CC BY
50УДК 616.594.171.2:556.115:579.8
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ CANDIDA ALBICANS И БАКТЕРИЙ-АССОЦИАНТОВ ПРИ К АН Д ИД О 3 АХ РАЗЛИЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ
Лисовская С.А. (в.н.с.)*, Халдеева Е.В. (зав. лаб.), Глушко Н.И. (с.н.с.)
ФБУН Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, г. Казань, Россия
© Коллектив авторов, 2013
Изучали патогенные свойства (адгезию, диморфизм) 46 штаммов С. albicans, выделенных от больных с различными формами кандидозов. Протестированы штаммы С. albicans, выделенные в микст и моно-культурах. Исследовали взаимодействие С. albicans и бактерий (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa) методами различных условий культивирования в жидких и агаризованных питательных средах. Для изучения влияния бактерий на патогенные свойства штаммов С. albicans в работе использовали экстракты бактерий S. aureus, К. pneumoniae и P. aeruginosa
Установлено, что уровень адгезии и способность клеток к диморфизму у штаммов, выделенных с поверхностей слизистых оболочек, выше, чем у выделенных с кожи и ее придатков. В результате исследования выявили, что отличия в адгезивных свойствах штаммов С. albicans связаны с локализацией микозов. При совместном культивировании штаммов С. albicans с добавлением экстрактов бактерий в течение двух суток возросли патогенные способности штаммов более чем в 2 раза. Таким образом, показана возможность увеличения степени проявления факторов патогенности С. albicans под воздействием продуктов жизнедеятельности бактерий и, как следствие, возможность возникновения более тяжелой формы кандидоза.
Ключевые слова: адгезия, антагонизм, бактериальные ассоциации, кандидоз, Candida albicans, патогенность
INTERACTION OF CANDIDA ALBICANS AND ASSOCIATED BACTERIA IN CANDIDOSIS OF VARIOUS LOCALIZATION
Lisovskaya S.A. (leading scientific collaborator), Khaldeeva E.V. (head of the laboratory), Glushko N.I. (senior scientific collaborator)
Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russia
* Контактное лицо: Лисовская Светлана Анатольевна,
тел.:+7(843)2365659
© Collective of authors, 2013
The virulence attributes of 46 Candida albicans strains isolated from patients with various candidosisforms have been studied. Strains ofC. albicans were isolated from mono - and mixt-cultures. Interaction between C. albicans and bacteria (Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa) was studied employing different liquid and solid media. Influence of associated bacteria using extracts of S. aureus, K. pneumoniae and P. aeruginosa was estimated.
It was established that adhesion and dimorphism of cells from mucosal strains in 1,5-3 times exceed adhesion and dimorphism of cells from skin strains. The obtained results show that differences in adhesive properties ofC. albicans strains are associated with mycosis localization. Cultivation of C. albicans cultures with extracts of bacteria during 2 days increases virulence attributes ofC. albicans in 2-3 times. Thus, it was shown possibility of increasing virulence attributes ofC. albicans by influence of associated bacteria during their collective growth and, so, possibility of more serious form of candidosis.
Key words: adhesion, antagonism, associated bacteria, Candida albicans, candidosis, pathogenity
ВВЕДЕНИЕ
До недавнего времени условно-патогенные микроорганизмы С. albicans в организме человека рассматривали, в основном, как представителей нормобиоты. Однако в последние годы отмечают возрастание числа висцеральных форм кандидоза, особенностью которых является полиморфизм их клинических признаков, а также множество мест локализации С. albicans в одном макроорганизме. Так, у многих больных грибы высевали со слизистых оболочек, кожи, ногтевых валиков, мочи, кала. В своих исследованиях авторы (Сергеев А.Ю. и др., 2001; Chaffin W.L., et al., 1998) подтверждают существование патогенных штаммов грибов С. albicans, способных вызывать кандидозную инфекцию и отличающихся по ряду биохимических и биологических свойств от грибов этого же вида, выделенных от практически здоровых лиц. Основные факторы вирулентности, определяющие патогенность гриба, - это способность клеток гриба к адгезии и диморфизму, что является первоначальным фактором инвазии, приводящей к развитию кандидоза [1, 2].
С. albicans у человека редко выделяют в монокультуре. Как правило, они являются составляющими микробных ассоциаций. Заселяя кожу и слизистые оболочки, грибы и бактерии могут выступать в качестве возбудителей оппортунистических инфекций или провоцировать воспалительные реакции. Известно, что в микробной ассоциации между разными видами складываются сложные и неоднозначные взаимоотношения, в которых тесно переплетаются взаимные влияния участников ассоциаций друг на друга и на макроорганизм. Реброва Р.Н. (1989) полагает, что эти влияния могут осуществляться в следующих основных направлениях: 1) ассоцианты могут изменять биологические свойства, стимулировать или тормозить размножение и развитие основного возбудителя; 2) в условиях новых взаимоотношений между микробами может изменяться их воздействие на макроорганизм как за счет усиления вирулентности возбудителя, так и за счет образования новых
факторов, отягощающих течение болезни; 3) дополнительная сенсибилизация человека микробами, входящими в ассоциацию.
