CC BY
29УДК 582.282.23:611.311:616.594.171.2: 616.313-002
АНАЛИЗ ВИРУЛЕНТНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ CANDIDA ALBICANS, ВЫДЕЛЕННЫХ СО СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ЯЗЫКА У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ КАНДИДОЗНЫМ ГЛОССИТОМ
12Лисовская С.А. (в.н.с.)*, 1Халдеева Е.В. (зав. лаб.), 3Измайлова Г.Р. (врач-стоматолог), 4Мухамеджанова Л.Р. (профессор кафедры)
1 Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань; 2 Казанский государственный медицинский университет, Казань; 3 Стоматологическая клиника ООО «ВИЛЬДАН», Казань; 4 Чувашский государственный университет им. И.Н.Ульянова, Чебоксары, Россия
©Коллектив авторов, 2018
Изучен микробный пейзаж поверхности языка. У пациентов с диагнозом «хронический кандидозный глоссит», помимо бактериальной микробиоты, основное место занимали грибы Candida albicans. Причем у лиц с наиболее выраженной естественной складчатостью языка высевались C. parapsilosis и C. tropicalis совместно с C. аlbicans. Проведен анализ вирулентной активности клинических штаммов C. аlbicans, который осуществляли на 48 часовых культурах грибов, выращенных на среде Сабуро при температуре 30 оС. В исследуемой группе показатели адгезивной активности составили в среднем 26%, тогда как в группе сравнения - 15%. Для определения способности штаммов образовывать биопленки изучали степень связывания кристаллического фиолетового последними в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах. Способность образовывать биопленки была обнаружена у 100% клинических штаммов.
Ключевые слова: Candida albicans, биопленки, адгезия бласто-спор, патогенность, кандидоз
ANALYSIS OF VIRULENT ACTIVITY OF CANDIDA ALBICANS STRAINS ISOLATED FROM THE MUCOUS MEMBRANE OF THE TONGUE IN PATIENTS WITH CHRONIC CANDIDAL GLOSSITIS
1,2Lisovskaya S.A. (leading scientific collaborator), 1Khaldeeva E.V. (head of the laboratory), 3Izmailova G.R. (dentist), 4Mukhamedzhanova L.R. (professor of the department)
'Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Kazan; 2Kazan State Medical University, Kazan; 3Dental Clinic LLC "VILDAN", Kazan; 4 Chuvash State University, Cheboksary, Russia
©Collective of authors, 2018
The microbial landscape of the surface of the tongue has been studied. In patients with the diagnose of chronic candidal glossitis, in addition to
Контактное лицо: Лисовская Светлана Анатольевна e-mail: [email protected]
bacterial microbiota, the main place was occupied by C. albicans fungi. In patients with the most pronounced natural folding of the tongue, C. parapsilosis and C. tropicalis, together with C. albicans, were isolated. The virulent activity of C. albicans strains was studied, which was carried out on 48 hour cultures of fungi grown on a Sabouraud medium at a temperature of 30° C. In the study group, the indices of adhesive activity averaged 26%, while in the comparison group - 15%. To determine the ability of strains to form biofilms, the degree of yeasts binding of crystalline violet in sterile 96-well polystyrene plates was studied. The ability to form biofilms was found in 100% of clinical strains.
Key words: Candida albicans, blastospores adhesion, adhesive properties of strains, pathogenecity, candidiasis
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы клиницисты отмечают тенденцию к увеличению распространенности заболеваний полости рта, в частности кандидозного глоссита. Последний отличается длительным течением с периодическими обострениями, что может привести к хроническому процессу [1]. Наиболее частыми причинами развития кандидозного глоссита являются использование ортопедических конструкций и соматические заболевания, создающие благоприятный фон для его развития (болезни кроветворных органов, эндокринные дисфункции и т.д.). Грибы рода Candida могут вызывать характерные изменения на слизистой оболочке поверхности языка. Часто при хроническом канди-дозном глоссите на языке появляются изменения рельефа, а в гистопатологических срезах обнаруживают инфильтрацию слизистой оболочки псевдомицелием гриба. У некоторых пациентов значительно удлиняются и кератинизируются сосочки языка, углубляя тем самым межсосочковые пространства. Считают, что изменения в ротовой полости могут быть предикторами развивающегося системного кандидоза (с поражением пищевода, кишечника, бронхов, легких). Зачастую пациенты испытывают значительные трудности при гигиеническом уходе за ротовой полостью, что способствует усиленному накоплению зубного налета и, следовательно, повышению степени бактериальной и грибковой обсеменённости биотопов рта [2].
Наиболее значимым агентом кандидозного глоссита являются грибы Candida albicans. Однако в последнее время многие клиницисты отмечают рост канди-доза, обусловленного и другими видами грибов этого рода [3]. Огромную роль в патогенезе кандидоза играют факторы патогенности самого гриба. Например, адгезия является одним из основных факторов, определяющих поведение микроорганизмов в биоценозах, и она же устанавливает способность их перехода к паразитическому образу существования. Известно, что колонизация организма Candida spp., в отличие от кан-диданосительства, обусловлена адгезией клеток гриба к эпителию. Способность гриба образовывать псевдомицелий - фактор инвазии клеток в ткани макроорганизма. Кроме того, C. albicans являются главными грибковыми агентами, способными образовывать биопленки. Грибковые биопленки не только более резистентны к антимикробным агентам, чем отдельные планктонные клетки, но и способны противостоять иммунным защитным механизмам хозяина [4, 5].
