CC BY
118
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 578.81:579.67 03.02.00 - Общая биология
© A.B. Алешкин, Э.Р. Зулькарнеев, Ю.В. Ларина, О.В. Рубальский, И.А. Киселева, Е.О. Рубальский, О.Г. Ефимова, С.С. Афанасьев, С.С. Бочкарева, К.Н. Смирнова, А.Д. Теплый, 2015
БИОДЕКОНТАМИНАЦИЯ И ПРОДЛЕНИЕ СРОКОВ ГОДНОСТИ МЯСНЫХ И РЫБНЫХ ПОЛУФАБРИКАТОВ С ПОМОЩЬЮ БАКТЕРИОФАГОВ
Алешкин Андрей Владимирович, доктор биологических наук, мастер делового администрирования, главный научный сотрудник, ООО «БиФаг», Россия, 125047, г. Москва, ул. Бутырский Вал, д. 10; главный научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-18-16, e-mail: andreialeshkin@googlemail.com.
Зулькарнеев Эльдар Ринатович, младший научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-18-16, e-mail: elzz89@mail.ru.
Ларина Юлия Владимировна, начальник территориального отдела, главный государственный санитарный врач по Юго-Восточному административному округу г. Москвы, Россия, 109125, г. Москва, Волгоградский проспект, д. 113, корп. 5, тел.: (495) 919-36-91, e-mail: nenmasova@mail.ru.
Рубальский Олег Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии, ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121, тел.: (8512) 52-35-99, e-mail: rubalsky.innovation@gmail.com.
Киселева Ирина Анатольевна, научный сотрудник, ООО «БиФаг», Россия, 125047, г. Москва, ул. Бутырский Вал, д. 10; научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: 8-916-397-22-38, e-mail: irina6804@mail.ru.
Рубальский Евгений Олегович, главный специалист, ООО «БиФаг», Россия, 125047, г. Москва, ул. Бутырский Вал, д. 10; младший научный сотрудник лаборатории прикладной иммунохимии, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: 8-961-798-37-53, e-mail: e.o.rubalsky@gmail.com.
Ефимова Ольга Георгиевна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-18-16, e-mail: info@gabrich.ru.
Афанасьев Станислав Степанович, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, заместитель директора, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: 8-903-667-20-68, e-mail: afanasievss409.4@bk.ru.
Бочкарева Светлана Сергеевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунобиологических препаратов, ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Россия, 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10, тел.: (495) 452-38-03, e-mail: cipl989@gmail.com.
Смирнова Камила Николаевна, магистрант кафедры физиологии, морфологии, генетики и биомедицины, ФГБОУ ВПО «Астраханский государственный университет», Россия, 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, д. 1, каб. 217, тел.: (8512) 52-49-95 (доб. Ill), e-mail: kamila. smirno va@mail. ru.
Теплый Александр Давидович, аспирант кафедры микробиологии и вирусологии, ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет» Минздрава России, Россия, 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, д. 121, тел.: (8512) 52-35-99, e-mail: tkleon@mail.ru.
В ходе исследования были апробированы средства и методы фаг-опосредованного биопроцессинга, позволяющие не только элиминировать патогенные микроорганизмы с поверхности полуфабрикатов в условиях крупных предприятий пищевой отрасли, но и продлевать срок их годности. В качестве объектов исследования использованы образцы купат одного из мясоперерабатывающих заводов города Москвы и радужной форели, свежевыловленной на рыбоперерабатывающем предприятии Республики Карелия. Деконтаминацию образцов проводили с помощью коктейлей оригинальных бактериофагов, полностью охарактеризованных по фено- и генотипическим свойствам. Применение инновационного метода биодеконтаминации 50 кг партии фарша при производстве купат позволило добиться полной элиминации Escherichia coli в обработанной продукции в течение 24 часов, в то время как необработанные фагом образцы были забракованы контрольной лабораторией предприятия. Тридцатисекундная деконтаминация бактериофагом 15 кг партии свежевыловленной форели замедляет бактериальную порчу гидробионтов на 5 суток. Использование нового метода деконтаминации пищевых полуфабрикатов - фаг-опосредованного биопроцессинга - не только позволяет сохранить исходную экологическую чистоту, пищевую ценность и вкусовые качества продуктов, но и продлевает срок их годности относительно существующего в нормативной документации.
