфичных к Enterobacter spp. по основным биологическим свойствам. Дана молекулярно-генетическая характеристика отобранному для дальнейших исследований энте-робактерному фагу Е4. На основании полученных сиквенсовых данных его генома составлена карта его линейной ДНК. Определены продукты экспрессии генов фага Е4 в соответствии с известными аналогами. Качественный состав протеинов изучаемого фага соответствовал белкам аннотированных аналогов, имел четкие гомологии нуклеотидного и аминокислотного наборов. В структуре протеинов наблюдалось наличие как структурных, так и неструктурных компонентов. Были выявлены продукты генов, не имеющие четко определенных функций (гипотетические белки), имеющие аналогии в аннотированных
1 2 М 3
500
100
Рис. 3 - Индикация фрагмента гена RelE:
М - маркер молекулярного веса, 1 - положительный контроль, 2 - отрицательный контроль, 3-4 - ДНК бактериофагов Е4 и Е7, специфичных в отношении Enterobacter spp.
геномах других энтеробактерных бактериофагов. Была разработана система молекулярно-генетической индикации автономных генетических элементов (островков патогенности) в геноме бактериофага, активных в отношении Enterobacter, с использованием ПЦР.
Определена уникальность гена-кандидата, и выбран фрагмент гена toxin RelE, кодирующий локус гена инвазивного белка. Характеристика праймеров к участкам гена toxin RelE генома фага, активного в отношении Enterobacter spp: прямой праймер - TCATTCGTTCGCTTGCCAGA; обратный праймер - GCAAAGCTGCGTGGGATAAA; расчетная температура плавления прямого и обратного праймеров - 59,9 °С; теоретическая специфичность - Enterobacter sp. plasmid pENTE01 toxin RelE gene; длина амплифицируемого участка - 160 п.о. По результатам экспериментальных исследований выявления специфического фрагмента гена RelE культур Enterobacter spp. с разработанными системами олигонуклеотидов в геноме энтеробактерного бактериофага Е4 ло-кусов патогенности выявлено не было.
Полученные данные позволяют рекомендовать бактериофаг Е4, специфичный к бактериям рода Enterobacter, для конструирования терапевтического биопрепарата с целью профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных и птицы.
Библиографический список
1. Золотухин, С.Н. Малоизученные энтеро-бактерии и их роль в патологии животных / С.Н. Золотухин. - Ульяновск: Копиринг, 2004. - 130 с.
2. Красноголовец, В.Н. Клебсиеллезные инфекции / В.Н. Красноголовец, Б.С. Киселева. - М.: Медицина, 1996. - 256 с.
3. Морозова, О.Т. Биовары и антибиотикоре-зистентность штаммов E.cloacae, выделенных у колонизированных новорожденных / О.Т. Морозова, Н.С. Прямухина // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1997. - № 3. - С. 18 - 21.
4. Capdevila, J.A. Enterobacter Un patogeno humano inusual / J.A.Capdevila, V.Bisbe, I.Gasser // Enform. Infec. Microbial. Clin. - 1998. - № 8. - P. 321 -329.
5. Короткевич, Ю.В. Антибиотикорезистент-ность микроорганизмов, загрязняющих пищевые продукты / Ю.В. Короткевич, Н.Р. Ефимочкина, С.А. Шевелева // Современные технологии продуктов питания. Материалы 2-й международной научно-практической конференции. - Курск, 2015. - С. 78 -81.
6. Свойства энтеробактерий, выделенных из
молочных продуктов / Н.Р. Ефимочкина, Н.В. Ростова, Ю.М. Маркова, [и др.] // Молочная промышленность. - 2015. - № 11. - С. 33 - 36.
7. Шипицына, И.В. Адгезивная способность клинических штаммов Enterobacter cloacae, выделенных из ран пациентов с хроническим остеомиелитом, и их чувствительность к антимикробным препаратам / И.В. Шипицына, Е.В. Осипова, Л.В. Розова // Новости хирургии. - 2017. - Том 25, № 3. - С. 273 - 278.
