Взаимодействие colletotrichumlupini и Trichodermaharzianum при совместном росте в культуре Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

Бюллетень Брянского отделения РБО, 2019. № 1 (17). С. 49-53.

Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2019.

N1 (17). P. 49-53.

БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 981.2+579.64

Взаимодействие Colletotrichum lupini и Trichoderma harzianum при совместном росте в культуре

© И. Я. Нам, В. В. Заякин, М. С. Кобозева

I. Ya. Nam, V. V. Zayakin, M. S. Kobozeva

Interaction of Colletotrichum lupini and Trichoderma harzianum grown together

ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет им. акад. И. Г. Петровского»

241036, Россия, г. Брянск, ул. Бежицкая, д. 14. Тел.: +7 (919) 198-25-81, e-mail: vladimir.zajackin@yandex.ru

Аннотация. Методом встречного роста на чашках Петри изучали взаимодействие Trichoderma harzianum 18-ВИЗР, входящего в состав средств биологической защиты, и различающихся генетически и по скорости роста изоля-тов возбудителя антракноза люпина на двух средах - агаре Чапека и картофельно-глюкозном агаре (PDA). Скорость роста изолятов определяет положение точки встречи мицелиев и расстояние ингибирования роста от точек посева. Но взаимодействие по типу взаимной конкуренции наблюдалось только на картофельно-глюкозном агаре, а на агаре Чапека происходило взаимопроникновение мицелиев с образованием зоны смешанного роста грибных культур, особенно выраженной для быстрорастущих изолятов. Рост одного из медленнорастущих изолятов 12ж полностью подавляется на среде PDA; на поверхности его колонии появляется спороношение Trichoderma, что может косвенно свидетельствовать о проявлении микопаразитизма. Наоборот другой медленнорастущий изолят 48 успешно конкурирует с Trichoderma, Обнаруженный эффект усиления растительным экстрактом конкуренции и подавления роста изолятов патогена может иметь практическое значение для улучшения эффективности биопрепаратов.

Ключевые слова: Trichoderma harzianum, Colletotrichum lupini, антагонизм грибов, влияние питательной среды.

Abstract. Interaction of plant disease of biocontrol fungus Trichoderma harzianum 18-VIZR with isolates of Colletotrichum lupini was investigated on two media - potato-dextrose agar (PDA) and Chapek agar. Speed of isolates mycelium growth determins the distance of Trichoderma and inhibits pathogen colony growth on PDA. On Chapek agar antagonistic interaction is much less intensive. After the contact of fungi colonies was observed formation of a zone of mixed growth of two myceliums, especially evident for the fast growing isolates. Slow growing isolate 12zh is fully inhibited by Trichoderma in PDA and its sporulation on the surface of the isolate colony may be an argument for mycoparasitism. On the contrary, another slow growing isolate 48 competes with T. harzianum very well, so, there was observed a zone without Trichoderma sporulation. The found effect of stimulation of fungi antagonistic interaction by potato extract might have a practical significance.

Keywords: Trichoderma harzianum, Colletotrichum lupini, antagonism of fungi, the influence of substrate.

DOI: 10.22281/2307-4353-2019-1-49-53

Введение

Заболевание антракнозом, вызываемое в основном несовершенным грибом Colletotrichum lupini comb. nov., является главным фактором, сдерживающим люпиносеяние в России (Таку-нов, 1996). Поэтому борьба с этим заболеванием является одной из актуальных задач сельского хозяйства, направленной на решение проблемы дефицита кормового белка. Стандартным подходом к решению этой задачи является применение фунгицидов. Однако это приводит к загрязнению окружающей среды и быстрому появлению устойчивых форм патогенов (Тюте-рев, 2001; Кутузова и др., 2015). Альтернативой этому подходу является использование биологических средств защиты растений. В частности, в последние десятилетия активно изучаются и внедряются препараты на основе разных видов грибов рода Trichoderma (Benitez et al., 2004; Акрами, Шихлинский, 2010; Шарипова и др., 2013). Существуют также промышленные препараты на их основе. Целью нашей работы было изучить характер взаимодействия Colleto-trichum lupini и Trichoderma harzianum в условиях культивирования на питательных средах.