Ключевые слова: бактериофаги, фаг-опосредованный биопроцессинг, купаты, радужная форель, срок годности.
BIO-DECONTAMINATION AND EXTENDING SHELF-LIFE OF MEAT AND FISH PRE-PROCESSED FOODS WITH BACTERIOPHAGES
Aleshkin Audrey V., Dr. Sci. (Biol.), MBA, Chief Research Associate, BPhage LLC, 10 Butyrskiy Val St., Moscow, 1250476, Russia, Chief Research Associate, Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: (495) 452-18-16, e-mail: andreialesh-kin@googlemail. com.
Zul'karneev Eldar R, Junior Research Associate, Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: (495) 452-18-16, e-mail: elzz89@mail.ru.
Larina Yuliya K, Head of Territorial Subdivision of Administration, Russian Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing (Rospotrebnadzor) for South-Eastern Division of Moscow, Chief State Sanitary Physician, the South-Eastern Division of Moscow, 113, bid. 5 Volgo-gradskii prospect, Moscow, 109125, Russia, tel.: (495) 919-36-91, e-mail: nenmasova@mail.ru.
Rubalsky Oleg K, Dr. Sci. (Med.), Professor, Head,Department of Microbiology and Virology, Astrakhan State Medical University, 121 Bakinskaya St., Astrakhan, 414000, Russia, tel.: (8512) 52-35-99, e-mail: rubalsky.innovation@gmail.com.
Kiseleva Irina A., Research Associate, BPhage LLC, Butyrskiy Val St., 10, Moscow, 1250476, Russia, Research Associate, Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: 8-916-397-22-38, e-mail: irina6804@mail.ru.
Rubalskii Evgenii ()., Chief Specialist, BPhage LLC, 10 Butyrskiy Val St., Moscow, 1250476, Russia, Junior Research Associate, Laboratory of Applied Immunochemistry, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: 8-961-798-37-53, e-mail: e.o.rubalsky@gmail.com.
EJimova Olga G., Cand. Sci. (Med.), Leading Research Associate, Laboratory of Clinical Microbiology and Biotechnology of Bacteriophages, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: (495) 452-18-16, e-mail: irina6804@mail.ru.
Afanasiev Stanislav S., Dr. Sci. (Med.), Professor, Honored Scientist, Deputy Director, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: 8-903-667-20-68, e-mail: afanasievss409.4@bk.ru.
Bochkareva Svetlana S., Cand. Sci. (Biol.), Senior Research Associate, Laboratory of Immunobi-ological Preparations, G.N. Gabrichevsky Moscow Research Institute for Epidemiology and Microbiology, 10 Admiral Makarov St., Moscow, 125212, Russia, tel.: 8-495-452-38-03, e-mail: cipl989@gmail.com.
Smirnova Kamila N., Graduate student, Department of Physiology, Morphology, Genetics and Bio-medicine, Astrakhan State University, 1 Shaumyan Sq., Astrakhan, 414000, Russia, tel.: (8512) 52-49-95 (add. Ill), e-mail: kamila.smirnova@mail.ru.
Teplyi Aleksandr D., Post-graduate Student, Department of Microbiology and Virology, Astrakhan State Medical University, 121 Bakinskaya St., Astrakhan, 414000, Russia, tel.: (8512) 52-35-99, e-mail: tkleon@mail.ru.
