CC BY
67
Оригинальная статья/Original article_
УДК 615.074
DOI: http://doi.org/10.20914/2310-1202-2017-1-271-275_
Количественное определение флавоноидов ладанника _шалфеелистного (Cistus salviifolius)_
Хоссам М. Элькаиб 1 [email protected] Виктор Н. Леонтьев 1 [email protected] _Павел Н. Саввин 2 [email protected]_
1 Белорусский государственный технологический университет, ул. Свердлова, 13а, г. Минск, 220006, Белорусия
2 Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия Реферат. Широкое применение биофлавоноидов, обусловленное их противомикробной активностью и антиоксидантными свойствами, вызывает необходимость их раздельного определения при совместном присутствии. При этом отмечается, что суммарное содержание флавоноидов, определенное разными спектрофотометрическими методами в одних и тех же образцах, различается и зависит от структуры индивидуальных флавоноидов, входящих в состав образцов. В работе представлены результаты исследований по определению содержания флавоноидов во фракции сухого экстракта ладанника шалфеелистного (Cistus .salviifolius), обладающей антимикробной активностью по отношению к бактериям рода Pseudomonas, вызывающим порчу белоксодержащих пищевых продуктов. Выдедение фла-воноидов проводили последовательным экстрагированием водно-спиртовыми растворами, фильтрованием и растворением сухого остатка в изопропиловом спирте с последующим пропусканием через слои геля. Рассмотрены следующие методики определения фла-воноидов: реакция с реактивом Фолина-Чикальтеу (с использованием в качестве стандарта кверцетина), реакция с хлоридом алюминия и с 2,4-динитрофенилгидразином. При окислении в щелочной среде реактивом Фолина-Чикальтеу, представляющим собой фосфо-мо-либдовольфрамовые гетерополикомплексы флавонолы, флавин-3-олы и флавоны могут превращаться в хиноидные соединения, имеющие полосы поглощения в видимой области спектра. Взаимодействовать с А1С1з могут только фла-вонолы и флавоны, имеющие гид-роксильные группы в положениях 3 и 5. 2,4-динитрофенилгидразин взаимодействует только с флавонолами. Приведены полученные калибровочные кривые и структурные формулы флавоноидов, которые могут быть определены представленными методами. Установлено, что в нем содержится флавонолов - 0,21 мг/мг, флавонов - 0,17 мг/мг и флавин-3-олов - 0,06 мг/мг.
Quantitative determination of sage-leaved rockrose _(Cistus salviifolius) flavonoids_
Hossam M. Elkaib 1 [email protected] Viktor N. Leontiev 1 [email protected] _Pavel N. Savvin 2 [email protected]_
1 Belarusian State Technological University, Sverdlova str., 13a, Minsk, 220006, Republic of Belarus
2 Voronezh state university of engineering technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia
Summary. The widespread use of bioflavonoids, due to their antimicrobial activity and antioxidant properties, necessitates their separate determination in a joint presence. It is noted that the total content of flavonoids, determined by different spectrophotometric methods in the same samples, differs and depends on the structure of the individual flavonoids that make up the samples. The paper presents the results of studies to determine the content of flavonoids in the fraction of the dry extract of shalfeeloid canthus (Cistus salviifolius), which has antimicrobial activity against bacteria of the genus Pseudomonas, which causes damage to protein-containing food products. Curing flavonoids by sequential extraction with aqueous alcohol solutions, filtering and dissolving the dry residue in isopropyl alcohol followed by passing through the gel layers. The following methods for the determination of flavonoids are considered: reaction with Folin-Chikalteu reagent (using quercetin as standard), reaction with aluminum chloride and 2,4-dinitro-phenylhydrazine. When oxidized in alkaline medium by the Folin-Chikalteu reagent, which is the phospho-molybdotungstate heteropolycomplexes of flavonols, flavin-3-ol and flavones can be converted into quinoid compounds having absorption bands in the visible region of the spectrum. Only flavones and flavones having hydroxyl groups at positions 3 and 5 can interact with AlCl3. 2,4-dinitrophenylhydrazine only interacts with flavonols. The obtained calibration curves and structural formulas of flavonoids are given, which can be determined by the methods presented. It was found to contain flavonols 0.21 mg / mg, flavones 0.17 mg / mg and flavin-3-ol 0.06 mg/mg. Keywords: flavonoids, sage faucet, bacteria of the genus Pseudomonas
Введение
Флавоноиды - биологически активные органические вещества, обнаруживаемые в различных растениях, в том числе, и лекарственных [1].
