Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожжеподобных грибов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.992

ЛАБОРАТОРНАЯ МОДЕЛЬ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ

ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ

ГРИБОВ

Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В.

ФГУН Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии, г. Казань, РТ, Россия

© Коллектив авторов, 2006

Разработана модель для определения in vitro адгезивных свойств штаммов Candida albicans, основанная на взаимодействии адгезинов клеточной стенки с различными белками. В качестве подложки использовали нитроцеллюлозную пленку, на которую иммобилизовали белки. Подобраны оптимальные условия для изучения адгезивных свойств штаммов (время инкубации

— 2 часа, температура - 30 °С, возраст штаммов — 48 часов, иммобилизованный белок - гемоглобин). На модели четко разграничивали патогенные и непатогенные штаммы, достоверно отражая адгезивные свойства грибов — возбудителей кандидоза. Тестированием свойств клинически значимых штаммов показано значительное (почти в 3 раза) увеличение уровня адгезии по сравнению с непатогенными штаммами. Предлагаемая модель с постоянными свойствами носителя обеспечивает возможность объективно сравнивать изучаемые культуры по адгезивным свойствам, что может послужить одним из критериев диагностики кандидоинфекции и прогнозированию микотических осложнений у больных.

Ключевые слова: адгезивные свойства штаммов, адгезия

бластоспор, Candida albicans, кандидоз, патогенность

LABORATORY MODEL FOR DETERMINATION OF YEASTS ADHESIVE PROPERTIES

Lisovskaya S.A., Glushko N.I., Khaldeeva E.V.

Kazan Research Institute of epidemiology and microbiology, Kazan, Russia

© Collective of authors, 2006

The model to determinate Candida albicans strains adhesive properties in vitro has been developed. The proposed model is based on interaction of cell-wall adhesines with various proteins immobilized on the surface of nitratocellulose film. Optimal conditions to estimate the strains adhesive properties are the next: incubation time - 2 hour, temperature - 30 °C, 48 hour grown culture, immobilized protein

— hemoglobin). The model makes possible to separate pathogenic and

apathogenic strains with reliable reflection of adhesive properties of candidosis-caused strains. Test of such strains properties demonstrated considerable (almost in 3 times) increasing of adhesion relatively to apathogenic strains. The proposed model, with constant properties of the base, characterizes adhesion of concrete strains. It allows comparing strains to each other objectively and may be used as one of the diagnosis criterion of candidosis and a forecast of mycotic complication for patients.

Key words: adhesive properties of strains, blastospores adhesion, Candida albicans, candidosis, pathogenity

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время поверхностные микозы, вызванные дрожжевыми грибами, являются наиболее распространенной формой грибковых инфекций, что связано с увеличением числа иммунокомпроме-тированных пациентов. Среди всех грибов наибольшее значение в клинической общетерапевтической практике имеют дрожжеподобные грибы рода Candida в связи с их широким распространением и способностью в определенных условиях проявлять свой патогенный потенциал. Колонизация организма С. albicans, в отличие от кандидоносительства, обусловлена адгезией клеток гриба к эпителию, где основную роль выполняют адгезины клеточной стенки. Адгезины С. albicans представлены ман-нопротеинами клеточной стенки и осуществляют специфическое и неспецифическое связывание [1, 2]. Описано связывание гликопротеинов не только с макромолекулами основных мембран внеклеточного матрикса, а также белками плазмы крови [2, 3], но и со многими пластиками. О различиях в адгезивной способности штаммов Candida сообщали разные авторы [4-6]. В связи с этим актуально определение адгезивных свойств гриба. В настоящее время исследователи продолжают разрабатывать модели адгезии клеток С. albicans. Наиболее распространенными стали модели адгезии к различным твердым, преимущественно полимерным [7], поверхностям, а также к буккальным эпителиоцитам как отражающим специфическое связывание [6, 8, 9]. Но ни одна модель в настоящее время не является совершенно адекватной и удобной для исследования большого количества штаммов гриба. Так, модель адгезии на твердой поверхности достаточно неудобна в применении и нанесении на нее лигандов. На такой поверхности адгезию можно определить лишь визуально. Модель же, основанная на буккальных эпителиоци-тах, зависит от состояния макроорганизма. Обладая чувствительностью к различным экзогенным и эндогенным воздействиям, буккальные эпителиоциты подвергаются функциональным изменениям при различных нарушениях локального и системного гомеостаза. Их рецепторный аппарат подвергается воздействию протеаз и гликозидаз в секрете ротовой полости, влияющих на поверхностные структуры эпителиальных клеток [8].