The aim of this research was to test the means and methods of phage-mediated bio-processing, allowing to eliminate pathogenic microorganisms from the surface of pre-processed food products in large food-producing facilities, and to extend their shelf-life. Raw sausages from a Moscow meat-processing plant and rainbow trout from an aquaculture facility in Karelia were selected as specimens for the test. De-contamination of specimens was carried out with original bacteriophage cocktails, fully pheno- and genotype-mapped. The application of a novel method of bio-decontamination allowed eliminating E.coli in 50 kilograms of minced meat within 24 hours, whereas the meat not processed with phages was rejected by the plant's control lab. A thirty-second bacteriophage decontamination of 15 kilograms of freshly-caught rainbow trout shows that bacterial contamination of aquatic organisms can be delayed by 5 days. Using the novel method of decontamination of pre-processed foods - phage-mediated bio-processing, would allow to keep the initial eco-purity, nutrition value and palatability of the products intact, as well as to extend their shelf-life compared to the existing norms and standards.
Key words: bacteriophages, phage-mediated bio-processing, sausage, rainbow trout, shelf-life.
Введение. Впервые возможность использования бактериофагов в качестве антибактериальных агентов была продемонстрирована Феликс д'Эрелль в 1917 г., когда он опубликовал сенсационную новость о вирусах, «пожирающих бактерии», на основе которых ученому удалось разработать средство, элиминирующее шигеллы в организме больных дизентерией солдат [10]. Бактериофаги - это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток с последующим лизисом клетки-хозяина (вирулентные фаги) или образованием лизогенов (умеренные фаги) [3]. Более 80 лет в бывшем Советском Союзе, а позднее и в Российской Федерации на филиалах НПО «Микроген» производятся свыше десятка наименований лекарственных средств как на основе отдельных видов бактериофагов, так и их комбинаций для лечения и профилактики острых кишечных инфекций и декомпенсированных форм дисбактериоза, а также гнойно-воспалительных заболеваний бактериального генеза.
Развитие новых представлений в конце XX - начале XXI века как о молекулярной биологии, так и об экологических взаимоотношениях бактериофагов и их хозяев, а также все более широкое распространение в биосфере антибиотикорезистентных микроорганизмов актуализировали своего рода второе рождение вирусов бактерий (бактериофагов). Существенно возросшее количество персистирующих антибиотикорезистентных патогенных и условно-патогенных микробов, утяжеляющих клиническое течение патологических состояний и ухудшающих показатели инфекционной заболеваемости во многих странах мира, связано как с бесконтрольным и некорректным применением антибиотиков в лечении ряда заболеваний, так и с массовым применением консервантов и бактерицидных препаратов в пищевой промышленности и сельском хозяйстве.
Сегодня перспективными представляются следующие направления по использованию бактериофагов: 1) бактериофаг-опосредованный биоконтроль; 2) фаговый биопроцессинг; 3) профилактическое применение пероральных специализированных продуктов; 4) косметика и средства личной гигиены; 5) фаг-опосредованная биодезинфекция; 6) фагоидентификация потенциально опасных микроорганизмов. В рамках данной работы представлены продукты на основе бактериофагов, относящихся ко второй группе.
Цель: разработать средства и методы фаг-опосредованного биопроцессинга, позволяющие не только элиминировать патогенные, вызывающие острые кишечные и пищевые токсикоинфекции микроорганизмы с поверхности мясных и рыбных полуфабрикатов в процессе их заводской переработки перед упаковкой, но и продлевать срок их годности с сохранением экологической чистоты и вкусовых качеств исходных продуктов питания.
Материалы и методы исследования. Методология НИР была спланирована в соответствии со структурой и задачами исследования. Объектами исследования выступали штаммы патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также бактериофаги, изолированные из объектов окружающей среды. Предметом исследования стала разработка рецептуры, технологии получения, процедур оценки безопасности и эффективности продуктов на основе бактериофагов.