Они находят широкое применение в производстве лекарственных средств в виде индивидуальных соединений [2, 3], экстрактов растительного сырья или измельченных частей растений [4]. В связи с этим достаточно хорошо
разработаны такие методы идентификации и количественного определения флавоноидов, как хроматографические методы - ТСХ [5], ГЖХ [6], ВЭЖХ [7], спектрофотометриче-ские [8]и другие.
Для определения суммарных флавоноидов широкое применение нашли простые и широкодоступные спектрофотометрические методы. Однако суммарное содержание флавоноидов,
Для цитирования For citation
Элькаиб Х. М., Леонтьев В. Н., Саввин П. Н. Количественное опреде- Elkaib H. M., Leontiev V. N., Savvin P. N. Quantitative determination
ление флавоноидов ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius) // of sage-leaved rockrose (Cistus salviifolius) flavonoids . Vestnik VGUIT
Вестник ВГУИТ. 2017. Т. 79. № 1. С. 271-275. doi:10.20914/2310- [Proceedings of VSUET]. 2017. Vol. 79. no. 1. pp. 271-275. (in Russian).
1202-2017-1-271-275 doi:10.20914/2310-1202-2017-1-271-275
определенное разными спектрофотометрическими методами в одних и тех же образцах, различается и зависит от структуры индивидуальных флаво-ноидов, входящих в состав образцов.
Ранее нами было установлено, что спиртовой экстракт ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius) обладает антимикробной активностью по отношению к бактериям рода Pseudomonas, вызывающим порчу белоксодержащих пищевых продуктов [9]. Однако наличие и количественное содержание флавоноидов в этом экстракте не было установлено.
В связи с этим целью настоящей работы явилось количественное определение флавоноидов в спиртовом экстракте ладанника шалфеелист-ного (Cistus salviifolius) разными спектрофото-метрическими методами.
Материалы и методы
Объектом исследования являлась фракция спиртового экстракта ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius), обладающая антимикробной активностью по отношению к бактериям рода Pseudomonas, вызывающим порчу белоксодер-жащих пищевых продуктов.
Навеску измельченного сырья массой 1 г заливали 20 мл 50% этилового спирта и проводили экстракцию при 20 °С и периодическом перемешивании в течение суток. Полученный экстракт отделяли фильтрованием на фильтре Шотта. Растворитель упаривали на роторном испарителе. Сухой остаток растворяли в 50% изопропиловом спирте и пропускали через слой геля Sephadex LH-60 на фильтре Шотта. Прошедшую через гель фракцию желто-зеленого цвета упаривали досуха и полученный темно-коричневый порошкообразный сухой экстракт, обладающий антимикробной активностью, использовали в работе. Бордовая часть экстракта, адсорбированная на Sephadex LH-60, не обладала антимикробной активностью и нами не использовалась [9].
Методики определения флавоноидов
1. Реакция с реактивом Фолина-Чикальтеу. В качестве стандарта использовали кверцетин (Sigma, США). Для построения калибровочной кривой готовили растворы кверцетина в дистиллированной воде с концентрациями 0,075; 0,15; 0,25 и 0,5 мг/мл.
Реактив Фолина-Чикальтеу (Sigma, США) разбавляли дистиллированной водой в 10 раз для получения раствора. Для создания щелочной среды использовали 20% раствор карбоната натрия. Сухой экстракт ладанника шалфеелистного растворяли в дистиллированной воде (0,5 мг/мл).
Для построения калибровочной кривой и определения флавоноидов в экстракте ладанника шалфеелистного к 2 мл раствора кверцетина или раствора сухого экстракта приливали 0,3 мл 0,2 н раствора Фолина-Чикальтеу, 3 мл 20% раствора карбоната натрия. Смесь инкубировали при комнатной температуре 15-20 минут, измеряли экстинкцию при 765 нм против контрольной пробы, в которой растворы кверцетина или сухого экстракта были заменены дистиллированной водой.
Полученная калибровочная кривая представлена на рисунке 1.