Материалы и методы

Для работы были выбраны изоляты возбудителя антракноза люпина из собранной нами и частично охарактеризованной ранее коллекции, насчитывающей свыше 60 моноспоровых изолятов с четырёх видов люпина (Lupinus albus L., L. angustifollius L., L. luteus L., L. polyphyllus Lindl.) с территории России и Беларуси (Нам и др., 2018). Скорости роста грибных колоний могут иметь существенное значение для конкурентоспособности изолятов. Поэтому были выбраны по несколько изолятов из групп со средней, низкой и высокой скоростью роста, причем так чтобы изоляты в каждой группе имели существенные генетические различия (по предварительной оценке).

В качестве представителя рода Trichoderma использовали культуру промышленного штамма Trichoderma harzianum 18-ВИЗР, входящего в состав препарата Глиокладин.

Культивирование проводили на двух стандартных средах для выращивания грибов: агаре Чапека и картофельно-глюкозном агаре, которые рекомендуются в том числе и для культивирования грибов рода Colletotrichum (Cannon, 2012).

В работе использовали метод встречного роста грибов. Грибы высевали на определённом расстоянии с помощью агаровых блоков со стороной 2 мм. Отмечали линию первоначального соприкосновения колоний, растущих навстречу друг другу. Следили за динамикой дальнейшего роста колоний и определяли характер взаимодействия грибов. Опыты проводили в четырёх повторно-стях. На фотографиях (рис. 1, 2) представлены типичные результаты одной из повторностей.

Результаты и обсуждение

По результатам проведённого исследования, характер взаимодействия грибов зависит как от их скорости роста, так и от среды культивирования. На рис. 1, 2 по положению линий соприкосновения видно, что скорость роста Trichoderma harzianum существенно выше скорости роста Colletotrichum lupini, кроме самых быстрорастущих изолятов 1.4 и 52.2, первоначальный контакт с колониями которых наблюдался примерно на равном расстоянии от точек посева.

Медленнорастущие и, в меньшей степени, изоляты со средней скоростью роста постепенно обрастали мицелием Trichoderma с разных сторон. Но из двух медленнорастущих изолятов (48 и 12ж) только для изолята 48 наблюдается наличие на обеих средах широкой пограничной зоны между колониями, где отсутствует не только дальнейший рост C. lupini, но и полностью подавлено спороношение T. harzianum.

В этом случае можно говорить о взаимной конкуренции грибов и предположить, что изолят 48 C. lupini выделяет вещества, подавляющие на некотором расстоянии спороношение T. harzianum.

С изолятом 12ж ситуация другая - после контакта рост C. lupini полностью подавлен, но T. harzianum продолжает рост, и на поверхности колонии возбудителя антракноза со временем появляется спороношение T. harzianum (рис. 2).

Другие изоляты на картофельно-глюкозном агаре после контакта тоже полностью прекращают рост. При этом также прекращается рост T. harzianum, но прозрачные свободные от спороношения зоны полностью отсутствуют в случае быстрорастущих изолятов или слабо выражены в случае изолятов со средней скоростью роста (рис. 1). Образуются почти не меняющиеся со временем границы контакта колоний, расположение которых определяется относительной скоростью роста грибов.

На агаре Чапека характер взаимодействия грибных культур существенно отличается. После первоначального контакта обе колонии продолжают расти, хоть и с меньшей скоростью. Образуются зоны «пересечения», в которых наблюдается совместный рост грибов в смешанной культуре. Этот эффект наиболее сильно выражен для быстрорастущих изолятов, явно заметен у изолятов со средней скоростью роста и почти отсутствует у медленно растущих изолятов (рис. 1).

В зонах совместного роста образуется как мицелий C. lupini, в том числе воздушный (изолят 1.4), так и споры у T. harzianum (рис. 2). Из-за уменьшения подавления роста изоля-тов диаметр колоний несколько увеличивается, они становятся более симметричными. Это особенно хорошо заметно для изолята 10Б (рис. 2).