Цель нашей работы — разработка новой, более удобной, модели для определения адгезивных

свойств дрожжеподобных грибов и изучение адгезивных свойств штаммов, выделенных от больных с различными формами кандидоза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

При создании модели использовали следующие штаммы С. albicans: непатогенный музейный №4, полученный из коллекции музея ЦНИКВИ (Москва), - отрицательный контроль и штамм №228, выделенный от больной с клинически подтвержденным диагнозом (системный кандидоз кожи и слизистых оболочек) (Казань), — положительный контроль.

Материалом для исследований служили также двухсуточные культуры различных штаммов С. albicans, выделенных от 16 больных с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции с различных мест локализации (слизистые оболочки и кожные покровы), а также культуры клинически не значимых, по мнению лечащего врача или миколога, штаммов (контаминация) и культуры, выделенные от больных, прошедших курс лечения антимикотическими препаратами. Все штаммы выращивали на стандартной среде Сабуро при 30 °С.

Нитроцеллюлозную пленку типа коллоксилин (фирмы «Pharmacia», Швеция) применяли в качестве носителя для новой модели. В качестве лигандов использовали белки, входящие в состав макроорганизма: человеческий сывороточный альбумин, бычий сывороточный альбумин, иммуноглобулин А, гемоглобин, коллаген (производство ИЭМ им. Гамалеи).

В процессе приготовления нитроцеллюлозной пленки в качестве растворителей использовали бутилацетат и толуол [9]. Иммобилизацию осуществляли с помощью 25% глутарового альдегида. Иммобилизацию белков проводили двумя способами: 1) внутрь пленки (0,05 г белка разводили в буферном растворе и добавляли к растворенной нитроцеллюлозе); 2) на поверхность пленки (нитроцеллюлозную пленку помещали в растворенный белок). Полученную пленку площадью 7 см2 инкубировали в 3 мл суспензии клеток гриба. Количество адгезировавшихся клеток определяли по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток и подсчетом клеток — не менее 10 в поле зрения микроскопа Био-лам Р-11, увеличение 10x20.

Полученные результаты сопоставляли с данными, полученными с помощью модели, основанной на буккальных эпителиоцитах, по методу Колдмана и Гедзеля (1984) в модификации А.Н. Маянского [6,8], и оценивали процент прочно адгезированных бластоспор, оставшихся на эпителиоцитах после центрифугирования. Использовали эпителиоциты, полученные от пяти здоровых доноров.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучением связывания клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку, приготовленную с помощью глутарового альдегида в отсутствие белков в реакционной смеси, показано, что начальная оптическая плотность суспензии клеток практически сохранялась после инкубации пленки, отклонения были незначительны - менее 0,03%, то есть неспецифическое связывание не происходило. Поэтому в дальнейших опытах на нитроцеллюлозной пленке с иммобилизованными белками неспецифическое связывание не учитывали.

При специфическом связывании всех изучаемых белков при совместной иммобилизации их с глутаро-вым альдегидом внутри пленки, после инкубации на поверхности пленки адгезировалось около 10% клеток патогенного штамма и около 0,2% клеток непатогенного штамма. Можно предположить, что клетки С. albicans не могут проникнуть внутрь пленки, а количество белка на поверхности недостаточно для адгезии клеток гриба.

В связи с этим в последующих экспериментах использовали нитроцеллюлозную пленку с поверхностно иммобилизованными белками. С целью достижения наиболее эффективного связывания изучали влияние различных веществ на адгезию клеток гриба (табл. 1).

Таблица 1.

