CC BY
39
Бюллетень Брянского отделения РБО, 2018. № 2 (14). С. 43-49.
Bulletin of Bryansk dpt. of RBS, 2018.
N 2 (14). P. 43-49.
БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.95 (470.333)
Коллекция изолятов возбудителя антракноза люпина
COLLETOTRICHUMLUPINI comb. nov. и характеристика их роста IN VITRO
© И. Я. Нам1, В. В. Заякин1, Ю. К. Шашко2, М. С. Кобозева1, Л. А. Земскова1, М. А. Новикова1
I. Ya. Nam1, V. V. Zayakin1, Yu. K. Shashko2, M. S. Kobozeva1, L. A. Zemskova1, M. A. Novikova1
Collection of isolates of an anthracnose of lupine agent Colletotrichum lupini comb. nov. and their growth characteristics in vitro
1 ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского»
241036, Россия, г. Брянск, ул. Бежицкая, д. 14. Тел.: +7 (919) 198-25-81, e-mail: [email protected]
2РУПНПЦ по земледелию НАНБеларуси
222160, Республика Беларусь, г. Жодино, ул. Тимирязева, д. 1. Тел.: +375 (1775) 3 25 68, e-mail: [email protected]
Собрана представительная коллекция из более 60 моноспоровых изолятов возбудителя антракноза люпина с территории разных районов Беларуси, Брянской и Смоленской областей России, с пораженного материала трёх культурных видов люпина и дикорастущего Lupinus polyphyllus Lindl., разных лет сбора (2012-2017 гг.). Изучены некоторые морфо-физиологические характеристики изолятов. По скорости роста выделяются три группы изолятов: большинство имеют среднюю скорость роста, небольшие группы изолятов растут примерно в два раза быстрее или медленнее основной группы. Наибольшее разнообразие по морфо-физиологическим признакам наблюдается среди изолятов, выделенных из поражённого растительного материала ВНИИ люпина (Россия, Брянская область), в котором собрана обширная коллекция сорто-образцов люпина разного географического происхождения и создан искусственный антракнозный инфекционный фон для селекции люпина на устойчивость.
Ключевые слова: антракноз люпина, Colletotrichum lupini, коллекция изолятов, рост in vitro.
Abstract. A representative collection of more than 60 monosporous isolates of Colletotrichum lupini, causing agent for lupin anthracnose disease was created. Isolates were obtained from infected plant material cultivated at different locations in Belarus and the Bryansk and Smolensk regions of Russia in 2012-2017 and they were collected from three agricultural lupin species (Lupinus angustifollius L., L. luteus L., L. albus L.) and wild-growing L. polyphyllus Lindl. The collection was investigated for colony growth characteristics. Most of isolates have middle growth rates, but some groups of isolates have nearly double or half growth rates. Most morphological and growth diversity of isolates was revealed at fields of Russian lupin (Michurinsky, Bryansk region). A great collection of lupin cultivars from different geographic locations is gathered.
Keywords: antraknose of lupine, Colletotrichum lupini, collection of isolates, growth in vitro.
DOI: 10.22281/2307-4353-2018-2-43-49
Введение
Культурные виды люпина являются ценными белковыми кормовыми растениями для Средней полосы России. Их посевные площади сократились многократно в результате массового распространения заболевания антракнозом (Такунов, 1996). Под термином «антракноз» понимается большая группа заболеваний, вызываемых несовершенными грибами нескольких родов, преимущественно рода Colletotrichum, у сельскохозяйственных, декоративных и дикорастущих растений (Cannon et al., 2012). Несмотря на значительное число разночтений, считается, что в странах Средиземноморья и Америки антракноз культурных видов люпина вызывается, главным образом, Colletotrichum lupini (Nirenberg et al., 2002;
Damm et al., 2012), который является родоспецифичным, хотя чаще возбудитель антракноза видоспецифичен по отношению к растениям-хозяевам.
Биоразнообразие возбудителя антракноза люпина на территории России и Беларуси слабо изучено, в литературе имеются только единичные публикации белорусских учёных (Шашко, 2011). Целью данной работы является предварительное описание представительной коллекции изолятов возбудителя антракноза люпина, собранной на территории России и Беларуси по некоторым морфо-физиологическим характеристикам роста на питательной среде.