д е

Рис. 1. Взаимодействие различных изолятов C. lupini и T. harzianum 18-ВИЗР на двух средах (обратная сторона чашек). Слева - картофельно-глюкозный отвар, справа - те же изоляты на агаре Чапека. а - быстрорастущий изолят 1.4, б -быстрорастущий изолят 52.2, в - медленнорастущий изолят 48, г - медленнорастущий изолят 12ж, д - изолят со средней скоростью роста 10Б, е - изолят со средней скоростью роста 4.2М. Штрихи на чашках и жирные стрелки указывают на линию первоначального соприкосновения колоний, стрелки средней жирности - положение границы колонии C. lupini через 4 дня после контакта, тонкие стрелки - положение границы колонии C. lupini через 9 дней.

Рис. 2. Взаимодействие различных изолятов C. lupini и T. harzianum 18-ВИЗР на двух средах (верхняя сторона чашек). Слева - картофельно-глюкозный отвар, справа - те же изоляты на агаре Чапека. а - медленнорастущий изолят 48, б - медленнорастущий изолят 12ж, в - быстрорастущий изолят 1.4, г - изолят со средней скоростью роста 10Б. Остальные обозначения - те же, что для рис. 1.

Без специальных способов окраски проследить распространение мицелия Тпсквёегша на фоне колонии изолятов возбудителя антракноза затруднительно. Косвенно об этом можно судить только по появлению спороношения. Поэтому в качестве количественной оценки возможности совместного роста измеряли расстояние от линии первичного контакта до границы мицелия изолятов С. ¡ырШ на фоне колонии Тпсквёегша (табл.).

Таблица

Формирование зон совместного роста мицелия на разных средах.

Изолят *Зона пересечения колоний на среде PDA, мм Зона пересечения колоний на агаре Чапека, мм

Через 5 дней Через 9 дней Через 15 дней Через 5 дней Через 9 дней Через 15 дней

1,4 - <1 1,62±0,11 4,12±1,03 18,80±0,79 27,50±0,88

52,2 - <1 1,50±0,88 3,25±0,45 13,00±2,30 27,50±1,50

48 - 1,88±0,12 2,01±0,67 <1 3,50±0,17 11,00±0,67

12ж - <1 1,00±0,33 <1 3,75±0,83 7,38±0,28

10Б - <1 1,00±0,33 <1 8,12±0,36 16,50±0,88

4,2М - <1 1,62±0,56 <1 4,25±0,08 7,00±0,67

Примечание: * - измерялось от точки контакта до границы мицелия C. lupini.

Таким образом, по данным табл. и рис. 1 и 2, на среде Чапека наблюдается ослабление конкурентных взаимоотношений грибов-антагонистов. Такой тип взаимодействий Tricho-derma с патогенами в литературе не обсуждался, как и влияние среды на резкую смену стратегии. Можно предположить, что экстракты растений (отвар картофеля) содержат индукторы, которые переключают грибы рода Trichoderma на другой тип конкурентных отношений, стимулируя тем самым их защитные свойства. Это согласуется с тем, что в присутствии отвара картофеля среда часто окрашивается в жёлтые тона за счёт выделений Trichoderma (рис. 1 и 2). Среди метаболитов, образуемых этими грибами, обнаруживается целый набор фунгицидных веществ, относящихся к разным классам по химическому строению, в том числе окрашенных (Rubio et al., 2009; Zeilinger et al., 2016). Помимо выделения веществ с антигрибковыми свойствами грибы рода Trichoderma могут взаимодействовать с корнями растений, заселять их поверхность и вступать с растениями в отношения с элементами симбиоза, что выражается в индукции системной устойчивости и стимуляции роста (Голованова и др., 2009; Валиулина, Голованова, 2011; Корнилова и др., 2011).

Уникальной отличительной особенностью грибов рода Trichoderma является их склонность к «гиперпаразитизму». Под этим термином понимается способность этих грибов в тесном контакте с гифами патогенных грибов питаться за их счёт, что обычно заканчивается уничтожением патогена. Таким свойством обладают многие представители рода, в том числе и Trichoderma harzianum (Шарипова и др., 2013; Atanasova et al., 2013). Выбор типа паразитизма или конкурентных взаимодействий зависит от штамма и вида Trichoderma, вида патогена, присутствия растения-хозяина.

В нашем случае такой тип взаимодействия при дальнейших исследованиях может быть выявлен только в случае изолята 12ж. По-видимому, при взаимодействии Trichoderma harzianum с грибами рода Colletotrichum более характерно проявление не паразитических, а конкурентных отношений (Sharma et al., 2017).