2. Реакция с хлоридом алюминия. Для проведения исследований готовили 10% раствор А1С1з в этиловом спирте, 1 М раствор ацетата калия в дистиллированной воде. В качестве стандарта использовали кверцетин, который растворили в 50% этиловом спирте. Сухой экстракт ладанника шалфеелистного (СИзШ salviifolius) растворяли в этом же растворителе. 0,85 0,8 0,75 8 0,7 0,65 0,6 0,55 0,5
и
0
0,1
0,4
0,5
0,2 0,3 С, мг/мл (mg/ml) Рисунок 1. Калибровочная кривая для определения содержания флавоноидов
Figure 1. Calibration curve for determining flavonoids content
Для построения калибровочной кривой и количественного определения флавонолов и флавонов, имеющих гидроксильные группы в положениях 3 и 5 в экстракте ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius), к 0,5 мл раствора кверцетина с концентрациями 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 мг/мл или раствора экстракта ладанника шалфеелистного с концентрацией 0,5 мг/мл приливали при интенсивном перемешивании 1,5 мл этилового спирта (96%), 1 мл раствора А1С1з, 1 мл раствора ацетата калия и 2,8 мл дистиллированной воды. Инкубировали при температуре 20 °С в течение 30 минут и измеряли экстинкцию при 410 нм против контрольной пробы, в которой раствор AlCb был заменен дистиллированной водой.
Полученная калибровочная кривая представлена на рисунке 1.
0,45 0,4 0,35 0,3 S 0,25 И 0,2 0,15 0,1 0,05 0
0,2
0,8
0,4 0,6
C, мг/мл (mg/ml)
Рисунок 2. Калибровочная кривая для определения флавонолов и флавонов имеющих гидроксильные группы в положениях 3 и 5
Figure 2. Calibration curve for flavonols and flavones having hydroxyl groups at positions 3 and 5 determination
3. Реакция с 2,4-динитрофенилгидразином. Готовили 1% раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 80% этиловом спирте. В качестве стандарта использовали нарингин (Sigma, США), растворы которого с концентрациями 0,5; 1,0 и 2,0 мг/мл готовили в этиловом спирте. Сухой экстракт ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius) растворяли в 50% этиловом спирте (концентрация 3 мг/мл).
Для построения калибровочной кривой и определения содержания флавоноидов к 1 мл раствора нарингина или раствора сухого экстракта ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius) приливали 2 мл 1% раствора 2,4-ди-нитрофенилгидразина и 2 мл этилового спирта. Полученные смеси инкубировали 50 минут при 50 °С. Затем пробы охлаждали до комнатной температуры, приливали при интенсивном перемешивании по 5 мл 1% раствора KOH в 70% этиловом спирте. Через 2 минуты по 1 мл смеси из каждой пробы вносили в 5 мл этилового спирта, интенсивно перемешивали и измеряли экстинкцию при 495 нм против контроля, в котором раствор 2,4-динитрофенилгидразина был заменен 80% этиловым спиртом.
Полученная калибровочная кривая представлена на рисунке 1. 0,45
0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 О
а\ тг
Ы
0
1,5
2
0,5 1
С, мг/мл (mg/ml) Рисунок 3. Калибровочная кривая для определения содержания флавонолов
Figure 3. Calibration curve for determining flavonols content
Обсуждение результатов
При окислении в щелочной среде реактивом Фолина-Чикальтеу, представляющим собой фосфомолибдовольфрамовые гетерополиком-плексы флавонолы, флавин-3-олы и флавоны могут превращаться в хиноидные соединения, имеющие полосы поглощения в видимой области спектра. Например, кверцетин может окисляться следующим образом:
[O], ОН-
HO.
Взаимодействовать с AICI3 могут только флавонолы и флавоны, имеющие гидроксильные группы в положениях 3 и 5.
3'
2V '
В этом случае соли А1 образуют комплексные соединения, имеющие характерные полосы поглощения в области 410-430 нм.
\ . Al— /
O. ,O Al
2,4-динитрофенилгидразин взаимодействует только с флавонолами по следующему уравнению реакции:
h2n
При этом образуются замещенные 2,4-динитрофенилгидразоны, имеющие максимумы поглощения при 495 нм.