Материалы и методы
Коллекция изолятов возбудителя антракноза создавалась в 2015-2017 гг. путем высева на питательную среду Чапека материала из участков антракнозного поражения бобов, стеблей и листьев разных видов люпина и последующего выделения моноспоровых культур. Использовался предоставленный сотрудниками ВНИИ люпина поражённый растительный материал, собранный в 2011-2017 гг. с трёх культурных видов люпина на полях ВНИИ люпина (п. Мичуринский, Брянская область); растительный материал, собранный нами в 2014-2017 гг. на полях ВНИИ люпина и в ходе экспедиции в Беларусь и Смоленскую область (дикорастущий многолистный люпин и культурные виды люпина). Кроме того, сотрудники НПЦ по земледелию НАН Беларуси любезно предоставили для работы готовую коллекцию изолятов прошлых лет выделения.
Таким образом, в настоящий момент собрана достаточно представительная коллекция изолятов, как с дикорастущего многолетнего люпина многолистного (Lupinus polyphyllus Lindl.), считающегося основным природным резерватом возбудителя, так и с трёх основных культурных видов люпина (Lupinus angustifollius L., L. luteus L., L. albus L.), возделываемых в России и Беларуси (табл. 1-3). С одного поражённого растительного образца обычно выделяли 2-4 изолята, но в абсолютном большинстве случаев изоляты, выделенные из одного растительного образца, оказывались идентичными как по культуральным признакам, так и по молекулярно-генетическим данным ISSR-анализа. В таких случаях для дальнейшей работы оставляли по одному изоляту с образца. Именно такие изоляты показаны в табл. 1-3. Общее количество первоначально выделенных изолятов значительно больше. Исключением являются изоляты 52.1 и 52.2, а также 4.1м и 4.2м, которые значительно различаются по культуральным и генетическим характеристикам, хотя и были выделены из одного растительного образца. Вероятно, в этих случаях имелась смешанная инфекция.
Таблица 1
Коллекция изолятов, полученных в НПЦ по земледелию (Республика Беларусь, г. Жодино)
№ п. п. |_№ исходный и обозначение_|_Район сбора
Минская область
1. 3ж Березинский
2. 15ж Смолевичский (г. Жодино)
3. 16ж Осиповичский
4. 17ж Джержинский
5. 18ж Столбцовский
Могилёвская область
6. 6ж Горецкий
7. 7ж Горецкий
8. 9ж Белынический
Витебская область
9. 11ж Витебский
10. 12ж Дубровенский
11. 13ж Оршанский
12. 14ж Толочинский
Гродненская область
13. 19ж Кореличский
14. 20ж Дятловский
15. 21ж Новогрудский
_Брестская область_
16 | 23ж | ПруЖанский
Таблица 2
Изоляты С. ЫрШ, выделенные из растительного материала, собранного в разные годы на полях ВНИИ люпина
№ Обозначение Вид люпина, Год сбора поражённого Год
п. п. изолята сорто-образец растительного материала выделения изолята
1. № 3 Люпин узколистный, сорт Радужный 2012 2016
2. № 4 Л. узколистный, сорт Олигарх 2012 2016
3. 47 Л. жёлтый, сорт Престиж 2013 2016
4. 48 Л. белый, сорт Дега 2013 2016
5. 49 Л. белый, сорт Деснянский 2013 2016
6. 52.1 Л. жёлтый, сорт Надежный 2015 2016
7. 52.2 Л. жёлтый, сорт Надежный 2015 2016
8. 53 Л. жёлтый, сорт Новозыбковский 2015 2016
9. 54 Л. белый, сорт Дега 2015 2016
10. 55 Л.узколистный, образец АИФ-15 2015 2016
11. 1.3 Л. узколистный, образец АИФ-14 2014 2015
12. 1.4 Л. узколистный, сорт Снежеть 2014 2015
13. 1м Л. белый, селекционный питомник 2016 2017
14. 2м Л. узколистный в смешанных посевах 2016 2017
15. 3м Л. белый, сорт Дега 2016 2017
16. 4.1м Л. узколистный в смешанных посевах 2016 2017
17. 4.2м Л. узколистный в смешанных посевах 2016 2017
18. 5м Л. жёлтый, селекционный питомник 2016 2017
19. 6м Л. жёлтый, селекционный питомник 2016 2017
20. 7м Л. белый, сорт Дега 2016 2017