В связи с этим, важным дополнением к установлению патогенности штамма является изучение взаимосвязи основных факторов вирулентности грибов у различных клинических штаммов С. albicans и исследование изменения вирулентной активности in vitro штаммов С. albicans, выделенных из различных анатомических локусов человека, при совместном культивировании их в жидкой и на плотной питательных средах с наиболее часто встречаемыми в микробиологических посевах бактериями, с целью выяснения их роли при различных проявлениях кан-дидоза.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили:
1. 46 штаммов С. albicans, выделенные от пациентов, находящихся на амбулаторном лечении, с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции различной локализации (слизистых оболочек, кожных покровов и ногтевых пластин).
2. Непатогенный музейный штамм N-4 С. albicans, полученный из коллекции музея ЦКВИ (г. Москва) и используемый на производстве при получении антигенных препаратов.
3. Бактериальные клинические штаммы Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa.
Исследовали 48-часовые культуры С. albicans, выращенные на среде Сабуро при 30 °С [3]. Определение адгезивных свойств выделенных штаммов С. albicans проводили на ранее разработанной авторами модели адгезии клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку с и м мо бил из ир о ва н н ы м гемоглобином [4]. Полученную пленку площадью 7 см2 инкубировали при 30 °С с 3 мл суспензии клеток гриба в 0,1М фосфатном буфере в течение двух часов. Начальная оптическая плотность суспензии клеток составляла 0,18-0,21 при длине волны 540 нм. Уровень адгезии определяли по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток, а также прямым подсчетом клеток в суспензии с помощью микроскопа Биолам Р-11 при увеличении 10x20, подсчитывали не менее 10 полей зрения.
Способность гриба к образованию псевдомицелия выявляли с помощью теста на образование герминативных (проростковых, или зародышевых) трубок. Колонию гриба вносили в пробирку с 0,5-1 мл стерильной сыворотки крови или средой №199 и инкубировали при 37 °С в течение 1,5-4 часов. После инкубации каплю содержимого пробирки помещали на предметное стекло и исследовали в световом микроскопе при увеличении 10*40. При микроскопиро-вании отмечали образование дрожжевыми клетками филаментов (зародышевых трубок) - начало формирования истинных гиф [1].
Изучение взаимодействия грибов С. albicans и
бактерий проводили при совместном культивировании в жидкой среде и на поверхности плотной питательной среды и методом перпендикулярных штриховых посевов для выявления отсроченного антагонизма. Инкубировали при 30-35 °С от 20 часов до двух суток на модифицированной среде Сабуро и средах МПА, МПБ.
Эксперименты выполняли в четырех повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
На первоначальном этапе исследований изучали основные факторы вирулентности грибов у клинических штаммов С. albicans. Все штаммы были разделены, с учетом места обнаружения, на три группы: 1) штаммы из зева и ротовой полости, 2) штаммы из влагалища и 3) штаммы, выделенные с поверхности гладкой кожи туловища и конечностей, наружного слухового прохода, а также с ногтей и околоногтевых валиков.
Наибольший процент адгезии отмечали у штаммов, выделенных с поверхностей слизистых оболочек, как ротовой полости, так и влагалища, в то время как штаммы, выделенные с кожи и ее придатков, существенно (в 1,5-3 раза) уступали им в адгезивных свойствах. 11ри этом уровень адгезии изо-лятов С. albicans, обнаруженных на слизистых оболочках зева и ротовой полости, достигал 50%, тогда как штаммы, обнаруженные у больных с диагнозом «кандидоз влагалища» имели уровень адгезии от 18 до 31% (Рис. 1).
60
so
S* 40
к
I 30 I 20
10
о
Слизистые оболочки Слизистые оболочки Ко*ные покровы ротовой полости влагалища
■ Клинически значимые иламмы С Клинически незначимые шгаммы
Рис. 1. Адгезия клинически значимых и клинически незначимых штаммов С. albicans при кандидозах различной локализации
11ри изучении способности формирования ростковых трубок и псевдомицелия показано, что все штаммы С. albicans способны образовывать фила-менты. Однако штаммы, выделенные из зева, активно формировали ростковые трубки уже в течение первого часа постановки пробы, тогда как штаммы, выделенные с кожи, — лишь через 2-2,5 часа. Количество ростковых трубок в 10 полях зрения при увеличении микроскопа 10х40 у штаммов, выделенных из зева, составило 63% от общего количества клеток, а у штаммов, выделенных с кожи, — менее 18%.
