Адгезивные свойства штаммов Candida albicans при кандидозах различной локализации Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

удк 616.992

АДГЕЗИВНЫЕ

СВОЙСТВА

ШТАММОВ CANDIDA

ALBICANS ПРИ

КАНДИДОЗАХ

РАЗЛИЧНОЙ

ЛОКАЛИЗАЦИИ

Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В.

ФГУН Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии, г. Казань, РТ, Россия

© Коллектив авторов, 2007

Изучены адгезивные свойства штаммов С. albicans, выделенных от больных с различными формами кандидозов, с помощью ранее разработанной модели на основе нитроцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином. Протестировано 259 штаммов С. albicans, полученных с поверхности кожи и слизистых оболочек. Исследование проводили на 48-часовых культурах С. albicans, выращенных на среде См буро при температуре 30 °С Установлено, что уровень адгезии у штаммов, выделенных с поверхностей слизистых оболочек, в 1,5—3 раза выше, чем у выделенных с кожи и ее придатков. На основании полученных результатов показано, что отличия в адгезивных свойствах штаммов С. albicans связаны как с местом локализации клеток, так и с интенсивностью инфекции. Определение адгезивных свойств штамма помогает охарактеризовать его патогенность и судить о его этиологической роли в данном заболевании, то есть выяснить - является ли он возбудителем заболевания или комменсалом.

Ключевые слова: адгезивные свойства штаммов, кандидозы различной локализации, патогенность, Candida albicans

THE ADHESION OF CANDIDA ALBICANS STRAINS ISOLATED IN CANDIDOSIS OF VARIOUS LOCALIZATION

Lisovskaya S.A., Glushko N.I., Khaldeeva E.V.

Kazan Research Institute of epidemiology and microbiology, Kazan, Russia

© Collective of authors, 2007

Adhesive properties of Candida albicans strains isolated from patients with various candidosisforms were investigated on the earlier developed model based on nitrate cellulose film with immobilized hemoglobin 259 strains of C. albicans isolated from mucosal and skin surface were tested. Experimental conditions are the next: temperature

30 °C, 48 hour grown cultures (Sabouraud media).

It was established that adhesion of mucosal strains in 1,5-3 times exceed adhesion of strains from skin. The obtained results show that differences in adhesive properties of C. albicans strains are associated with mycosis localization and infection intensity. Determination of adhesive properties of strains allows to characterize its pathogenity and suppose its etiological role in the disease, i.e. to determine is it cause of infection or the commensal.

Key words: adhesive properties of strains, blastospores adhesion, Candida albicans, candidosis of various localization, pathogenity

Наиболее часто возбудителем микозов, вызываемых условно-патогенными дрожжеподобными грибами, является Candida albicans. В работах последних лет увеличение частоты кандидозных инфекций связывают с иммунодефицитными состояниями, а также с системными поражениями различной природы [1]. В настоящее время выявлен ряд факторов, предрасполагающих к возникновению кандидоза, но основными являются: предшествующая длительная терапия антибиотиками, заболевания кожи и повреждения слизистых оболочек различной природы. Следует учитывать, что болезнетворные Candida spp. относят к условно-патогенным, потому что в патогенезе кандидозной инфекции решающую роль играют не столько патогенные факторы грибов, сколько состояние макроорганизма. В ряде случаев С. albicans может вызывать поверхностные поражения кожи и слизистых оболочек у пациентов без дефектов иммунитета. Кандидозная инфекция наиболее часто локализуется на слизистых оболочках полости рта и женских половых органов.

В последнее время все чаще появляются подтверждения существования патогенных штаммов С. albicans, способных вызывать кандидозную инфекцию и отличающихся по ряду биохимических и биологических свойств от штаммов этого же вида, выделенных от практически здоровых лиц [1].

В связи с этим представляет интерес изучение различий в свойствах штаммов, обнаруженных при кандидозах и кандидоносительстве у лиц без системных нарушений иммунитета.