21. 17/1 Л. белый 2017 2017
22. 17/2 Л. белый 2017 2017
23. 17/3 Л. белый 2017 2017
24. 17/4 Л. белый 2017 2017
25. 17/5 Л. белый 2017 2017
26. 17/6 Л. белый 2017 2017
27. 17/7 Л. белый 2017 2017
28. 17/8 Л. белый 2017 2017
29. 17/9 Л. белый 2017 2017
Таблица 3
Изоляты С. ЫрШ, выделенные из растительного материала, собранного в 2016 г. в Беларуси и Смоленской области России
№ п. п. Обозначение изолята Вид люпина Место сбора пораженного растительного материала
1. 1Б Люпин многолистный г. Жодино
2. 2Б Л. узколистный Минская область, Смолевичский район, г. Жодино, инфекционный фон
3. 3Б Л. узколистный
4. 4Б Л. узколистный (зеленоукосный)
5. 5Б Л. узколистный
6. 6Б Л. узколистный
7. 8Б Л. многолистный Минская область, Смолевичский район, у г. Жодино, со старого антракнозного фона
8. 9Б Л. многолистный
9. 10Б Л. многолистный Витебская область, Толочинский район
10. 11Б Л. многолистный Минская область, Джержинский район, н. п. Плоское
11. 12Б Л. многолистный Витебская область, Толочинский р-н, н. п. Рыжичи
12. 13Б Л. многолистный Витебская область, Оршанский район, г. Орша
13. 14Б Л. многолистный Витебская область, Дубровенский район
14. 15Б Л. многолистный Витебская область, Дубровенский район
15. 16Б Л. многолистный Витебская область, Дубровенский район
16. 17Б Л. многолистный Витебская область, Оршанский район, н. п. Бороздечи
17. 18Б Л. многолистный Могилёвская область, Горецкий район, н. п. Зубра
18. 19Б Л. многолистный Смоленская область, Рославльский район, г. Рославль
19. 20Б Л. многолистный Смоленская область, Рославльский район, г. Рославль
20. 21Б Л. многолистный Могилёвская область, г. Могилёв, мост через р. Днепр
21. 22Б Л. многолистный Могилёвская область, н. п. Прилесье
Каждую грибную культуру культивировали на свету при комнатной температуре на питательных средах, наиболее часто рекомендуемых для возбудителей антракноза люпина отечественными и зарубежными исследователями: среде Чапека и средах, содержащих картофельный отвар и отвар семян люпина (Гаджиева, 2013; Котова, 2014) в 3-4 биологических повторностях.
По предварительным данным молекулярно-генетического анализа по ITS-областям (внутренние транскрибируемые спейсеры кластеров рибосомальных генов), все изоляты относятся к кластеру (кладе) видов Colletotrichum acutatum, в который входит и C. lupini (в печати). Споровый анализ также подтверждает принадлежность изолятов к роду Colletotrichum.
При изучении скорости роста через определённые промежутки времени измеряли диаметр колоний в двух направлениях и для дальнейших расчётов использовали среднее значение. Отрезками на диаграммах (рис. 1-3) отмечены стандартные ошибки среднего.
Результаты и обсуждение
Таким образом, в настоящее время в коллекции имеется более 60 изолятов возбудителя антракноза из четырёх видов люпина, нескольких различных регионов России и Беларуси, поражавших люпин с 2011 по 2017 гг. При получении изолятов из материала, хранившегося разное время, можно отметить, что по всей видимости, при хранении происходит потеря жизнеспособности спор возбудителя антракноза. Так из 4 образцов 2011 г. не удалось получить ни одного изолята, из 7 образцов 2012 г., несмотря на массированные повторные посевы, удалось получить только два изолята; из образцов 2013 г., тоже только с помощью многократных посевов, удалось получить 3 изолята из четырёх образцов. То есть уже через 3 года подавляющая часть спор теряет жизнеспособность, а через пять лет происходит полная потеря их жизнеспособности. Эти данные согласуются с агротехническими рекомендациями для борьбы с антракнозом - проводить посев семенами, которые хранились не менее 2 лет.
