CC BY
18УДК 616.992
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ НА АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА CANDIDA ALBICANS
Лисовская С.А. (научный сотрудник)*, Глушко Н.И. (ст.н.с.)/ Халдеева Е.В.
(зав. лаб.)/ Фассахов Р.С. (директор), Файзуллина Е.В. (доцент каф.)*, Зинатуллина Г.М. (аспирант)*
ФГУН Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора; *ГОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет М3 и СР РФ, Россия
© Коллектив авторов, 2010
Изучены адгезивные свойства 60 штаммов Candida albicans, полученных от больных с клинически подтвержденными диагнозами «микоз» и «кандидоз кожи», с помощью ранее разработанной модели на основе нитроцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином. Протестированы штаммы С. albicans в монокультурах и выделенные из биоценозов.
Установлено, что адгезия штаммов С. albicans, выделенных из микст-биоценоза с мицелиальными грибами, превышала средний уровень адгезии штаммов в монокультурах почти в два раза. Совместное культивирование штаммов С. albicans, выделенных из монокультуры, с 0,25 мл экстракта из грибов-ассоциантов (Trichophyton rubrum, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum) в течение двух суток увеличивало адгезивные способности данных штаммов более чем в 2 раза. Таким образом, показана возможность увеличения одного из факторов патогенности гриба (адгезии) С. albicans под воздействием продуктов жизнедеятельности грибов-ассоциантов при их совместном росте и, как следствие, возможно предположение о возникновении и развитии более тяжелой формы кандидоза. Установлено, что сложные грибковые ассоциации отягощают клиническое течение кожного процесса, удлиняя сроки лечения пациентов.
Ключевые слова: адгезивные свойства штаммов, грибы-ассоцианты, микст-инфекции, патогенность, Candida albicans
THE EFFECT OF MYCELIAL FUNGI IN THE ADHESION OF CANDIDA ALBICANS
Lisovskaya S.A. (scientific researcher),
Glushko N.I. (senior scientific researcher), Khaldeeva E.V. (head of lab.), Fassakhov R.S. (director), Fayzullina E.V. (associate professor), Zinatullina G.M. (postgraduate student)
FSTR Kazan Research Institute of Epidemiology and
* Контактное лицо: Лисовская Светлана Анатольевна Тел.: + 7 (843) 236-56-59
Microbiology Rusconsumesupervision; SEI НРЕ Kazan State Medical University MPH and SD RF, Russia
© Collective of authors, 2010
The adhesive ability of 60 strains of Candida albicans isolated from patients with mycoses and candidosis have been determined by earlier developed model based on nitrate cellulose film with immobilized hemoglobin. C. albicans strains in form of monocultures and mixt-cultures were used.
It was established that adherence of C. albicans strains isolated from mixt-cultures with mycelialfungi almost twice surpassed adhesive level of strains from monocultures. Cultivation of C. albicans isolated as monocultures with extracts of associated fungus (Trichophyton rubrum, Aspergillus niger and Penicillium chrysogenum) during 2 days increases adhesive ability of strains in 2-3 times. Thus, it was shown possibility of increasing one of virulence attributes of C. albicans by influence of associated fungus during their collective growth and, so, possibility of more serious form of candidosis. It was established that fungal associations lead to more difficult forms and elongation of the disease treating.
Key words: adhesive properties of strains, associated fungi, Candida albicans, mixt-cultures, pathogenity
Инфекционные заболевания, связанные с грибковым поражением органов человека, обычно возникают и развиваются в условиях микробных ассоциаций. Возбудители заболевания, при заражении человека, неизбежно воздействуют на жизнедеятельность уже существующих микробных ассоциаций, а также способствуют созданию новых и вступают в те или иные отношения с микробами-ассоциантами. У многих больных с диагнозом «микоз кожи», особенно при длительном течении заболевания, в посевах выявляют грибы, относящиеся к различным видам, родам, а иногда — и классам. С каждым годом перечень грибов, способных вызывать заболевания у человека, постоянно пополняется. Наиболее распространенными являются микозы, обусловленные дер-матомицетами и дрожжеподобными грибами, реже
— плесневыми грибами. В результате культуральных исследований проб от пациентов, обратившихся в лабораторию микологии КНИИЭМ, показано, что дрожжеподобные грибы являются одними из наиболее часто обнаруживаемых представителей микро-боценоза органов человека.