Отсутствие в Российской Федерации прецедента по конструированию, регистрации и применению новых категорий фагосодержащих средств обусловило постановку задачи по созданию собственного алгоритма разработки таких продуктов. Ниже представлены этапы создания
вспомогательного технологического средства: отбор вирулентных штаммов бактериофагов, отработка технологии получения высокоактивного стерильного фаголизата, подтверждение оригинальности и безопасности бактериофагов на молекулярно-генетическом уровне, создание готовой формы фагового коктейля, оценка его безопасности на лабораторных животных и отработка методов фаг-опосредованной деконтаминации в условиях крупномасштабного производства, позволяющая сделать заключение об эффективности разработанного продукта.
Согласно разработанному алгоритму, на первом этапе исследований были выделены и идентифицированы штаммы бактерий-мишеней: 1) при разработке средства деконтаминации мясного фарша из исходного сырья, поступающего на крупный мясоперерабатывающий завод; 2) для создания средства деконтаминации и продления срока годности охлажденной рыбы с поверхности форели, выращиваемой в искусственных водоемах Карельского региона.
В соответствии с поставленной задачей был использован комплекс инновационных лабораторных методов исследования, включающий в себя классические микробиологические методы с посевом исследуемого материала на несколько видов питательных сред и использованием отечественных и импортных коммерческих биохимических тест-систем. Видовую идентификацию трудно культивируемых микроорганизмов проводили масс-спектрометрическим методом с использованием времяпролетного масс-спектрометра МАЬБ1-ТОР М8 - ВюМепеих У1ТЕК М8 МАЬБ1-ТОР («ЫоМепеих», Франция).
Далее осуществляли выделение из объектов окружающей среды и селекцию вирулентных штаммов бактериофагов по спектру их специфической литической активности против идентифицированных бактерий-мишеней. Выделение бактериофагов и изучение их биологических свойств проводили методами, предложенными М. Адамсом [9] и Д.М. Гольдфарбом [4].
Для определения титра фаговых частиц и морфологии негативных колоний использовали метод Грациа [1].
Обязательным этапом при выборе индикаторной бактериальной культуры, на которой в дальнейшем будет культивироваться бактериофаг, являлась ее проверка на лизогенность в тесте по индукции профага в клетке с помощью митомицина С или ультрафиолетового облучения. Морфологическую структуру бактериофагов исследовали с помощью электронной микроскопии нативных фаговых частиц. Уникальность и вирулентную природу бактериофагов подтверждали в процессе биоинформационного анализа, представляющего собой следующую процедуру: на основе данных высокопроизводительного секвенирования второго поколения Ion Torrent Sequencing проводили сборку генома бактериофага в режиме de-novo с использованием пакета программного обеспечения NEWBLER («Roche Diagnostics», Швейцария). Собранный геном имел точность прочтения каждого нуклеотида не ниже 99,9 %. Далее осуществляли поиск открытых рамок считывания с целью аннотирования генома - определения возможных генов. Потенциальные продукты этих генов анализировались при помощи программного обеспечения PHACTS [11], которое позволяло предсказать тип жизненного цикла бактериофага (умеренный или вирулентный). Подтверждение вирулентности бактериофага осуществляли также в ходе выявления генов, кодирующих известные интегразы, репрессоры транскрипции или их гомологи. Такой поиск производили с использованием собранной из различных открытых ресурсов базы данных аминокислотных последовательностей умеренных бактериофагов и алгоритма blastp. Высокоактивные стерильные фаголизаты получали согласно собственному методу [6]. Оценку безопасности производственно-перспективных штаммов фагов в соответствии с собственными разработанными процедурами проводили дополнительно в испытаниях на лабораторных животных [5].