Окраска колоний, плотность и вид воздушного мицелия, другие характеристики колоний варьируют не только в зависимости от среды, но и от условий культивирования, а также количества пассажей после изоляции с растительного материала. Иногда такие изменения могут быть очень резкими. По мере роста и старения культуры вид колоний также сильно меняется. Поскольку мы не имели возможности провести сравнение колоний всех изолятов сразу после выделения, анализ проводили после длительного культивирования в лабораторных условиях и многократного пересева, что привело к частичной стабилизации параметров роста изолятов. У части молодых колоний в период активного роста просматриваются оттенки розового цвета, у остальных - серого, особенно на агаре Чапека. В целом можно отметить, что на среде с картофельным отваром почти всегда окраска темнее, чем на агаре Чапека, а стареющие колонии приобретают тёмно-коричневый или чёрный цвет. Исключение составляют 12ж, 21ж, 11Б, 12Б, 16Б, 1.4, 52.2, 48 и 49 - светлоокрашенные, и 4.2М -бежевая на картофельном агаре и чёрно-коричневая на агаре Чапека. Отличаются от всех образцов: 5.1М - интенсивно красная в период активного роста на обеих средах, а 48 и 49 -жёлто-оранжевые с обратной стороны и светлые с сажистым налетом в виде колец при старении с верхней стороны. То есть разнообразие изолятов по внешним признакам значительно выше среди изолятов с полей ВНИИ люпина.
Как видно из представленных данных, большая часть изолятов за неделю образует колонии диаметром 20-35 мм и только два изолята 12ж и 21ж растут примерно в два раза медленнее, что проиллюстрировано линиями тренда на рисунке для образцов каждой из групп.
На рис. 2 показаны аналогичные данные для изолятов, выделенных из поражённого растительного материала узколистного и дикого многолистного люпинов, собранного в ходе поездки 2016 г. (табл. 3).
Подобно изолятам, представленным на предыдущем рисунке, большая часть вырастает за 6-8 дней до 25-40 мм (линия тренда для изолята 22Б). Изоляты 11Б и 16Б, наоборот, растут почти в два раза быстрее.
Рис. 1. Динамика роста на среде Чапека изолятов возбудителя антракноза из коллекции НПЦ по земледелию (Республика Беларусь, г. Жодино). Отрезками показаны ошибки среднего.
Рис. 2. Динамика роста на среде Чапека изолятов возбудителя антракноза, выделенных из материала, собранного в экспедиции 2016 г.
Наибольшее разнообразие по скорости роста наблюдается в коллекции изолятов, полученных из материала разных видов люпина, собранного на полях ВНИИ люпина (п. Мичуринский, Брянская область), как показано на рис. 3.
48 47 1.4.
52.1 4
49
4.2М
53 1М
52.2 2М ЗМ 5.1М 7М
54 1.3. 4.1М 6М 3
17/9 17/3 17/2 17/6 17/8
Линейная (47) Линейная (49) Линейная (53) Линейная (52.2)
Рис. 3. Динамика роста на среде Чапека изолятов возбудителя антракноза, выделенного из материала ВНИИ люпина (п. Мичуринский, Брянская область).
Большая часть изолятов имеют среднюю скорость роста (20-40 мм за неделю), они сосредоточены между линиями тренда для изолята 47 и изолята 53.
Кроме того, можно выделить образцы с повышенной скоростью роста - это изоляты 52.2, 1.4. и 5.1М, они примерно в два раза опережают основную массу изолятов, как изоляты 11Б и 16Б на рис. 2, и имеют близкую к ним скорость роста (56-70 мм). Наоборот, изоляты 48 и 49 обладают более низкой скоростью роста, как образцы 12ж и 21ж (рис. 1).
На среде с картофельным отваром скорость роста изолятов в целом несколько выше (не существенно), но обнаруженные закономерности сохраняются.
Повышенное разнообразие изолятов из материала ВНИИ люпина, вероятно, связано с наличием в коллекции и селекционных питомниках института образцов люпина разных видов и различного географического происхождения, которые собраны для селекционных целей. С этими образцами могли быть собраны и разнообразные биотипы возбудителя антракноза. Кроме того, для селекционных целей создан и поддерживается антракнозный инфекционный фон. В таких условиях разнообразие возбудителя может определяться не только привезёнными штаммами, но и постоянно поддерживаться и даже развиваться за счёт рекомбинации при парасексуальном процессе, который характерен для несовершенных грибов.
В частности, для рода Colletotrichum наблюдается асексуальная рекомбинация с образованием анастомозов и слиянием ростовых трубок при прорастании спор (Pinto et al., 2012; Roca et al., 2004). Понятно, что даже выделение моноспоровых изолятов не гарантирует отсутствия изменчивости и их стабильности.
