CC BY
74
Новая область применения флавоноидов лекарственных растений
Резюме. Настоящая работа посвящена идентификации флавоноидов в экстрактах лекарственных растений и определению их антимикробной активности по отношению к бактериям рода Pseudomonas, вызывающим порчу пищевых продуктов. Хроматографическими методами установлено, что в вытяжке из ладанника шалфеелистного Cistus salviifolius содержится кемпферол-3-ß-D-глюкопиранозид, обладающий выраженной антибактериальной активностью. На образцах говядины, свинины, мяса птицы и рыбы, инфицированных бактериями Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens или спонтанно развивающейся микробиотой, продемонстрирована активность экстракта ладанника шалфеелистного Cistus salviifolius, что свидетельствует о возможности защиты пищевых продуктов от микробной контаминации.
Ключевые слова: флавоноиды, лекарственные растения, ладанник шалфеелистный, кемпферол-3-ß-D-глюкопиранозид, хромато-масс-спектрометрия, антибактериальная активность, пищевые продукты.
УДК 581.192.2
Хоссам Элькаиб,
стажер кафедры биотехнологии и биоэкологии Белорусского государственного технологического университета, магистр биологических наук; [email protected]
Виктор Леонтьев,
заведующий кафедрой биотехнологии и биоэкологии Белорусского государственного технологического университета, кандидат химических наук, доцент; [email protected]
Лекарственные растения являются ценным источником биологически активных веществ (полифенолов, эфирных масел, алкалоидов, дубильных веществ и др.) и широко применяются как в народной, так и в официальной медицине, особенно в Китае, на Ближнем Востоке и в Северной Африке [1-6]. Флавоноиды, входящие в группу полифенольных соединений, благодаря широкому спектру свойств находят применение в пищевой и парфюмерно-косметической индустрии [7, 8].
В пищевой промышленности используют в основном пряно-ароматические растения - для придания продуктам приятного запаха, вкуса, сохранения цвета, а также
для антиоксидантной и антимикробной защиты [9, 10]. В последние годы появились работы, посвященные изучению способности лекарственных растений предупреждать контаминацию пищевых продуктов [11]. В развитии этого направления в первую очередь заинтересованы страны с жарким климатом в связи с порчей рыбных и мясных изделий, обусловленной микроорганизмами, среди которых доминируют бактерии рода Pseudomonas [12, 13]. Поскольку содержание и состав флавоноидов существенно зависят как от вида растения, так и от климатических условий их выращивания [14, 15], в настоящей работе использовалось сырье из Ливии - пажитник греческий (Trigonella foenum-graecum L.), чабрец головчатый (Thymus capitatus L.), ромашка
аптечная (Matricaria chamomilla L.), шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.) и ладанник шалфее-листный (Cistus salviifolius). Из литературных источников известно, что такие флавоноиды, как люте-олин-7-О-глюкуронид и кемпфе-рол-3-Р-Б-глюкопиранозид, ин-гибируют рост бактерий рода Pseudomonas [16, 17]. Цель настоящего исследования - поиск содержащих эти флавоноиды растений и определение антибактериальной активности их экстрактов.
В предварительных экспериментах было установлено, что для экстракции флавоноидов из лекарственного растительного сырья необходимы 50%-ный этиловый спирт, температура - 20 °C, время - 24 ч.
Для идентификации флавоноидов в водно-спиртовых вытяжках из растений применяли хрома-то-масс-спектрометрический анализ [18, 19], который осуществляли с помощью хромато-масс-спектро-метра (США) с диодно-матрич-ным детектором в диапазоне длин волн 200-700 нм и масс-детекто-ром с электроспрей-ионизацией (eSI) на колонке BDS HYPERSIL C18, 250x4,6 мм, 5 мкм (США). В качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрил: 1%-ный водный раствор муравьиной кислоты в соотношении 20:80 в изократиче-ском режиме при скорости элюи-рования 1 мл/мин.