Результаты исследования и их обсуждение. Для обеззараживания сырых колбас в натуральной оболочке на основе измельченной мякоти свинины (так называемый купат) создано и прошло апробацию в условиях крупномасштабного мясоперерабатывающего производства в г. Москве вспомогательное технологическое средство, содержащее коли, сальмонеллезные и листериозный бактериофаги. Коктейль бактериофагов, включавший в себя 7 штаммов фагов против Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, Salmonella infantis, Listeria monocytogenes, использовали для обработки купатного фарша массой 50 кг (33 кг мяса и 17 литров воды со специями), что составляло половину производственной партии, изготавливаемой за смену. Вторую половину партии перемешивали со специями без добавления бактериофагов и далее упаковывали в натуральную оболочку отдельно от опытной партии. 140 мл фагового коктейля вносили в 17 л воды и перемешивали в течение 10 мин со специями и мясным фаршем. Финальная концентрация фагов в опытной партии фарша составляла не менее 108 БОЕ/г фарша (табл. 1). После перемешивания обработанный фагами фарш упаковывали, как и контрольную партию, в натуральную оболочку (кишки) в виде колбас.
Таблица 1
Коктейль бактериофагов для деконтаминации свиного фарша при изготовлении купат_
Наименование Бактерия-мишень Финальный титр, Вес партии Время перемеши-
фага БОЕ/г фарша, кг вания, мин
BPhEcl E. coli 0104:H4 ЗхЮ8 50 10
BPhEc2 E. coli 0157:H7 3x10*
ВРЬЕсЗ Энтеропатогенные E. coli 4х10у
BPhSIl Salmonella infantis ЗхЮ8
BPhSTl Salmonella typhimurium 2х10у
BPhSEl Salmonella enteritidis 3x10*
BPhLml Listeria monocytogenes 1,3x10"
Микробиологический мониторинг проводили в течение всего срока годности продукции - 7 суток, образцы из контрольной и опытной партии хранили при температуре 4 ± 2° С. Проведенный эксперимент показал, что листерий и сальмонелл в 25 г исходных образцов обнаружено не было. Согласно TP ТС 021/2011 [8], Е. coli должна была отсутствовать в 0,0001 г купат. Однако она была идентифицирована в образцах 1 и 2 до деконтаминации бактериофагом в концентрации 102 КОЕ/0,0001 г. Уже на 2 сутки в образце, обработанном фагом, кишечной палочки не оказалось в 4 разведении, в то время как в контрольной партии ее количество продолжало увеличиваться, достигнув на 7 сутки 10б КОЕ (табл. 2). Общее микробное число КМАФАнМ также превысило нормативные показатели и на 7 сутки равнялось 1012 КОЕ/г. Видимо, последнее вызвало характерный запах про-
тухшего мяса и зеленоватое потемнение фарша в контрольных образцах начиная с 5 суток, в то время как обработанные бактериофагом образцы выглядели более свежими даже после 7 суток хранения в холодильнике.
Таблица 2
_Деконтаминация купат с помощью бактериофагов_
Параметры TP ТС 021/2011 1 сутки 2 сутки 3 сутки 4 сутки 5 сутки 6 сутки 7 сутки
1* 2** 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
E. coli, KOE/O.OOOl г Cl о с] О гп О Роста не обнаружено гп О Роста не обнаружено т О Роста не обнаружено О Роста не обнаружено о Роста не обнаружено О Роста не обнаружено
Органолептические свойства Свежее мясо Свежее мясо Свежее мясо Свежее мясо Запах протухшего мяса Свежее мясо Запах протухшего мяса Свежее мясо Запах протухшего мяса Свежее мясо
Примечание: *- 1 - куп am а, не обработанная бактериофагом (из контрольной партии); ** — 2 — куп am а, обработанная бактериофагом (из опытной партии)
Процесс эрадикации Е. coli в обработанных бактериофагом образцах в течение первых 2 суток после деконтаминации соответствовал возрастанию в этот период титра эшерихиозных бактериофагов, максимальные концентрации которых обнаруживались именно на 2 сутки эксперимента (рис. 1).
w о
pq
2 3 4
Сутки после деконтаминации
BPhEc2 -±=BPhEc3 —■—BPliSIl —■
BPhSTl
BPhSEl
SPliLml
Рис. 1. Изменение титра бактериофагов в образцах купат из опытной партии
Таким образом, применение инновационного метода биодеконтаминации 50 кг партии фарша при производстве купат позволило добиться полной элиминации Е. coli в обработанной продукции в течение 24 часов, в то время как контрольные образцы, приготовленные из той же партии исходно контаминированного кишечной палочкой фарша, были забракованы контрольной лабораторией предприятия.