8. Hernandez, A. Metal accumulation and vanadium - induced mulcting resistance by environmental isolates of Escherichia hermannii and Enterobacter cloacae / A. Hernandez, R. Mellado // Appl and Environ Microbiol. - 1998. - № 1. - P. 46 - 47.
9. Пименов, Е.В. Выделение и характеристика штаммов бактерий, резистентных к соединениям мышьяка / Е.В. Пименов, И.В. Дармов, И.П. Погорельский // Микробиология. - 1996. - № 2. - С. 12
- 13.
10. Rai, R. Salt stress sensitivity of nitrogen fixation in Enterobacter strains / R. Rai, G. Kieder // J. Gen. and Appl. Microbiol. - 1998. - V. 44, № 6. - P. 365
- 370.
11. Формирование устойчивости Enterobacter cloacae и Pseudomonas aerogenosa к дезинфектан-там под воздействием бактерицидных концентраций препаратов в эксперименте продуктов / В.И. Сергевнин, Т.В. Клюкина, Э.О. Волкова, [и др.] // Медицинский альманах. - 2015. - № 5 (40). - С. 112 - 15.
12. Изучение толерантности энтеробактерий к хлорсодержащим биоцидным средствам в экспериментальных моделях с использованием хромо-генных индикаторных тест-систем / Н.Р. Ефимочкина, И.Б. Быкова, Ю.В. Короткевич, [и др.] // Анализ риска здоровью. - 2015. - № 3 (11). - С. 73 - 82.
13. Васильев, Д.А. Выделение бактериофагов бактерий рода Listeria / Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева, Е.В. Сульдина // Инфекция и иммунитет. - 2014.
- № 9. - С. 69 - 70.
14. Сульдина, Е.В. Основные биологические свойства листериозных бактериофагов / Е.В. Суль-дина, Д.А. Васильев, Е.Н. Ковалева // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения. Материалы VI Международной научно-практической конференции. Часть III. - Ульяновск, ГСХА им. П.А. Столыпина.
- 2015. - С. 125 - 127.
15. Бактериофаги бактерий Enterobacter и их основные биологические характеристики / Е.В. Сульдина, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, Богданов И.И. // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2017. - № 4 (40). - С. 94 - 98.
CHARACTERISTICS OF BACTERIOPHAGES OF ENTEROBACTER SPP BACTERIA FOR EVALUATING THE POSSIBILITY
OF THEIR USAGE AS PART OF THERAPEUTIC AGENT
Suldina E.V., Vasilyev D.A., Feoktistova N.A., Mastilenko A.V.
FSBEI HE Ulyanovsk SAU 432017, Ulyanovsk, Novyy Venets Boulevard, 1; 89374545651 e-mail: e.suldina2006@yandex.ru
Key words: Enterobacter, bacteriophages, sequencing, PCR, enterobacter, biological properties, genome.
The article presents results of studies on isolation and study of the biological and genetic characteristics of bacteriophages of Enterobacter genus bacteria. Isolates of bacteriophages specific to Enterobacter spp are characterized on the basic of the main biological properties. The molecular and genetic characteristics of entero-bacterial E4 phage selected for further studies was given. Based on the sequencing data obtained by studying the genome, a map of its linear DNA has been compiled. Expression products of E4phage genes were determined in accordance with known analogues. A system of molecular-genetic indication of autonomous genetic elements in the bacteriophage genome active against Enterobacter using PCR was developed. Uniqueness of the candidate gene was determined and the gene fragment of toxin RelE, encoding the locus of the invasive protein gene, was selected. The results of experimental studies of the detection of a specific fragment of the gene RelE of Enterobacter spp. cultures with developed systems of oligonucleotides in the genome of enterobacter E4 bacteriophage confirmed the virulent nature of the selected bacteriophage and absence of pathogenicity loci. The data obtained make it possible to recommend E4 bacteriophage, specific to bacteria of Enterobacter genus, for construction of a therapeutic biological agent for prevention and treatment of gastrointestinal diseases of young farm animals and poultry.