Сведения о патогенных свойствах штамма гриба, обнаруженного в организме больного, могут быть полезны врачам лечебного профиля и работникам санитарно-эпидемиологической службы. Однако получить эти данные, основываясь только на результатах культурального исследования, невозможно, так как данным методом нельзя дифференцировать кандидозный процесс и кандидоносительство, поскольку и СяилЫд-комменсалы, и Candida-ттогены морфологически и биохимически неразличимы [2].

Одним из основных факторов вирулентности, определяющих патогенность гриба, является их способность к адгезии. При колонизации организма С. albicans, в отличие от кандидоносительства, имеет место адгезия клеток гриба к клеткам эпителия, что является первым этапом развития инфекции. Были замечены различия в адгезивной способности раз-

личных штаммов Candida, выделенных от здоровых и больных детей, страдающих воспалительными заболеваниями органов дыхания [3]. Следовательно, наличие высокой адгезивной способности, вероятно, может служить одним из критериев патогенности С. albicans.

I (елью нашей работы было изучение адгезивных свойств штаммов С. albicans, выделенных от больных с различными формами кандидозов, с помощью ранее разработанной нами [4] модели на основе нит-роцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использовали штаммы С. albicans, полученные от пациентов, находящихся на амбулаторном лечении, с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции различной локализации (слизистых оболочек, кожных покровов и ногтевых пластин), а также культуры клинически незначимых, по мнению лечащего врача или миколога, штаммов (колонизация, контаминация) и культуры, выделенные от больных, прошедших курс лечения антимико-тическими препаратами. Всего было протестировано 259 штаммов С. albicans.

Материал для исследования брали с помощью стерильного ватного тампона с последующим смывом дистиллированной водой по периметру наиболее свежих поражений. Затем тампон помещали в стерильную пробирку с 2 мл дистиллированной воды. Посев смыва проводили на агаризованную среду Сабуро в две чашки Петри, причем в одну чашку добавляли стрептомицин в количестве 70 ед/мл среды. 11роизводили расчет численности клеток С. albicans в смыве с 1 тампона в 1 мл дистиллированной воды. Идентификацию грибов проводили микроскопическими и биохимическими методами, проводили тесты на ростковые трубки и хламидоспоры, ферментацию углеводов [5].

Исследовали 48-часовые культуры С. albicans, выращенные на среде Сабуро при 30 “С. Адгезивность выделенных штаммов С. albicans определяли на ранее разработанной авторами модели адгезии клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку с иммобилизированным гемоглобином [4].

Полученную пленку площадью 7 см2 инкубировали при 30 °С с 3 мл суспензии клеток гриба в ОДМ фосфатном буфере в течение двух часов. Начальная оптическая плотность суспензии клеток составляла 0,18-0,21 при длине волны 540 нм. Определение уровня адгезии проводили по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток, а также прямым подсчетом клеток в суспензии с помощью микроскопа Виолам Р-11 при увеличении 10x20, подсчитывали не менее 10 полей зрения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведеных исследований было выделено 259 штаммов дрожжеподобных грибов, отвечающих по всем критериям виду С. albicans.

11ри отборе в группу клинически значимых штаммов учитывали клинические проявления заболевания и выявление С. albicans в количестве, превышающем 10! КОЕ/мл (165 штаммов). Группу клинически незначимых составили штаммы С. albicans от пациентов без клинических признаков кандидоза, у которых выявлено менее 102 КОЕ/мл. Всего в данную группу было отнесено 43 штамма.

При изучении выделенных штаммов С. albicans выявили значительные отличия в их адгезивных свойствах, связанные как с локализацией микозов, так и с наличием или отсутствием клинических признаков инфекции.

Тестированием адгезивных свойств клинически значимых штаммов грибов показано, значительное (почти в 3 раза) увеличение уровня адгезии по сравнению с клинически незначимыми штаммами (табл. 1).