Адгезия клеток гриба к различным белкам при их

поверхностной иммобилизации (п=5; р=0,95)

Иммобилизованный белок Количество адгезированных клеток С albicans патогенного штамма, % Количество адгезированных клеток С albicans непатогенного штамма, %

Человеческий сывороточный альбумин 28,0± 0,4 0,5 ±0,2

Бычий сывороточный альбумин 33,9± 0,8 0,7 ±0,5

Гемоглобин 59,9± 0,7 1,4±0,4

Иммуноглобулин А 23,4± 0,8 0,5±0,2

Коллаген 35,7 ±0,3 0,7±0,4

Поверхностная иммобилизация белка с помощью глутарового альдегида делает его более доступным для связывания с рецепторами С. albicans. Установлено, что наилучшая адгезия (59,4%) имела место на пленке с иммобилизованным гемоглобином, что значительно выше, чем для ЧСА, Б С А, иммуноглобулина А, коллагена. Полученные данные согласуются с данными литературы о способности гемоглобина усиливать процесс адгезии гриба [3].

Вместе с этим осуществляли подбор оптимальных условий для проведения адгезии. Изучено влияние возраста штамма на адгезию клеток (Рис. 1), температуры инкубации пленок (Рис. 2) и времени инкубации (Рис. 3).

Адгезия. %

Время, сутки

Рис. 1. Влияние возраста штамма на адгезию клеток С. albicans.

Адгезия, %

80 -|

70--------------------------------------------

60--------------------------------------------I

50--------------------------1 -----------

40---------------------------

30---------------------------

20--------

10-------”П----------------- -----------

о -I-----ИИ----------,------------------,----- -

15 30 37

Температура инкубации, °С

Рис* 2* Влияние температуры инкубации на эффективность адгезии клеток С. albicans.

Адгезия,

Время инкубации, часы

Рис. 3. Влияние времени инкубации на адгезию клеток С. albicans

При наблюдении 1-4 суточных культур штаммов №4 и №228 установлено, что в течение 48 часов они подходят к началу стационарной фазы, когда все биохимические процессы достигают своего пика. Так же выявлена зависимость интенсивности адгезии от температуры — самые высокие значения адгезии получали при 37 °С. Однако для дальнейших исследований выбрана температура 30 "С, которая является оптимальной для всех видов штаммов (патогенных и непатогенных), адгезия при этом происходит также эффективно и достигает 80% от максимальных значений. Увеличение времени инкубации приводит к увеличению процента адгезированных клеток. Однако при микроскопических исследованиях наблюдали деление клеток и образование ростковых трубок после 2 часов инкубации. В связи с этим все основные опыты проводили в течение 2 часов. При Этом доказано, что адгезивные свойства клеток штаммов С. albicans изменяются при проведении не более четырех пассажей на искусственной среде.

Таким образом, нами были подобраны оптималь-

ные условия для проведения процесса адгезии 48 часовой культуры С. albicans к гемоглобину, иммобилизованному на поверхности нитроцеллюлозной пленки.

Чтобы оценить адекватность данной модели, исследованы адгезивные свойства тех же штаммов на буккальных эпителиоцитах. Процент адгезии клеток штамма №228 составил от 18,9 до 81,2, а у непатогенного штамма №4 — от 0,3 до 10,2, тогда как на нашей модели эти значения составляют 59,9±0,7 — для патогенного и 1,4±0,4 — для непатогенного штаммов. Таким образом, для обеих моделей наблюдали сходные закономерности по адгезии патогенных и непатогенных штаммов. В то же время наблюдаемый разброс значений обусловлен свойствами самих эпителиоцитов, так как они зависят от состояния макроорганизма. Данную модель невозможно стандартизовать в отличие от модели нитроцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином.

Тестированием адгезивных свойств клеток клинически значимых штаммов грибов показано, значительное (почти в 3 раза) увеличение уровня адгезии по сравнению с клинически незначимыми штаммами и штаммами, выделенными от больных без признаков кандидоза, прошедших курс лечения антимико-тическими препаратами (табл. 2).