Исследования водно-спиртовых экстрактов пажитника греческого (Trigonella foenum-graecum L.), чабреца головчатого (Thymus capitatus L.), ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.), шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.), ладанника шалфее-листного (Cistus salviifolius) по значениям m/z молекулярных ионов
Лекарственное растение Время удерживания, мин Ионы, m/z Идентифицированные флавоноиды
Пажитник греческий (Trigonella foenum-graecum L.) 7,10 [M+H]+, 449,49 Ориентин
6,33 [M-H2O+H]+, 431,54 Изоориентин
9,56 [M+H]+, 433,52 Витексин
10,23 [M-H2O+H]+, 415,51 Изовитексин
Чабрец головчатый (Thymus capitatus L.) 21,98 [M+H]+, 447,58; [M-glu+H]+, 271,68 Байкалин
12,41 [M+H]+, 463,54 Скутелларин
41,66 [M+H]+ 289,62 Эриодиктиол
Ромашка аптечная (Matricaria chamomilla L.) 9,40 34,63 [M+H]+, 465,65 [M+H]+, 177,53 Кверцимеритрин Герниарин
Шалфей лекарственный (Salvia officinalis L.) 11,26 [M+H]+, 463,61 Лютеолин-7-О-глюкуронид
19,89 [M+H]+, 609,62; [M-2glu+H]+, 301,70 Диосмин
21,98 [M+H]+, 447,58; [M-glu+H]+, 271,68 Байкалин
Ладанник шалфеелистный (Cistus salviifolius) 15,58 [M+H]+, 449,82; [M-glu+H]+, 287,78 Кемпферол-3-ß-D-глюкопиранозид
Таблица. Идентификация флавоноидов в экстрактах исследуемых лекарственных растений
и фрагментов молекул позволили идентифицировать основные флавоноиды. Лютеолин-7-О-глюкуро-нид и кемпферол-3-Р-Б-глюкопи-ранозид обнаружены только в вытяжках из шалфея лекарственного и ладанника шалфеелистного соответственно (таблица).
Для определения антибактериальной активности водно-спиртовых экстрактов растений применяли метод лунок. Появление прозрачных зон вокруг лунок в питательной агаризованной среде, засеянной суточными культурами Pseudomonas aeruginosa или
Рис. 1. Профиль элюирования компонентов активной фракции I водно-спиртового экстракта ладанника шалфеелистного ¡аМЫш)
|А|
Кемпферол-3-ß-D-глюкопиранозид
Rf = 0.53
о
Рис. 2. Хроматограммы компонентов ладанника шалфеелистного и кемпферол-3-р-0-глюкопира-нозида: А - в парах йода; Б - в УФ-свете; 1 и 1' - исходный экстракт ладанника шалфеелистного; 2 - кемпферол-3-р-й-глюкопиранозид (А); 2' - фракция II (Б); 3 и 3'- фракция I
Б
Pseudomonas fluorescens, свидетельствовало об антибактериальной активности экстракта. По среднему диаметру зон делали вывод о ее уровне.
Согласно результатам исследования, наибольшей антибактериальной активностью по отношению к псевдомонадам обладала водно-спиртовая вытяжка из ла-
данника шалфеелистного, поэтому все дальнейшие работы проводили с ним. Для фракционирования и последующей гидрофобной гель-хроматографии экстракта растения использовали гель Sephadex-ЬИ60 [20]. Водно-спиртовую вытяжку разделяли на фильтре Шот-та с гелем на две фракции. Фракция I свободно проходила через
гель, а фракцию II элюировали 96%-ным этиловым спиртом. Анализ показал, что антибактериальной активностью обладает только фракция I. Для определения наличия в ней кемпферол-Э-в-Б-глюко-пиранозида проводили гель-хроматографию на колонке 2,5x40 см с Sephadex-LH60 при скорости элю-ирования 0,2 мл/мин. Профиль элюирования представлен на рис. 1.
Используя стандартный образец, установили, что хромато-графический пик с объемом выхода 90 мл принадлежит кемпфе-рол-Э-в-Б-глюкопиранозиду. Пик на хроматограмме хорошо разрешен, что позволяет использовать данный подход для препаративного выделения этого флавоноида из фракции I экстракта ладанника шалфеелистного.
С целью экспрессной идентификации кемпферол-Э-в-Б-глюко-пиранозида в исходном экстракте и во фракции I Cistus salviifolius использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с силикагелем (TLC Silica gel 60) в элюирующей системе «изо-пропиловый спирт - гексан - уксусная кислота» в соотношении 10:1:0,5. Результаты представлены на рис. 2: кемпферол-3-в-Б-глюко-пиранозид имеет пятно с Rf = 0,53, которое присутствует на хроматограмме фракции I, является слабо выраженным на хроматограмме исходного экстракта ладанника шалфеелистного, а на хроматограмме фракции II отсутствует.
Экспериментально показано, что ТСХ может быть использована для идентификации кемпфе-рол-3-в-Б-глюкопиранозида в вытяжках из лекарственных растений.