Наряду с другими характеристиками скорость роста грибных колоний может влиять на вирулентность изолятов и их конкурентоспособность с другими грибами, в частности с грибами рода Trichoderma, которые могут использоваться для защиты растений.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 16-44-320985.
Список литературы
Анохина В. С., Дебелый Г. А., Конарев П. М. 2012. Люпин: селекция, генетика, эволюция. Минск: Изд. Белорусского гос. ун-та. 271 с. [Anohina V. S., Debelyj G. A., Konarev P. M. 2012. Lyupin: selekciya, genetika, ehvolyuciya. Minsk: Izd. Belorusskogo gos. un-ta. 271 p.]
Такунов И. П. 1996. Люпин в земледелии России. Брянск: Придесенье. 372 c. [Takunov I. P. 1996. Lyupin v zem-ledelii Rossii. Bryansk: Pridesen'e. 372 p.]
Шашко Ю. К., Шашко М. Н., Долгова Е. Л. 2011. Об определении расового состава возбудителя антракноза люпина Colletotrichum lupini comb. nov. Минск: Научно-практический центр НАН Беларуси по земледелию. С. 128-136. [Shashko Yu. K., Shashko M. N., Dolgova E. L. 2011. Ob opredelenii rasovogo sostava vozbuditelya antraknoza lyupina Colletotrichum lupini comb. nov. Minsk: Nauchno-prakticheskij centr NAN Belarusi po zemledeliyu. P. 128-136.]
Cannon P. F., Damm U., Johnston P. R., Weir B. S. 2012. Colletotrichum - current status and future directions // Studies in Mycology. N 73, P. 181-213.
Nirenberg H. I., Feiler U., Hagedorn G. 2002. Description of Colletotrichum lupini comb. nov. in modern terms // Mycologia. N 94 (2). P. 307-320.
Damm U., Cannon P. F., Woudenberg J. H. C., Crous P. W. 2012. The Colletotrichum acutatum species complex // Studies in Mycology. N 73. P. 37-113.
Roca M. G., Davide L. C., Davide L. M., Mendes-Costa M. C., Schwan R., Wheals A. E. 2004. Conidial anastomosis fusion between Colletotrichum spp. // Mycol. Res. Vol. 108. P. 1320-1326.
Pinto J. M. A., Pereira R., Mota S. F., Ishikawa F. H., Souza E. A. 2012. Investigation phenotypic variability in Colletotrichum lindemuthianum population // Phytopatology. N 102 (5). P. 490-497.
Сведения об авторах
Nam Irina YanGukovna
Sc. D. in Biology, Professor of the Dpt. of Chemistry Bryansk State University named after Acad. I. G. Petrovsky, Bryansk E-mail: [email protected]
Zayakin Vladimir Vasil'evich
Sc. D. in Biology, Professor of the Dpt. of Chemistry Bryansk State University named after Acad. I. G. Petrovsky, Bryansk E-mail: [email protected]
Shashko Yury Konstantinovich
Ph. D. in Agricultural Scienses, Science researcher Scientific and practical center of the NAS of Belarus for agriculture, Zhodino E-mail: [email protected]
Kobozeva Marina Sergeevna
postgraduate of the Dpt. of Chemistry Bryansk State University named after Acad. I. G. Petrovsky, Bryansk E-mail: [email protected]
Zemskova Loüta Alexeevna
student of the Natural-Geographical faculty Bryansk State University named after Acad. I. G. Petrovsky, Bryansk E-mail: [email protected]
Novokova Marina Andreevna
student of the Natural-Geographical faculty Bryansk State University named after Acad. I. G. Petrovsky, Bryansk E-mail: [email protected]
Нам Ирина ЯнГуковна,
д. б. н., профессор кафедры химии ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского», Брянск E-mail: [email protected]
Заякин Владимир Васильевич
д. б. н., профессор кафедры химии ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского», Брянск E-mail: [email protected]
Шашко Юрий Константинович
к. с.-х. н., научный сотрудник
РУП НПЦ по земледелию НАН Беларуси, Жодино
E-mail: [email protected]
Кобозева Марина Сергеевна
аспирант кафедры химии
ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского», Брянск E-mail: [email protected]
Земскова Лолита Алексеевна
студентка естественно-географического факультета ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского», Брянск E-mail: [email protected]
Новикова Марина Андреевна
студентка естественно-географического факультета ФГБОУ ВО «Брянский государственный университет имени академика И. Г. Петровского», Брянск E-mail: [email protected]