Следует отметить, что с помощью разработанной модели удается оценить адгезивные свойства штаммов грибов, являющихся возбудителями кандидоза и штаммов, выделенных от лиц без клинического проявления кандидоза (кандидоносительство). Из полученных данных следует, что статистически достоверные различия у штаммов, выделенных со слизистой оболочки ротовой полости и кожи, видимо, обусловлены условиями местообитания штаммов. Можно предположить, что повышение степени адгезии для штаммов, выделенных со слизистой оболочки ротовой полости, связано с более агрессивной средой обитания и необходимостью поддержания жизнеспособности клетки [2,8].

Таблица 2.

Уровень адгезии клеток С albicans при различных

формах кандидоза

Локализация С albicans Кол-во штаммов Адгезия клинически значимых штаммов, % Адгезия клеток клинически незначимых штаммов, % Адгезия клеток штаммов после лечения,%

•В ротовой полости 10 53,1 ±4,2 15,4±2,5 14,6±1,3

•На кожном покрове 6 17,8±2,1 4,2±0,6 6,8±0,3

ВЫВОДЫ

1) Разработанная модель адгезии клеток С. albicans на нитроцеллюлозную пленку с иммобилизованным гемоглобином помогает охарактеризовать патогенные свойства клинических штаммов гриба; работа с пленкой отличается удобством в из-

готовлении и применении (возможность разрезать, хранить до месяца, контролировать адгезию путем микроскопирования, а также наносить на пленку любые виды лигандов).

2) Нитроцеллюлозная пленка отличается ста-

бильностью, что позволяет проводить исследование большого количества штаммов в идентичных условиях, тем самым, делая возможной стандартизацию предлагаемого метода определения адгезивных свойств разных штаммов С. albicans.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. — М.: Изд-во МГУ, 2004. — 221с.

2. Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. - М.: «Триада-X», 2000.- 472 с.

3. Yan S., Rodrigues R.G., Cahn-Hidalgo D., Walsh T.J Hemoglobin induces binding of several extracellular matrix proteins to Candida albicans. Identification of a common receptor for fibronectin, fibrinogen, and laminin// J. Biol. Chem.- 1998.-Vol. 273, №10,- P.5638-44.

4. Климов Л.А. Адгезивные свойства грибов рода кандида, выделенных от детей дома ребенка, страдающих воспалительными заболеваниями респираторного тракта. Ряз. мед. ин-т. — Рязань, 1991.-10с.-Деп. ВИНИТИ

27.09.91,№3808-691.

5. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. - СПб.: «Наука», 1995.- 600 с. ( С. 535-542).

6. МаянскийА.Н., Воробьева О.И., Малышева Э.Ф., Малышев Ю.В. Взаимоотношения между естественной колонизацией и адгезией бактерий к буккальному эпителию у человека //Ж. микробиологии.-1987.- №2.- С.18-20.

7. Williams D.W., Waters M.G., Potts A.I. A novel technique for assessment of adherence of Candida albicans to solid surface// Clin. Pathol.-1998.-Vol. 51, №3-4,- P.161-172.

8. Абаджиди M.A., Махрова T.B., Маянская И.В. и др. Буккальные эпителиоциты как инструмент клинико-лабораторных исследований//Нижегородский мед.журнал. -2003. -№3-4.- С. 105-110.

9. Inbert-Bernard С., Valentin A., Reynes J. etal. Adherence aux cellules epitheliales buccales de souches de Candida albicans isolees chez des patients VIH+: correlation, avecele serotype, la: sensibilite au flaconazole et la virulence// Pathol. Biol.-1994.-Vol.42, №6,- P.567-573.

10. Медянцева Э.П., Будников Б.К., Бабкина С. С. Ферментный электрод на основе иммобилизованной холинэстеразы для определения потенциальных загразнителей окружающей среды// Журн. аналит. химии. — 1990. — Т.45, № 7. — С. 1386-1389.

Поступила в редакцию журнала 25.07.06

Рецензент: Т. С. Богомолова

3) Предлагаемая нами модель обеспечивает быстрое дифференцирование патогенных и непатогенных штаммов по проявляемому ими уровню адгезии к белкам (в частности, гемоглобину).

4) Результаты исследования могут послужить одним из критериев диагностики кандидоинфекции и прогнозирования микотических осложнений у больных с иммунодефицитом.