Контакт с растением, патогеном или хитином, имитирующим клеточную стенку гриба, инициирует синтез большого числа новых белков, в частности включающих регуляторные белки, ферменты ответственные за синтез фунгицидных веществ, гидролитические ферменты, разрушающие клеточные стенки патогенов (Samolski et al., 2009; Atanasova et al., 2013). Наши данные хорошо согласуются с этими представлениями, поскольку растительный экстракт (отвар картофеля) явно переключает взаимодействие между грибами на другой тип.

Полученные результаты могут быть использованы при разработке технологий применения биопрепаратов на основе Trichoderma для повышения их эффективности, например, с помощью добавок, стимулирующих конкурентные свойства биофунгицида.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-44-320985.

Список литературы

Акрами М., Шихлинский Г. М. 2010. Способность комбинаций Trichoderma harzianum и Trichoderma aperellum, выделеных для борьбы с фузариозной гнилью гороха, в сравнени с влиянием Trichoderma harzianum // Устойчивое развитие горных территорий. № 4 (6). C. 45-48. [Akrami M., Shikhlinskii G. M. 2010. Cposobnost' kombinatsii Trichoderma harzianum i Trichoderma aperellum, vydelenykh dlya bor'by s fuzarioznoi gnil'yu gorokha, v sravneni s vliyaniem Trichoderma harzianum // Ustoichivoe razvitie gornykh territorii. N° 4 (6). P. 45-48.]

Валиулина А. Ф., Голованова Т. И. 2011. Trichoderma как агент защиты растений в условиях стресса // «Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии» - XIV Международная научно-практическая конференция. С. 415-417. [Valiulina A. F., Golovanova T. I. 2011. Trichoderma kak agent zashchity rastenii v usloviyakh stressa // «Problemy botaniki Yuzhnoi Sibiri i Mongolii» - XIV Mezhdunarodnaya nauchno-prakticheskaya konferentsiya. P. 415-417.]

Голованова Т. И., Долинская Е. В., Сичкарук Е. А. 2009. Роль грибов рода Trichoderma в повышении урожайности пшеницы и ячменя // Вестник КрасГАУ. № 6. С. 53-58. [Golovanova T. I., Dolinskaya E. V., Sichkaruk E. A. 2009. Rol' gribov roda Trichoderma v povyshenii urozhainosti pshenitsy i yachmenya // Vestnik KrasGAU. № 6. P. 53-58.]

Корнилова Н. А., Филиппов И. Г., Васильева А. В., Горюнова О. Б., Марквичев Н. С. 2011. Влияние продуктов метаболизма грибов рода Trichoderma на физиологические процессы роста и развития растений // Гавриш. № 4. С. 18-21. [Kornilova N. A., Filippov I. G., Vasil'eva A. V., Goryunova O. B., Markvichev N. S. 2011. Vliyanie produktov metabolizma gribov roda Trichoderma na fiziologicheskie protsessy rosta i razvitiya rastenii // Gavrish. № 4. P. 18-21.]

Нам И. Я., Заякин В. В., Шашко Ю. К., Кобозева М. С., Земскова Л. А., Новикова М. А. 2018. Коллекция изолятов возбудителя антракноза люпина Colletotrichum lupini comb. nov. и характеристика их роста in vitro // Бюллетень Брянского отделения Русского ботанического общества. № 2 (14). C. 43-49. [Nam I. Ya., Zayakin V. V., Shashko Yu. K., KobozevaM. S., Zemskova L. A., Novikova M. A. 2018. Kollektsiya izolyatov vozbudi-telya antraknoza lyupina Colletotrichum lupini comb. nov. I kharakteristika ikh rosta in vitro // Byulleten' Bryanskogo otdele-niya Russkogo botanicheskogo obshchestva. № 2 (14). P. 43-49] Кутузова И. А., Григорович И. А., Побединская М. А., Белов Г. Л., Еланский С. Н. 2015. Устойчивость российских и европейских штаммов Colletotrichum coccodes к некоторым фунгицидам // Защита картофеля. № 1. С. 30-34. [KutuzovaI. A., Grigorovich I. A., PobedinskayaM. A., Belov G. L., Elanskii S. N. 2015. Ustoichivost' rossiiskikh i evropeiskikh shtammov Colletotrichum coccodes k nekotorym fungitsidam // Zashchita kartofelya. № 1. P. 30-34.]