Частота обнаружения С. albicans при микозах различной локализации за период с 2004 по 2009 гг. составила около 80% от всех обнаруженных видов грибов. Среди основных возбудителей микозов наружных покровов С. albicans обнаружены в посевах в 57% случаев, но в 46% случаев, совместно с С. albicans, выделяли и различные виды мицелиальных грибов. Так, наряду с дерматомицетами (Trichophyton rubrum, Т. mentagrophytes), высевали и плесневые грибы (Aspergillus niger, A. flavus, A. fumigatus; Rhizopus nigricans, Penicillium chysogenum, Penicillium tardum и т.д.). Наиболее часто такую картину наблюдали на фоне длительного течения поражений кожи. Как правило, больные, у которых обнаруживали смешанную микобиоту, страдали более глубокими и тяжелыми формами микозов [1].
Известно, что в микробной ассоциации между разными видами складываются сложные и неодно-
значные взаимоотношения, в которых тесно переплетаются взаимные влияния участников ассоциаций друг на друга и на макроорганизм. Считают, что эти влияния, обусловленные легко экстрагируемыми метаболитами грибов, могут проявляться в следующих основных направлениях:
1) ассоцианты могут изменять биологические свойства, стимулировать или тормозить размножение и развитие основного возбудителя;
2) в условиях новых взаимоотношений между микробами может изменяться их воздействие на макроорганизм как за счет усиления вирулентности возбудителя, так и за счет образования новых факторов, отягощающих течение болезни;
3) происходит дополнительная сенсибилизация человека микробами, входящими в ассоциацию.
П.Н. Кашкин еще в 1950 г. по результатам изучения влияния микробных ассоциаций на дерматоми-цеты установил, что при воздействии фильтратов различных плесневых и дрожжевых грибов на культуру Trichophyton verrucosum (faviforme), у последнего возникают существенные морфологические изменения (пять новых типов роста).
В связи с этим, представляет интерес изучение in vitro влияния метаболитов микромицетов на адгезивные свойства штаммов С. albicans, выделенных от больных с наружными формами микозов, обусловленных монокультурами или микст-биоценозами грибов, а также рассмотреть при этом эффективность лечения дерматитов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании адгезивных свойств использовали 60 штаммов С. albicans, полученных от пациентов, находящихся на амбулаторном лечении с клинически подтвержденным диагнозом «микоз» и «кан-дидоз кожи с высокой степенью обсемененности». Все штаммы подразделили на две основные группы: выделенные в формах микст- и монокультур.
В исследование эффективности лечения было включено 20 пациентов с предварительным диагнозом «микробная экзема» — 6 мужчин и 14 женщин. Средний возраст составил 54,4 года, давность заболевания — 2,7 года.
Больные получали стандартное лечение, включающее ферментные, антигистаминные, рассасывающие и эпителизирующие мази, в соответствии с клинической симптоматикой.
Все пациенты были обследованы (общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимические тесты). В начале лечения и через 4 недели после его окончания проводили культуральное исследование с поверхности очагов на коже. По результатам исследования пациенты были разделены на следующие 3 группы:
- первую - 4 пациента, у которых была выявлена только бактериобиота, в основном, эпидермальный и золотистый стафилококки;
- вторую - 8 человек, имевших кандидозно-
стафилококковую микробиоту;
- третью - 8 пациентов, имевших сложный грибково-бактериальный пейзаж, состоящий из Candida sp., Trichophyton sp., Aspergillus sp. и Staphylococcus aureus.
Материал для исследования брали по периметру наиболее свежих поражений стерильным ватным тампоном с последующим смывом дистиллированной водой. Затем тампон помещали в стерильную пробирку с 2 мл дистиллированной воды. Смывы засевали на агаризованную среду Сабуро в две чашки Петри, причем, в одну чашку добавляли стрептомицин в количестве 70 ед/мл среды. Производили расчет численности клеток С. albicans в смыве с 1 тампона в 1 мл дистиллированной воды. Идентификацию грибов проводили микроскопическими и биохимическими методами, ставили тесты на образование ростковых трубок и хламидоспор, ферментацию углеводов [2].
Исследовали 48-часовые культуры С. albicans, выращенных на среде Сабуро при 30 °С. Определение адгезивных свойств выделенных штаммов С. albicans проводили на ранее разработанной модели адгезии клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку с иммобилизированным гемоглобином [3].
Полученную пленку площадью 7 см2 инкубировали при 30 °С с 3 мл суспензии клеток гриба в ОДМ фосфатном буфере в течение двух часов. Начальная оптическая плотность суспензии клеток составляла 0,18-0,21 при длине волны 540 нм. Определение уровня адгезии проводили по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток, а также прямым подсчетом клеток (в камере Горяева) в суспензии с помощью микроскопа Биолам Р-11 при увеличении 10x20, подсчитывали не менее 10 полей зрения.
Для изучения влияния грибов-ассоциантов на адгезивные свойства штаммов С. albicans в работе использовали стерильные экстракты из неразрушенного мицелия грибов: Т. rubrum (TR), A. niger (AsN), P. chrysogenum (PCh), представляющие собой растворимую полисахаридно-белковую фракцию клеточных стенок грибов, в соответствии с ВФС 42-93-88 [4].