На базе одного из рыбоперерабатывающих предприятий Республики Карелия в процессе переработки потрошеных тушек свежевыловленной радужной форели было использовано средство биоконсервации на основе коктейля бактериофагов, активных в отношении Aeromonas hydrophila, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Routella ornithynolytica, Citrobacter freundii,
Listeria monocytogenes, являющихся ведущими микроорганизмами из прижизненной микрофлоры гидробионтов данного региона, вызывающими порчу продукта. Коктейль бактериофагов объемом 85 мл разводили очищенной водой в 10-литровой емкости, после чего проводили фаг-опосредованный биопроцессинг обработанной потрошеной рыбы (в количестве 21 штуки массой 600-800 г) путем ее погружения в указанный объем на 30 с (табл. 3).
Таблица 3
Коктейль бактериофагов для деконтаминации и продления срока годности охлажденной форели
Наименование Бактерия-мишень Финальный Вес партии Время деконтаминации
фага титр, БОЕ/мл рыбы, кг каждой рыбы, с
BPh Ahl Aeromonas hedrophila 10s 15 30
BPliPfl Pseudomonas fluorescens 10s
Psf Pseudomonas fluorescens 10'
Psp06 Pseudomonas putida 10'
BpliRol Raoultella ornithinolvtica 10s
BPhCfl Citrobacter freundii 10s
Lml Listeria monocytogenes 10'
На рисунке 2 представлен периодический микробиологический мониторинг деконтаминированных бактериофагом и контрольных образцов рыбы: уровень контаминации опытных образцов на 18 сутки эксперимента совпадает со значением, полученным на необработанной рыбе на 12 день хранения.
1 10 100 1000 10000 100000 1000000 юоооооа00000000
КОЕ/г
После обработки бактериофагами Без обработки бактериофагами
Рис. 2. Периодический микробиологический мониторинг деконтаминированных бактериофагом и контрольных образцов охлажденной рыбы
Следующий график (рис. 3) отражает изменения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) опытных и контрольных образцов охлажденной рыбы, с учетом порогового значения, установленного для данного вида продукции в ТР ТС 021/2011 [8] (КМАФАнМ не вышеЮ5КОЕ/г). Подобные изменения позволяют приблизительно оценить увеличение срока хранения обработанных бактериофагом образцов до выхода за пределы нормального значения данного параметра в 5 суток.
-Образцы обработанные бактериофагами 10000000 _ _ Контрольные образцы -Допустимый уровень ТР ТС 021/2011 юоооооо г ^ / Н 1000000 / X ёх...... /
О в ь — Щ й й ' < о о ^ х Й юооо ^ " О " 10ОП
¡5 Ей -** ^^ о й ^ ^ ^^^ и ^ % 100 Н о ^^ О й Сч ^^^ СО 5 й ^^^ р Ъ я 10 е. V В.
СРОК ХРАНЕНИЯ.
6 " СУТКИ _12 3456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Рис. 3. Продление срока годности охлажденной радужной форели на 5 суток за счет применения фаг-опосредованного биопроцессинга
Таким образом, периодический контроль микробиологических и органолептических параметров обработанных коктейлем бактериофагов образцов охлажденной рыбы подтвердил возможность продления кондиционного состояния свежевыловленной форели на 5 суток при полном сохранении экологической чистоты и пищевой ценности продукции, что предполагает в дальнейшем внесение изменений в ГОСТ 814-96 «Рыба охлажденная» [7] по параметру «срок годности».