27% штаммов С. albicans всех групп, проявляю-
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2013. Т.15. №2
щих наиболее высокий уровень вирулентности, в микробиологических посевах, высевались из микст-биоценоза со значительной бактериальной обсеме-ненностью при инфекциях смешанной бактериально-грибковой этиологии. В связи с этим, была проведена работа по изучению взаимодействия in vitro С. albicans с К. pneumoniae, S. aureus и P. aeruginosa -одними из значимых этиологических факторов дисбактериоза кишечника, хронического пиелонефрита, хронического тонзиллита, хронического среднего отита и т.д.
Исследуя взаимодействие микроорганизмов в жидкой питательной среде, при совместном культивировании, отмечали проявление антагонистической активности К. pneumoniae, S. aureus и P. aeruginosa в отношении штаммов С. albicans, выделенных из зева и кожи и обладающих низкой вирулентностью. Штаммы С. albicans с высокой вирулентностью угнетали рост бактерий уже на вторые сутки.
Изучением взаимодействия бактерий и грибов при их совместном культивировании на поверхности плотной модифицированной среды Сабуро, показано, что монокультуры бактерий К. pneumoniae, S. aureus и P. aeruginosa и С. albicans образовывали газон спустя 20 часов. В течение 48 часов совместной инкубации так же, как и в контрольных пробах, количество грибов возрастало. Были отмечены штаммо-вые различия С. albicans при их совместном росте с бактериями. Так, штаммы С. albicans, выделенные из зева и обладающие высокой вирулентностью, заметно подавляли рост бактерий. 11ри культивировании их с К. pneumoniae они образовывали зоны лизиса, а в отношении S. aureus проявляли выраженную антагонистическую активность, полностью подавляя их рост. Рост штаммов С. albicans, обладающих низкой вирулентностью, при совместном культивировании с бактериями, в течение первых 48 часов был слабым и малоактивным, однако уже на 3-4 сутки штаммы образовывали сплошной газон с бактериями К. pneumoniae, S. aureus, тогда как P. aeruginosa полностью подавляла рост гриба.
Методом перпендикулярных штриховых посевов установлено, что штаммы С. albicans, проявляющие высокую вирулентность, оказывали бакте-риостатическое действие в отношении S. aureus и К. pneumoniae. Штаммы С. albicans с низкой вирулентностью, в отношении S. aureus не оказывали бак-териостатического действия, однако после 24 часов совместного роста штаммы грибов захватывали всю свободную часть агара, на которую были нанесены и, даже, разрастались за ее пределы. Вне зависимости от условий эксперимента, угнетения роста грибов, засеянных перпендикулярно S. aureus, не наблюдали. Однако P. aeruginosa оказывали фунгистатическое действие в отношении штаммов С. albicans с низкой вирулентностью, не давая разрастаться последним.
При первоначальном, микробиологическом посеве проб из патологического материала на модифицированную среду Сабуро часто можно наблюдать
разнообразные взаимоотношения при совместном росте С. albicans и бактерий в культуре. Нередко возникала зона «неприкосновенности» вокруг колонии грибов или бактерий или, наоборот, сплошной «газон». По-видимому, диффундирующие в среду продукты жизнедеятельности микроорганизмов задерживают либо стимулируют развитие друг друга.
Исходя из сказанного, для исследования ингибирующего или стимулирующего влияния бактерий на адгезивные свойства штаммов С. albicans были взяты экстракты бактерий S. aureus, К. pneumoniae и P. aeruginosa различных объемов. Изучение проводили методом «острого опыта». В качестве контроля между группами штаммов был взят непатогенный музейный штамм №4. В результате исследования, при совместном культивировании штаммов С. albicans с экстрактами, выявили стимулирующее влияние бактерий на адгезивные свойства штаммов С. albicans. Эффекта достигали при культивировании штаммов грибов с объемом экстракта 0,05; 0,1; 0,2 мл, причем титр активности для каждого вида экстракта был свой. Так, при добавлении 0,2 мл экстракта S. aureus наблюдали наиболее заметное влияние на адгезивные свойства штамма (Рис. 2), тогда как титр активности экстракта К. pneumoniae составил 0,1 мл.
JS 60
< 0.L~h_ Ъти.кти Ъ Па к ■ Ьь.