Проведенные нами исследования показали, что общее содержание флавоноидов в экстракте ладанника шалфеелистного в пересчете на кверцетин (взаимодействие с реактивом Фолина-Чикальтеу) составило 0,44±0,05 мг/мг сухого экстракта. Содержание флавоноидов в пересчете
+
O
5
7
6
H
O
на ниренгин по реакции с 2,4-динитрофенил (по реакции с хлоридом алюминия) оказалось рав-
гидразином составило 0,21±0,03 мг/мг сухого ным 0,38±0,04 мг/мг сухого экстракта ладанника
экстракта, а содержание флавонолов и флавонов шалфеелистного (таблица 1).
Таблица 1.
Содержание флавоноидов в сухом экстракте ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius)
Table 1.
Cedar almond (Cistus salviifolius) dry extract flavonoids content
№ Флавоноиды Flavonoids Содержание, мг/мг Content, mg/mg Метод Method
1 Флавонолы, флавин-3-олы, флавоны Flavonols, flavin-3-ol, flavones 0,44±0,05 Реакция Фолина-Чикольтеу Folin-Chikolteu reaction
2 Флавонолы, флавоны Flavonols, flavones 0,38±0,04 Реакция с AlCb Reaction with AlCb
3 Флавонолы Flavonols 0,21±0,03 Реакция с 2,4 - динитрофенил-гидразином Reaction with 2,4-dinitrofenilhydrazin
Заключение
Представленные в таблице 1 результаты позволяют сделать вывод, что в сухом экстракте
ЛИТЕРАТУРА
1 Kumar Sh., Pandey K. A. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview // The Scientific World Journal. 2014. P. 201-216.
2 Reda S. Mohammed et al. Antioxidant, anti-micro-bial activities of flavonoids glycoside from Leu-caena leucocephala leaves // Journal of Applied Pharmaceutical Science. 2015. V. 5 (06). P. 138-147.
3 Sridevi Sangeetha KS., Umamaheswari S., Uma Maheswara Reddy C., Narayana Kalkura S. Flavonoids: Therapeutic Potential Of Natural Pharma-cologi-cal Agents // International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. 2016. V. 7(10). P. 3924-3930.
4 Chungang C., Fengxia H.. YangL. Opti-miza-tion of the extraction of flavonoids from clovers by response surface methodology (RSM) // Journal of Medicinal Plants Research. 2012." V. 6(37). P. 5103- 5106.
5 Loretta P.O., Daniel G„ Maria E.Z., Mal-gor-zata S. et al. TLC determination of flavonoids from different cultivars of Allium cepa and Allium ascalonicum // Acta Pharm. 2016. V. 66. P. 543-554.
6 AnnatuA., BodirlauR., Nechita C.B., Nicu-laua M. et al. Characterization Of Biological Active Compounds From Verbascum Phlomoides By Chromatography Techniques. I. Gas Chromatography // Romanian Biotech-nological Letters. 2011. V. 16. № 4. P. 6297-6304.
7 Vinayagam A., Sudha P. N. Separation and Identification of Phenolic Acid and Flavonoids from Ne-rium indicum Flowers // Indian J. Pharm. Sci. 2015. №77(1). P. 91-95.
8 Gjoshe S„ Marija K., Marina S„ Vassya B. et al. HPLC and UV-spectrophotometry analysis of flavonoids in spray-dried and freez-dried extracts of Teu-crium polium L. (Lamiaceae) // Maced. pharm. bull. 2012. V. 58(1,2). P. 39-14.
9 Элькаиб X.M., Леонтьев B.H. Иингибированне роста бактерий рода Pseudomonas растительными экстрактами // Труды БГУ. 2015. Т. 10(1). C. 104-106.
ладанника шалфеелистного (Cistus salviifolius) содержится флавонолов - 0,21 мг/мг, флавонов -0,17 мг/мг, флавин-3-олов - 0,06 мг/мг.
REFERENCES
1 Kumar Sh., Pandey K. A. Chemistry and Biological Activities of Flavonoids: An Overview [The Scientific World Journal] 2014. pp. 201-216.
2 Reda S. Mohammed et al. Antioxidant, anti-micro-bial activities of flavonoids glycoside from Leu-caena leucocephala leaves [Journal of Applied Pharmaceutical Science] 2015. vol. 5 (06). pp. 138-147.