Ингибирующее или стимулирующее действие экстрактов мицелиальных грибов на адгезивную способность клеток оценивали двумя способами [5].
1 вариант. Суточную культуру клеток С. albicans засевали в жидкую питательную среду Сабуро, разлитую в пробирки по 3 мл с разными объемами (0,05; 0,1; 0,25; 0,5 мл) соответствующих экстрактов, и в течение 48 часов ее выращивали при 30 °С, затем определяли уровень адгезии как описано выше. В качестве контроля исследовали культуру клеток С. albicans, выросшую без добавления экстрактов.
2 вариант. Различные объемы экстрактов (0,05; 0,1; 0,25; 0,5 мл) добавляли непосредственно во время опыта в пробирки с суспензией клеток и нитро-целлюлозной пленкой, затем определяли уровень адгезии как описано выше.
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ. 2010. Т. 12. №1
Опыты проводили в четырех повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При исследовании адгезивных свойств штаммов двух групп (штаммы, выделенные в микст- и монокультурах) выявили статистически достоверные отличия между группами. Адгезия штаммов С. albicans, выделенных из микст-биоценоза с мицелиальными грибами, превышала средний уровень адгезии штаммов из монокультур почти в два раза (15,6+0,12)% и (8,3±1,3)%. В некоторых случаях уровень адгезии штаммов С. albicans, выделенных в микст-культурах, возрастал до 26,4% (Рис.1).
25
# 20------------------------------------
си -L "
q 10-------------------------------__--------
<
5------------------------------- 1 ----
0 \-------------------1-------------------
микст-культура N=30 монокультура N=30
Рис. 1. Адгезивные свойства клинически значимых штаммов С. albicans, выделенных от больных с диагнозом «микоз» и «кандидоз кожи», в микст- и моно-культурах (0=5, р<0,05) '
Совместный рост С. albicans и других видов ми-целиальных грибов в культурах из патологического материала на среде Сабуро подтверждает разнообразные взаимоотношения данных грибов.
Нередко можно видеть зону «неприкосновенности» вокруг колонии дерматомицетов, в которую не вступает быстрее растущая плесень. По-видимому, диффундирующие в среду продукты жизнедеятельности дерматомицетов задерживают развитие плесени. Другую картину можно наблюдать у колоний С. albicans, которые почти всегда способны сосуществовать со всеми видами мицелиальных грибов (Рис.2). В некоторых случаях можно предположить, что ряд видов оказывает благоприятное воздействие на С. albicans, способствуя их развитию.
В связи с этим, для исследования ингибирующего или стимулирующего влияния грибов микроми-цетов на адгезивные свойства штаммов С. albicans были взяты экстракты Т. rubrum (TR), A. niger (AsN), P. chrysogenum (PCh) различных объемов. В качестве контроля между группами штаммов был взят непатогенный музейный штамм №4.
Проведенными экспериментами показано ингибирующее действие экстрактов грибов при добавлении в инкубационную среду на стадии непосредственного определения адгезии, то есть проведение опыта вторым способом. В атом случае наблюдали резкое снижение адгезивной активности штаммов по сравнению с контролем. Можно предположить, что в результате быстрого связывания экстракта мицелиальных грибов с гемоглобином, иммобилизованным на нитроцеллюлозную пленку, образуется слой, препятствующий адгезии клеток С. albicans.
Рис. 2. Ассоциации C.albicans с другими микромицетами
В случаях совместного культивирования штаммов С. albicans с экстрактом микромицетов показано наличие стимулирующего действия микромицетов на адгезивные свойства штаммов С. albicans. Однако эффекта достигали только при культивировании штаммов с объемом экстракта 0,1; 0,25 мл, причем при добавлении 0,25 мл экстракта показано наиболее заметное влияние на адгезивные свойства штамма (Рис. 3).
25-
Уэкст.,мл
□ Штаммы C.albicans, выделенные из микст-культур, (n= 10)
□ Штаммы C.albicans, выделенные из монокультуры, (п=10)
□ Непатогенный штамм C.albicans №4
Рис. 3. Адгезия штаммов С. albicans, выросших в присутствии различных объемов экстрактов из микромицетов
Добавление 0,5 мл экстракта микромицетов оказывало выраженное ингибирующее действие на рост С. albicans, тормозило окончание логарифмической фазы размножения. Вероятно, это связано с токсическим эффектом высоких концентраций биологически активных веществ, содержащихся в экстрактах. Культивирование штаммов в присутствии 0,05 мл
экстракта не оказывало влияния ни на рост гриба, ни на адгезивные свойства штамма, что, обусловлено, по-видимому, слишком низкой концентрацией биологически активных метаболитов.