0 0.025 0,05 0.1 02 0.4
V экст., мл
■ Штамм, выделенный из зева, с высокой вирулентной активностью
■ Штамм, выделенный из зева, с низкой вирулентной активностью
□ Штамм, выделенный с ком*, с высокой вирулентной активностью
□ Штамм, выделенный с коям. с низкой вирулентной активностью
■ Штамм №4. непатогешый
Рис. 2. Адгезивные свойства штаммов С. albicans при совместном культивировании с экстрактом S. aureus
Адгезивная активность штаммов, выделенных из зева и кожи, с низкой вирулентностью, увеличивалась в почти два раза - с 22+0,1% до 36+0,2% и с 13+0,1% до 25+0,1% соответственно. Увеличение концентрации экстракта P. aeruginosa оказывало выраженное ингибирующее действие на рост штаммов С. albicans и тормозило окончание логарифмической фазы и наступление экспоненциальной фазы размножения.
Совместный рост штаммов С. albicans с бактериальными экстрактами оказал стимулирующее влияние и на другой фактор патогенности - диморфизм. Известно, что С. albicans активно образуют ростковые трубки и псевдомицелий [1]. После инкубации с экстрактом К. pneumoniae в концентрации 0,1 мл в течение 1,5 часа клетки С. albicans начали активно образовыва гь трубки прорастания. Однако в ходе исследования двух основных групп штаммов (выделенных из зева и кожи) отмечали разницу в активности
их формирования. Штаммы, выделенные из зева, образовывали трубки в 4 раза более активно (по скорости и по количеству трубок прорастания в 10 полях зрения), по сравнению со штаммами, выделенными с кожи. Тем не менее, после совместной инкубации всех штаммов С. albicans с экстрактом К. pneumoniae в течение трех пассажей, все штаммы начали активно образовывать псевдомицелий (Рис. 3).
Штамм С. albicans, выделенный с кожи, с низкой вирулентностью
Штамм С. albicans, выделенный из зева, с низкой вирулентностью
&
Г‘
О
0.025
0 05 0.1
V экст.. мл
0.2
0.4
Штамм С. albicans, выделен- Штамм С. albicans, выде-
ный с кожи, с низкой виру- ленный из зева, с низкой
лентностью после совмест- вирулентностью после ной инкубации с экстрактом совместной инкубации с
экстрактом
Рис 3. Формирование псевдомицелия штаммами С. albicans после их совместного культивирования с экстрактом К. pneumoniae (20x20)
Среди факторов патогенности весьма существенное значение имеют ферментативные свойства грибов, в первую очередь — протеолитические. 11ри изучении протеазной активности культуральной жидкости, полученной после инкубации штаммов С. albicans с различными концентрациями экстракта
S. aureus, в отношении иммуноглобулинов G в 0,06 М фосфатном буфере (pH 7,4) наблюдали рост проте-олитической активности с увеличением концентрации экстракта (Рис. 4).
---Штамм, выделенный из зева, о низкой вирулентностью
Рис. 4. Протеолитическая активность внеклеточных ферментов С. albicans после инкубации клеток с экстрактом S. aureus
ВЫВОДЫ
1. Подтверждено предположение о существовании штаммов С. albicans с различным патогенным потенциалом.
2. Выявили наличие выраженных адгезивных свойств у штаммов, способствующих возникновению кандидозной инфекции.
3. Обнаружили, что вирулентность штаммов С. albicans связана не только с местом локализации патогена у больного, но и с видами ассоциантов, участвующих в патогенетическом процессе заболевания.
4. 11ри бактериально-грибковом взаимодействии обретение дрожжеподобными грибами С. albicans более агрессивных свойств связано с интеграцией гриба с другими микроорганизмами.
5. Характер взаимодействия бактерий и грибов С. albicans зависит от количественного соотношения микроорганизмов и степени вирулентности штаммов С. albicans.
6. Показана возможность возрастания факторов патогенности штаммов С. albicans под воздействием продуктов жизнедеятельности бактерий. В то же время, штаммы грибов с высокой вирулентностью обладают бактериостатическим действием.
7. При смешанных инфекциях возможен синергизм С. albicans и бактерий, что доказывает очевидность возникновения более тяжелых форм кандидо-за при микст-инфекциях, когда С. albicans в таких условиях способна стать ведущим этиологическим агентом заболевания.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. - М.: Изд-во МГУ, 2004. - 221 с.
2. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов. - М.: Изд. центр «Академия», 2005. — 304 с.
3. Аравийский Р.А.,. Климко И.Н, Васильева Н.В. Диагностика микозов.- СПб.: Изд.дом СПбМАПО, 2004. — 186 с.
4. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В. Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов// Проблемы медицинской микологии. - 2006. - Т. 8, №3. - С. 36-39.
Поступила в редакцию журнала 25.03.13 Рецензент: Н.П. Блинов