Таблица 1

Адгезия клинически значимых и клинически незначимых штаммов Candida albicans

Характеристика штамма Кол-во штаммов Среднее количество C.albicans, К0Е/мл Уровень адгезии, % (среднее значение)

Клинически значимые 165 (4,2+1,8) W 31,2+0,4

Клинически незначимые 43 (1,3+0,2) -10’ 9,4+0,8

Полученными результатами подтверждено повышение уровня адгезии штаммов гриба при развитии кандидоза. В ряде случаев низкий уровень адгезии (менее 7 %) и небольшое число клеток, выделенных при посеве, служили основой для трактовки наличия гриба как кандидоносительство или контаминация.

Следующей задачей было выявление отличий в уровне адгезии штаммов, выделенных при клинически доказанном кандидозе, из различных локусов развития инфекции (рис. 1).

_ 60

— 50

й 40

ф

ч 30

со

£ 20 л»

10 о

а

1

Ротовая полость п=42

Влагалище

п=26

Кожный покров г»=97

Рис. 1. Адгезия штаммов, выделенных при клинически доказанном кандидозе различной локализации.

Для изучения адгезивных свойств все штаммы были разделены, с учетом места обнаружения, на три группы: 1) штаммы из зева и ротовой полости; 2) штаммы из влагалища и 3) выделенные с поверх-

ности гладкой кожи туловища и конечностей, наружного слухового прохода, а также с ногтей и околоног-тевых валиков.

Установлено, что наибольший процент адгезии имел место у штаммов, выделенных с поверхностей слизистых оболочек ротовой полости и влагалища, в то время как штаммы, выделенные с кожи и ее придатков, существенно (в 1,5-3 раза) уступали им в адгезивных свойствах. В то же время уровень адгезии изолятов С. albicans, обнаруженных на слизистых оболочках зева и ротовой полости, достигал 50%, тогда как штаммы, обнаруженные у больных с диагнозами «кандидомикоз влагалища» и «молочница», имели уровень адгезии от 18 до 31%.

Отличия в развитии кандидоза и, как следствие, штаммовые различия в данных анатомических ло-кусах можно объяснить уровнем pH, естественным микробным окружением и факторами местного иммунитета, а также способом питания гриба и доступностью питательных веществ.

Низкий уровень адгезивных свойств штаммов, выделенных с кожи и ее придатков, вероятно, связан с резко отличающимися условиями жизни гриба: низкая влажность, малодоступные субстраты (кератин, коллаген). Здесь главную роль могут играть другие факторы патогенности, например, комплекс внеклеточных протеолитических ферментов, в первую очередь, секретируемых аспарагиновых протеиназ, обладающих способностью разрушать белки кожных покровов [6]. С другой стороны, штаммы, обнаруженные в ротовой полости, постоянно обеспечиваются питательными веществами, но для закрепления в среде, где идет постоянное вымывание, высокая адгезия может служить фактором, способствующим развитию дрожжевых клеток на слизистых оболочках. Таким образом, проведенными исследованиями показано, что адгезивные способности штаммов непосредственно связаны с локализацией микоза.

11ри изучении штаммов С. albicans, выделенных от больных после успешно проведенной терапии (51 штамм), показано снижение уровня адгезии в 2-3 раза, вне зависимости от локализации инфекции (табл. 2).

Таблица 2

Адгезивные свойства штаммов C.albicans, выделенных от больных после успешно проведенной терапии

Локализация Среднее количество (.albicans, КОЕ/мл Средний уровень адгезии, %

штэммов до лечения после лечения до лечения послелеченИЯ

Ротовая полость (42) (4,2+0,5) Т0< (2,8+0,2) -10' 53,1+3,4 14,6+1,2

Влагалище (26) (5,8+0,6) -10' (1,4+0,6) •№ 23,3+1,6 10,5+1,1

Кожный покров (97) (2,6+0,1) -10' менее 10* 17,8+1,3 6,8+0,3

Характер выявленных изменений хорошо согласуется с клиническими проявлениями заболевания и лабораторными посевами. У больных в фазе ремиссии представительство С. albicans в составе микробиоты значительно снижается, приближаясь к количеству менее 103 КОЕ/мл, что характерно для нормобиоты. 11ри этом происходит снижение уровня адгезии штаммов после лечения до уровня клинически незначимых штаммов (рис. 2).