Выводы. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что эффективные концентрации бактериофага различаются в зависимости от вида деконтаминируемого продукта. Так, сравнивая собственные данные с результатами исследований американской корпорации 1п1:га1уйх и голландской Мюгеов, следует отметить, что в жидких пищевых продуктах (молоко и сырный рассол) распространение фаговых частиц происходит равномерно и свободно. Более сложными с точки зрения фагового биопроцессинга являются продукты с неровной поверхностью, обладающие большой площадью (рыба, мясо и морепродукты), что физически ограничивает доставку фаговых частиц ко всем бактериальным клеткам-мишеням [2]. Экспериментально подобранная универсальная (с точки зрения достижения максимального эффекта деконтаминации пищевых продуктов) концентрация фаговых частиц во вспомогательных технологических средствах согласуется с литературными данными и составляет не менее 107 БОЕ/мл или г.
Список литературы
1. Адаме, М. Бактериофаги : пер. с англ. Т. Ильина, П. Солитерман, В. Хвостовой / М. Адаме; под. ред. А. С. Кривиского - М. : Изд-во иностранной литературы, 1961. - 528 с.
2. Алешкин, А. В. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств деконтаминации в области питания / А. В. Алешкин, М. В. Зейгарник // Вопросы диетологии. - 2012. - Т. 2, № 4. -С. 24-34.
3. Алешкин, А. В. Опыт деконтаминации пищевых полуфабрикатов с помощью бактериофагов / А. В. Алешкин, Ю. В. Ларина, Н. В. Воложанцев, М. В. Зейгарник, И. А. Киселева, В. В. Веревкин, Э. А. Светоч, Э. Р. Зулькарнеев, Е. О. Рубальский, С. С. Афанасьев, О. Г. Ефимова, С. С. Бочкарева // Вопросы диетологии. - 2015. - Т. 5, № 1. - С. 24-30.
4. Гольдфарб, Д. М. Бактериофагия / Д. М. Гольдфарб; под ред. и с предисл. В. Д. Тимакова. - М. : Медгиз, 1961.-297 с.
5. Киселева, И. А. Специализированный продукт диетического профилактического питания на основе коктейля бактериофагов : конструирование, технология производства, оценка безопасности и эффективности применения : автореф. дис. ... канд. биол. наук / И. А. Киселева. - М., 2015. - 26 с.
6. Киселева, И. А. Пат. 2525141 Рос. Федерация, МПК C12N7/00; А61К35/76. Способ получения бактериофага / И. А. Киселева, А. В. Алешкин, В. В. Веревкин, Э. А. Светоч, С. С. Афанасьев, Е. О. Рубальский, Е. Е. Рубальская, М. О. Рубальский, О. Г. Ефимова, Д. А. Васильев, С. Н. Золотухин. - № 2013126187/10; заявл. 07.06.2013; опубл. 10.08.2014. Бюл. № 22.
7. Межгосударственный стандарт : Рыба охлажденная, Технические условия ICED FISH. SPECIFICATIONS. ГОСТ 814-96. - М. : Издательство стандартов, 1997. - 6 с.
8. TP ТС 021/2011. Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции».
2011. - Режим доступа : http://www.eurasiancommission.org/ru/act/texnreg/deptexreg/tr/Documents/
TR%20TS%20PishevayaProd.pdf, свободный. - Заглавие с экрана. - Яз. рус. - Дата обращения : 10.11.2015.
9. Adams, Н. М. Bacteriophages / Н. М. Adams.- New York : Interscience Publishers, Inc.; London : Interscience Publishers Ltd., 1959. - 592 p.
10. Häusler, Т. Viruses vs. superbugs: a solution to the antibiotics crisis? / T. Häusler. - New York : MacMillan, 2008.-292 p.