Уровень адгезии у штаммов, выделенных из микст-культур, после культивирования их с экстрактами микромицетов, практически не изменялся, в отличие от других групп штаммов (табл. 1)
У штаммов, выделенных в монокультурах, средний уровень адгезии повысился с 9,5% до 19,6%. Адгезивная способность непатогенного штамма №4 возросла с 1,7% до 5%.
Таблица 1.
Адгезивные свойства штаммов С. albicans, выделенных в микст- и моно-культурах, при добавлении экстрактов микромицетов к культуре дрожжевого организма (п=5, р=0,95)
Штаммы С. albicans Количество штаммов Средний уровень адгезии штаммов без добавления экстрактов из микромицетов к культуре, % Средний уровень адгезии штаммов при совместном культивировании с добавлением экстрактов из микромицетов, %
TR AsN PCh
Микст-культура 10 16,7+0,3 18,1+0,1 21,4+0,2 20,1+0,1
Монокультура 10 9,5+0,5 14,5+0,3 19,6+0,1 20,1+0,1
Непатогенный 1* 1,7+0,1 4,3+0,1 6,1+0,1 5,7+0,3
штамм №4
При оценке эффективности лечения пациентов с микробной экземой выявили значительный разброс результатов в различных группах. Результаты лечения оценивали по степени выраженности клинических симптомов в баллах (табл. 2).
Таблица 2.
Клиническая оценка результатов лечения больных микробной экземой
Оценка в баллах
4
Степень выраженности клинических симптомов
Полное исчезновение клинических симптомов воспалительного ___________________________процесса____________________________
Остаточные явления
Незначительное воспаление в очагах
Сохранение умеренных воспалительных симптомов
Значительная выраженность воспалительных симптомов
*-в 10 повторностях
Было замечено, что добавление экстракта из плесневых грибов (AsN, PCh) оказывает более выраженное стимулирующее действие на адгезивные свойства штаммов С. albicans по сравнению с экстрактом из TR.
На основании проведенных исследований можно сделать вывод о возможном синергизме С. albicans и мицелиальных грибов при грибковых инфекциях кожи. Показана возможность увеличения одного из факторов патогенности гриба С. albicans под влиянием продукции жизнедеятельности других видов грибов при их совместном росте. Увеличение уровня адгезии штаммов С. albicans в микст-биоценозе свидетельствует о повышении патогенного потенциала этих штаммов, что может привести к возникновению более тяжелой формы кандидоза.
Резко выраженные симптомы (зуд, болезненность, мокнутие)
Наибольшую степень выраженности клинической симптоматики через 4 недели после окончания лечения (зуд, более продолжительное сохранение эритемы, отечного компонента) имели пациенты
3 группы, микробный пейзаж которых состоял из грибов родов Candida, Trichophyton, Aspergillus и золотистого стафилококка — (2,9 балла).
У лиц, имевших монокультуру Candida spp., (2 группа) степень выраженности клинических симптомов была значительно ниже и ее оценивали в 1,8 балла. Наименьшую выраженность клинических симптомов (1 балл) имели пациенты первой группы, у которых до лечения была выявлена только бакте-рио биота.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Показано, что сложные грибковые ассоциации отягощают клиническое течение кожного процесса при микробной экземе, способствуя более длительным срокам эпителизации в очагах поражения. По результатам исследования пациентам 2-й и 3-й групп впоследствии была назначена противогрибковая терапия.
Изучение особенностей формирования микст-биоценозов за счет присоединения мицелиальных грибов к Candida albicans, а также взаимного влияния микроорганизмов в ассоциациях позволяет прогнозировать развитие кандидоза и подобрать наиболее эффективные способы лечения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Паршаков В.Р. Усиление адгезивных свойств штаммов С. albicans при микст-инфекции с мицелиальными грибами // Ж. Проблемы мед. микологии. - 2005. - Т.7, №2. -С.86.
2. Аравийский Р.А., Климко Н.Н., Васильева Н.В. Диагностика микозов. - СПб: Издательский дом СПбМАПО, 2004. - 186 с.
3. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В. Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов// Ж. Проблемы медицинской микологии. - 2006. - Т.8, №3. - С.36-39.
4. Глушко Н.И., Лукашков В.М., Шахбазова Е.Н. Грибковые аллергены в КНИИЭМ: двадцатилетний опыт разработки и производственного выпуска //Тез. докл. конференции «Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и лечения инфекционных и аллергических заболеваний». - Казань, 2000. - С.67-72.
5. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. и др. Методы экспериментальной микологии. Справочник. - Киев: «Наукова думка», 1982.- 550 с.
Поступила в редакцию журнала 25.01.2010
Рецензент: С.М. Игнатьева, О.Н. Пинегина
О
2