Эффективность защиты пищевых продуктов от микробной
CU Сй
ло
О
нз
Поверхность
Цвет
Запах
HiliH
У J? J- j> / г V ж
ч ■
Обработка образцов
Э - фракция I, Э, - фракция I + P. fluorescens 224, Э2 - фракция I + Р. aeruginosa 410, Э3 - фракция I + P. fluorescens 27, Э4 - фракция I + P. aeruginosa 11
Рис. 3. Изменение органолептических свойств образцов говядины после обработки суспензиями бактерий и активной фракцией I экстракта ладанника шалфеелистного при 4 °С
Поверхность
Цвет
Запах
b
¿г ^ J>
Jt
/у
<?л
v
Обработка образцов
Э - фракция I, Э, - фракция I + P. fluorescens 224, Э2 - фракция I + Р. aeruginosa 410, Э3 - фракция I + P. fluorescens 27, Э4 - фракция I + P. aeruginosa 11
Рис. 4. Изменение органолептических свойств образцов говядины после обработки суспензиями бактерий и раствором активной фракции I экстракта ладанника шалфеелистного при 30 °С
контаминации активной фракцией I экстракта ладанника шалфеелистного определяли, используя штаммы бактерий рода Pseudomonas, выделенные нами из испорченных пищевых продуктов [21]. Кусочки рыбы, говядины, свинины и мяса птицы помещали в чашки Петри, инфицировали бактериями Pseudomonas aeruginosa 11, Pseudomonas aeruginosa 410, Pseudomonas fluorescens 27 и Pseudomonas fluorescens 224 и обрабатывали активной фракцией I экстракта Cistus salviifolius. Затем чашки Петри с образцами инкубировали при 4 °C в течение 9 суток и при 30 °C в течение 5 суток.
Контроль осуществляли ежесуточно по характеру поверхности, цвету и запаху. Результаты, отражающие изменение органолептических свойств образцов говядины после обработки суспензиями бактерий и активной фракцией I экстракта ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius) при 4 °C и 30 °C, представлены на рис. 3 и 4 соответственно.
Так, при инфицировании образцов говядины бактериями P. fluorescens, P. aeruginosa или спонтанно развивающейся микробиотой (контроль) изменения состояния поверхности наблюдали на третьи сутки при инкубировании при 4 °C
и на первые - вторые сутки при 30 °С. Изменения цвета образцов наблюдали на третьи - четвертые сутки при 4 °С и на первые - вторые сутки при 30 °С. Запах у образцов появлялся на третьи сутки при 4 °С и на первые сутки при 30 °С.
Аналогичные зависимости получены и для образцов свинины, мяса птицы и рыбы. Выполненные исследования показали высокую эффективность активной фракции I экстракта ладанника шалфеелистного (&$Ш$ salviifolius) в защите бе-локсодержащих продуктов от микробной порчи: в 1,75-4 раза при 4 °С и в 1,5-4 раза при 30 °С.
Таким образом, ладанник шал-феелистный (Cistus salviifolius) может быть использован для создания препарата, предназначенного для защиты пищевых продуктов от микробной контаминации. ЕЗ
Статья поступила в редакцию 05.07.2018 г.
The presented study has been performed to identify flavonoids from the medicinal plants extracts and their antimicrobial activity against bacteria from the genus Pseudomonas determined food spoilage. Chromatographic methods have established that Sage-leaved Rockrose (Cistus salviifolius) extract contains kaempferol-3-ß-D-glucopyranoside, which possesses significant antimicrobial activity. In beef, pork, poultry and fish samples infected with Pseudomonas aeruginosa bacteria, Pseudomonas fluorescens or spontaneously developed microbiota the activity of Sage-leaved Rockrose (Cistus salviifolius) extract has been demonstrated, which indicates the ability to protect food products from microbial contamination. Keywords: flavonoids, medicinal plants, Sage-leaved Rockrose, kaempferol-3-ß-D-glucopyranoside, chromato-mass spectrometry, antimicrobial activity, food products.
ЛИТЕРАТУРА
1. Пастушенков Л. В. Лекарственные растения. Использование в народной медицине и быту.- СПб., 2012.
2. Носов А. М.Лекарственные растения официальной и народной медицины.- М.,2005.
3. Никитина В. С., Кузьмина Л. Ю., Мелентьев А. И., Шендель Г. В. Антибактериальная активность полифенольных соединений, выделенных из растений семейств Geraniaceae и Rosaceae // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т. 43, № б. С. 705-712.
4. Kalemba D., Kunicka A. Antibacterial and antifungal properties of essential oils // Current medicinal chemistry. 2003. Vol. 10, N10. P. 813-829.
5. Харько И. А., Моисеева А. М., Железняк Н. В., Моисеев Д. В. Антимикробная активность лекарственного растительного сырья, содержащего изохинолиновые алкалоиды // Достижения фундаментальной, клинической медицины и фармации: материалы 72-й науч. сес. сотр. ун-та, 25—2б янв. 2017 г. / ВГМУ.- Витебск, 2017.
6. Akiyama H., Fujii K., Yamasaki O., Oono T., Iwatsuki K. Antibacterial action of several tannins against Staphylococcus aureus // J. Antimicrobial Chemotherapy. 2001. Vol. 48, N4. P. 487-491.
7. Лобанова А. А., Будаева В. В., Сакович Г. В. Исследование биологически активных флавоноидов в экстрактах из растительного сырья // Химия растительного сырья. 2004. № 1. С. 47-52.
Полный список литературы размещен на сайте http://innosfera.by/2018/08/flavonoids