11. McNair, K. PHACTS, a computational approach to classifying the lifestyle of phages / K. McNair, B. A. Bailey, R. A. Edwards // Bioinformatics. - 2012. - Vol. 28, № 5. - P. 614-618.
References
1. Adams M. Bakteriofagi [Bacteriophages]. Translated into Russian by Il'ina Т., Soliterman P., Khvostova V. Ed. by Kriviskiy A.S. Moscow, Izdatel'stvo inostrannoy literatury [Foreign Literature Publishing House], 1961, 528 p.
2. Aleshkin A. V., Zeygarnik M. V. Vozmozhnosti primeneniya bakteriofagov v kachestve probioticheskikh sredstv dekontaminatsii v oblasti pitaniya [Possibilities of using bacteriophages as probiotic medications for decontamination in nutrition], Voprosy dietologii [Nutrition], 2012, vol. 2, no. 4, pp. 24-34.
3. Aleshkin A. V, Larina Yu. V, Volozhantsev N. V., Zeygarnik M. V., Kiseleva I. A., Verevkin V. V., Svetoch E. A., Zul'karneev E. R., Rubal'skiy E. O., Afanas'ev S. S., Efimova O. G., Bochkareva S. S. Opyt dekontaminatsii pishchevykh polufabrikatov s pomoshch'yu bakteriofagov [An experience of decontamination of semi-processed foods using bacteriophages]. Voprosy dietologii [Nutrition], 2015, vol. 5, no. 1, pp. 24-30.
4. Gol'dfarb D. M. Bakteriofagiya [Bacteriophagia]. Ed. by V. D. Timakov. Moscow, Medgiz, 1961, 297 p.
5. Kiseleva I. A. Spetsializirovannyy produkt dieticheskogo profilakticheskogo pitaniya na osnove kokteylya bakteriofagov: konstruirovanie, tekhnologiya proizvodstva, otsenka bezopasnosti i effektivnosti primeneniya. Avtoreferat dissertatsii kandidata biologicheskikh nauk [Specialized prophylactic nutrition dietary product based on a cocktail of bacteriophages: development, production technology, safe and effective use assessment. Abstract of thesis of Candidate of Biological Sciences]. Moscow, 2015, 26 p.
6. Kiseleva I. A., Aleshkin A. V., Verevkin V V., Svetoch E. A., Afanas'ev S. S., Rubal'skiy E. O., Rubal'skaya E. E., Rubal'skiy M. O., Efimova O. G., Vasil'ev D. A., Zolotukhin S. N. Sposob polucheniya bakteriofaga [A method for producing a bacteriophage]. Patent RF, no. 2525141, 2014.
7. Mezhgosudarstvennyy standart: Ryba okhlazhdennaya, Tekhnicheskie usloviya ICED FISH. SPECIFICATIONS. GOST 814-96 [Interstate standard: Iced fish, specifications. GOST 814-96]. Moscow, Izdatel'stvo standartov [Standards Publishing House], 1997, 6 p.
8. TR TS 021/2011. Tekhnicheskiy reglament Tamozhennogo soyuza «О bezopasnosti pishchevoy produktsii», 2011. [Technical Regulations of the Customs Union "On Safety of Food Products"]. Available at: http://www.eurasiancommission.org/ru/act/texnreg/deptexreg/tr/Documents/TR%20TS%20PishevayaProd.pdf, (accessed 10 November 2015).
9. Adams H. M. Bacteriophages. New York: Interscience Publishers, Inc.; London: Interscience Publishers Ltd., 1959, 592 p.
10. Häusler, Т. Viruses vs. superbugs: a solution to the antibiotics crisis? New York: MacMillan, 2008, 292 p.
11. McNair K., Bailey B.A., Edwards R.A. PHACTS, a computational approach to classifying the lifestyle of phages. Bioinformatics, 2012, vol. 28, no. 5, pp. 614-618.