У “ 20

I 15 £ 10

го 3 -о О

X Ф ф О Q.

>ч

□ штаммы клинически незначимые

□ штаммы, вьщеленные от больных, после успешно проведенной терапии

Рис. 2. Адгезия клинически незначимых штаммов и штаммов, выделенных от больных после успешно проведенной терапии

Можно предположить, что проведенная терапия, затрагивая основные жизненные функции грибковой клетки, нарушает при этом процесс синтеза адгези-нов, кроме того, возможно, что после проведения лечения происходит замещение штаммов на менее патогенные.

Однако грань между транзиторным кандидоноси-тельством и кандидозом остается весьма тонкой и, в определенных условиях, в частности, при снижении иммунитета, может быть преодолена. Поскольку в условиях значительного «прессинга» со стороны многочисленных неблагоприятных факторов внешней среды, иммунологические показатели человеческой популяции ухудшаются, санирующее лечение кандидоносителей, особенно - в группах риска при выявлении штаммов с повышенными адгезивными свойствами, представляется полезным [2].

11о определению адгезивных свойств штамма можно сделать предположение о его этиологической роли в данном заболевании, то есть, выяснить является он возбудителем заболевания или комменсалом. Помимо этого, в случае обнаружения при данном заболевании нескольких потенциальных возбудителей как бактериальной, гак и грибковой природы, уровень адгезии штамма гриба позволяет охарактеризовать его патогенность и выбрать правильный подход к лечению данного заболевания.

11о различию адгезивных способностей штаммов, выделенных со слизистой оболочки и с кожи, можно думать о различном механизме развития грибковой инфекции, и, соответственно, предложить дифференцированные подходы к лечению кандидозов различной локализации. Гак, для лечения кандидоза ротовой полости целесообразно применение препаратов, действующих непосредственно на клеточную стенку гриба, блокируя центры адгезии.

— I h

Ротовая полость Влагалище п=7, Кожный покров п=15,п=24 п=11 п=21,п=16

При использовании нитроцеллюлозной матри- любых видов лигандов значительно расширяет диа-

цы с иммобилизованным гемоглобином можно до- пазон разработанного метода, обеспечивая доступ-

стоверно определить уровень адгезии штаммов, в ность проведения эксперимента в условиях, наибо-

полной мере раскрывая их адгезивные свойства. лее приближенных к жизнедеятельности грибов.

Возможность нанесения на предлагаемую матрицу

ЛИТЕРАТУРА

1. Реброва Р.Н. Грибы рода Candida при заболеваниях негрибковой этиологии. — М.: Медицина, 1989. — С. 123.

2. Шевяков М.А. Кандидоз слизистых оболочек пищеварительного тракта (лекция) //Ж. Проблемы медицинской микологии. — 2000. — Т.2, №2 — С. 6-10.

3. Климов Л.А. Адгезивные свойства грибов рода Кандида, выделенных от детей дома ребенка, страдающих воспалительными заболеваниями респираторного тракта. Ряз. мед. ин-r. - Рязань, 1991.-10с.-Ден.ВИНИТИ 27.09.91, №3808-691.

4. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В. Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов//Ж. Проблемы медицинской микологии. — 2006. — Т.8, №3 — С. 36-39.

5. Аравийский Р.А., Климко Н.Н., Васильева Н.В. Диагностика микозов. — СПб.:Издательский дом СПбМАПО, 2004.

— С. 186.

6. Naglik J.R., Challacomber S.J. and Hube В. Candida albicans secreted aspartil proleinases in virulence and pathogehesis II Microb.Molec.Biol.Rew. — 2003. — Vol. 67. — P. 400-428.

Поступила в редакцию журнала 05.02.07 Рецензент: Т.С.Богомолова