3 Sridevi Sangeetha K.S., Umamaheswari S., Uma Maheswara Reddy C., Narayana Kalkura S. Flavonoids: Therapeutic Potential Of Natural Pharma-cologi-cal Agents [International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research] 2016. vol. 7(10). pp. 3924-3930.
4 Chungang C., Fengxia H., Yang L. Optimization of the extraction of flavonoids from clovers by response surface methodology (RSM) [Journal of Medicinal Plants Research] 2012. vol. 6(37). pp. 5103- 5106.
5 Loretta P.O., Daniel G., Maria E.Z., Mal-gor-zata S. et al. TLC determination of flavonoids from different cultivars of Allium cepa and Allium ascalonicum [Acta Pharm] 2016. vol. 66. pp. 543-554.
6 Armatu A., Bodirlau R., Nechita C.B., Nicu-laua M. et al. Characterization Of Biological Active Compounds From Verbascum Phlomoides By Chromatography Techniques. I. Gas Chromatography [Romanian Biotechnologi-cal Letters] 2011. vol. 16. no 4. pp. 6297-6304.
7 Vinayagam A., Sudha P. N. Separation and Identification of Phenolic Acid and Flavonoids from Ne-rium indicum Flowers [Indian J. Pharm. Sci.] 2015. no. 77(1). pp. 91-95 .
8 Gjoshe S., Marija K., Marina S., Vassya B. et al. HPLC and UV-spectrophotometry analysis of flavo-noids in spray-dried and freez-dried extracts of Teu-crium polium L. (Lamiaceae) [Maced. pharm. bull.] 2012. vol. 58 (1, 2). pp. 39-44.
9 Elkaib H.M., Leontiev V.N. Growth Inhibition Of Bacteria From Genus Pseudomonas By Plant Extracts. Trudy BGU [Proceedings of the BSU] 2015. vol. 10(1). pp. 104-106. (in Russian)
BecmHunJBry^T/Proceedings of VSUET, Т. 79, № 1, 207
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ
Хоссам М. Элькаиб аспирант, кафедра биотехнологии и биоэкологии, Белорусский государственный технологический университет, ул. Свердлова, 13 а, г. Минск, 220006, Белоруссия, [email protected] Виктор Н. Леонтьев к. х. н., доцент, заведующий кафедрой, кафедра биотехнологии и биоэкологии, Белорусский государственный технологический университет, ул. Свердлова, 13а, г. Минск, 220006, Белоруссия, [email protected]
Павел Н. Саввин к. т. н., доцент, кафедра химии и химической технологии органических соединений и переработки полимеров, Воронежский государственный университет инженерных технологий, пр-т Революции, 19, г. Воронеж, 394036, Россия, [email protected]
КРИТЕРИЙ АВТОРСТВА
Хоссам М. Элькаиб обзор литературных источников по исследуемой проблеме, провёл эксперимент, выполнил расчёты Виктор Н. Леонтьев написал рукопись, корректировал её до подачи в редакцию и несёт ответственность за плагиат Павел Н. Саввин консультация в ходе исследования КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. ПОСТУПИЛА 12.01.2017 ПРИНЯТА В ПЕЧАТЬ 15.02.2017
INFORMATION ABOUT AUTHORS Hossam M. Elkaib graduate student, biotechnology and bioecology department, Belarusian State Technological University, 13a, Sverdlova str., 220006, Minsk, Republic of Belarus, [email protected]
Viktor N. Leontiev candidate of chemical sciences, associate professor, head of the department, biotechnology and bioecology department, Belarusian State Technological University, 13a, Sverdlova str., 220006, Minsk, Republic of Belarus, [email protected]
Pavel N. Savvin doctor of chemical sciences, professor, chemistry and chemical technology of organic compounds and polymer processing department, Voronezh state university of engineering technologies, Revolution Av., 19 Voronezh, 394036, Russia, [email protected]
CONTRIBUTION
Hossam M. Elkaib review of the literature on an investigated problem, conducted an experiment, performed computations Viktor N. Leontiev wrote the manuscript, correct it before filing in editing and is responsible for plagiarism Pavel N. Savvin consultation during the study CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflict of interest. RECEIVED 1.12.2017 ACCEPTED 2.15.2017