Bibliography
1. Zolotukhin, S.N. Little studied enterobacteria and their role in animal pathology/S.N. Zolotukhin. - Ulyanovsk: Copyring, 2004. -130 p.
2. Krasnogolovets, V.N. Klebsiella infections/ V.N. Krasnogolovets, B.S. Kiseleva. - Moscow: Medicine, 1996. - 256p.
3. Morozova, O.T. Biovars and antibiotic resistance of E.cloacae strains isolated from colonized newborns/O.T. Morozova, N.S. Pryamukhina//Epidemiology and infectious diseases. -1997. - № 3. - P. 18 - 21.
4. Capdevila, J.A. Enterobacter Un patogeno humano inusual/ J.A.Capdevila, V.Bisbe, I.Gasser//Enform. Infec. Microbial. Clin. -1998. - № 8. - P. 321 - 329.
5. Korotkevich, Yu.V. Antibiotic resistance of microorganisms which contaminate food products / Yu.V. Korotkevich, N.R. Efimochkina, S.A. Sheveleva // Modern technologies of food products. Materials of the 2 nd International Scientific and Practical Conference. - Kursk, 2015. - P. 78 - 81.
6. Properties of enterobacteria isolated from dairy products / N.R. Efimochkina, N.V. Rostova, Yu.M. Markova, [et alt.] // Dairy industry. - 2015. - № 11. - P. 33 - 36.
7. Shipitsyna, I.V. Adhesive capacity of clinical strains of Enterobacter cloacae isolated from wounds of patients with chronic osteomyelitis, and their sensitivity to antimicrobial agents / I.V. Shipitsyna, E.V. Osipova, L.V. Rozova // News of Surgery. - 2017. - Volume 25, № 3. - P. 273 - 278.
8. Hernandez, A. Metal accumulation and vanadium - induced mulcting resistance by environmental isolates of Escherichia hermannii and Enterobacter cloacae/A. Hernandez, R. Mellado //Appl and Environ Microbiol. -1998. - № 1. - P. 46 - 47.
9. Pimenov, E.V. Isolation and characteristics of bacteria strains resistant to arsenic compounds / E.V. Pimenov, I.V. Darmov, I.P. Pogorelsky // Microbiology. -1996. - № 2. - P. 12 -13.
10. Rai, R. Salt stress sensitivity of nitrogen fixation in Enterobacter strains / R. Rai, G. Kieder //J. Gen. and Appl. Microbiol. -1998. - V. 44, № 6. - P. 365 -
370.
11. Resistance formation of Enterobacter cloacae and Pseudomonas aerogenosa to disinfectants under the influence of bactericidal concentrations of preparations in the experiment of products / V.I. Sergevnin, T.V. Klyukina, E.O. Volkova, [et alt.] // Medical almanac. - 2015. - № 5 (40). - P. 112 -15.
12. Study of enterobacteria tolerance to chlorinated biocidal agents in experimental models using chromogenic indicator test systems / N.R. Efimochkina, I.B. Bykova, Yu.V. Korotkevich, [et alt.]//Health risk analysis. - 2015. - № 3 (11). - P. 73 - 82.
13. Vasilyev, D.A. Isolation of bacteriophages of Listeria genus bacteria / D.A. Vasilyev, E.N. Kovaleva, E.V. Suldina // Infection and immunity. - 2014. - № 9. - P. 69 - 70.
14. Suldina, E.V. The main biological properties of listeriosis bacteriophages / E.V. Suldina, D.A. Vasilyev, E.N. Kovaleva //Agrarian science and education at the present stage of development: experience, problems and solutions. Materials of the VI international scientific and practical conference. Part III. - Ulyanovsk, SAU named after P.A. Stolypin. - 2015. - P. 125 -127.
15. Bacteriophages of Enterobacter bacteria and their basic biological characteristics / E.V. Suldina, D.A. Vasilyev, S.N. Zolotukhin, Bogdanov I.I. // Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2017. - № 4 (40). - P. 94 - 98.