Такунов И. П. 1996. Люпин в земледелии России. Брянск: Придесенье. 372 с. [Takunov I. P. 1996. Lyupin v zemledelii Rossii. Bryansk: Pridesen'e. 372 p.]

Тютерев С. Л. 2001. Проблемы устойчивости фитопатогенов к новым фунгицидам // Вестник защиты растений. № 1. С. 3853. [TyuterevS. L. 2001. Problemy ustoichivosti ftopatogenov k novym fungitsidam // Vestnik zashchity rastenii. № 1. P. 38-53.]

Шарипова Д. А., Ветрова М. А., Масютин Я. А., Новиков А. А., Гущин П. А., Винокуров В. А. 2013. Исследование антагонизма различных штаммов грибов рода Trichoderma и грибковых фитопатогенов // Башкирский хим. журн. Т. 20. № 4. С. 8385. [SharipovaD. A., VetrovaM. A., Masyutin Ya. A., NovikovA. A., GushchinP. A., Vinokurov V. A. 2013. Issledovanie antagonizma razlichnykh shtammov gribov roda Trichoderma i gribkovykh ftopatogenov // Bashkirskii khimicheskii zhurn. T. 20. № 4. P. 83-85.]

Atanasova L., Crom S. L., Gruber S., Coulpier F., Seidl-Seiboth V., Kubicek C. P., Druzhinina I. S. 2013. Comparative transcriptomics reveals different strategies of Trichoderma mycoparasitism // BMC Genomics. 14 : 121. P. 1-15.

Benítez T., Rincón A. M., Limón M. C., Codón C. 2004. Biocontrol mechanisms of Trichoderma strains // International microbiology. № 7. Р. 249-260.

Cannon P. F., Damm U., Johnston P. R., Weir B. S. 2012. Colletotrichum - current status and future directions // Studies in Mycology. 73. P. 181-213. DOI: 10.3114/sim0014

Rubio M. B., Hermosa R, Reino J. L., Collado I. G.,Monte E. 2009. Thctfl transcription factor of Trichoderma harzianum is involved in 6-pentyl-2H-pyran-2-one production and antifungal activity // Fungal Genetics and Biology. V. 46. P. 17-27.

Samolski I, de Luis A., Vizcaíno J. A., Monte E., SuárezM. B. 2009. Gene expression analysis of the biocontrol fungus Trichoderma harzianum in the presence of tomato plants, chitin, or glucose using a high-density oligonucleotide microar-ray // BMC Microbiol. 9 : 217. P. 1 -14.

Sharma V., Salwan R, Sharma P. N., Kanwar S. S. 2017. Elucidation of biocontrol mechanisms of Trichoderma harzianum against different plant fungal pathogens: Universal yet host specific response // Int. Journ. of Biol. Macromolecules. V. 95. P. 72-79.

Zeilinger S., Gruber S., Bansal R., Mukherjee P. K. 2016. Secondary metabolism in Trichoderma - Chemistry meets genomics // Fungal Biol. Rev. V. 30 : 2. P. 74-90.

Сведения об авторах

Nam Irina YanGukovna

Sc. D. in Biology, Professor of the Dpt. of Chemistry Bryansk State University named after Acad. I. G. Petrovsky, Bryansk E-mail: iyanam1@yandex.ru

Zayakin Vladimir Vasil'evich

Sc. D. in Biology, Professor of the Dpt. of Chemistry Bryansk State University named after Acad. I. G. Petrovsky, Bryansk E-mail: vladimir.zajackin@yandex.ru

Kobozeva Marina Sergeevna

postgraduate of the Dpt. of Chemistry Bryansk State University named after Acad. I. G. Petrovsky, Bryansk E-mail: bobunovamarina@mail.ru

Нам Ирина ЯнГуковна,

д. б. н., профессор кафедры химии ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского», Брянск E-mail: iyanaml@yandex.ru

Заякин Владимир Васильевич

д. б. н., профессор кафедры химии ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского», Брянск E-mail: vladimir.zajackin@yandex.ru

Кобозева Марина Сергеевна

аспирант кафедры химии

ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского», Брянск E-mail: bobunovamarina@mail.ru