Цель настоящего исследования - оценка частоты встречаемости и степени патогенности штаммов C. albicans как основного участника микробного пейзажа слизистой оболочки дорсальной поверхности языка пациентов с хроническим кандидозным глосситом.
Í--
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании приняли участие 32 пациента (24 женщины и 8 мужчин) в возрасте 38-62 лет (исследуемая группа), обратившиеся с целью получения специализированной стоматологической помощи по поводу заболеваний языка. У всех больных был выявлен хронический кандидозный глоссит (у 10 - атрофическая форма, у 22 - гиперпластическая форма). Диагноз верифицирован на основании данных клинического осмотра с использованием световой оптики (бинокулярная лупа), люминоскопического исследования (система Oral ID), бактериологического и микологического исследований. Забор материала осуществляли в условиях амбулаторного стоматологического кабинета (на диагностическом этапе до назначения лечения) стерильными ватными тампонами с дорсальной поверхности языка при достаточном раскрытии естественных складок рельефа и межсосочковых пространств. Тампон помещали в транспортную среду и в течение 2 часов доставляли в микологическую лабораторию Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии. Идентификацию грибов и бактерий проводили микроскопическими и биохимическими методами. В работе применяли селективные хромогенные среды «CandiSelect 4» (Bio-Rad) и основанные на исследовании ауксанограммы коммерческие тест-системы «Auxacolor 2» (Bio-Rad).
Использовали клинические штаммы C. albicans и непатогенный музейный штамм №4 из коллекции музея ЦКВИ (г. Москва) как возможный отрицательный контроль. Изучали 48-часовые культуры C. albicans, выращенные на среде Сабуро при температуре 30 оС [6].
Группа сравнения (сопоставимого гендерно-воз-растного состава) была представлена 30 пациентами, не отягощёнными заболеваниями языка, обратившимися с целью плановой санации ротовой полости.
Определение адгезивных свойств выделенных штаммов C. albicans проводили на ранее разработанной авторами модели адгезии клеток гриба на нитро-целлюлозную пленку с иммобилизированным гемоглобином [7]. Установление уровня адгезии осуществляли по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток, а также прямым подсчетом клеток в суспензии с помощью микроскопа Био-лам Р-11 при увеличении 10х20, подсчитывали не менее 10 полей зрения.
Способность гриба к образованию псевдомицелия выявляли с помощью теста на образование герминативных (проростковых, или зародышевых) трубок. Колонию гриба вносили в пробирку с 0,5-1 мл средой №199 и инкубировали при 37 оС в течение 0,5-3 часов. После инкубации каплю содержимого пробирки помещали на предметное стекло и исследовали под световым микроскопом при увеличении 10х40. При микро-скопировании отмечали образование дрожжевыми клетками филаментов (зародышевых трубок) - предшественников истинных гиф.
Формирование биопленок грибов C. albicans выполняли по методу Ramage et al. (2001). Культуру грибов засевали в жидкую среду Сабуро и инкубировали в орбитальном шейкере (180 об/мин.) при 30 оС в течение 24 часов. Затем культуру промывали два раза стерильным фосфатным буфером и ресуспендиро-
вали в жидкой среде Сабуро с конечной плотностью 1,0-106 клеток/мл. Суспензию клеток в количестве 100 мкл вносили в 96-луночные плоскодонные полистироловые микропанели и инкубировали в течение 48 часов при 37 оС. Степень или количество формирования биопленок оценивали колориметрическим способом. Оптическую плотность регистрировали на ридере с вертикальным лучом света с использованием светофильтра 620 нм [5].
Статистическую обработку проводили с помощью программного обеспечения Prisma для биомедицинских исследований.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выявили, что у пациентов группы сравнения основными представителями микробного пейзажа дорсальной поверхности языка были бактерии Streptococcus spp. и Staphylococcus epidermidis. Однако в 33% случаев в микробиологических посевах обнаруживали грибы C. albicans в количестве <103 КОЕ/мл. У больных с диагнозом «хронический кандидозный глоссит», помимо бактериальной микробиоты, основное место занимали представители грибов рода Candida: C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis (Рис. 1). Однако C. albicans занимали лидирующее место среди других видов по встречаемости у пациентов с диагнозом «хронический кандидозный глоссит» (87% - в моно- и миксткультуре совместно с другими видами Candida spp.). Отметим, что у больных с наиболее выраженной естественной складчатостью языка высевались C. parapsilosis и C. tropicalis, в восьми случаях - совместно с C. albicans, тогда как у лиц с относительно ровным рельефом дорсальной поверхности выявляли только C. albicans.
Рис. 1. Частота встречаемости Candida spp. в микробиологических посевах от группы больных с хроническим кандидозным глосситом.
Мы не наблюдали каких-либо особенностей люми-носкопической картины в зависимости от различий в микробном пейзаже: во всех случаях отмечали очаги гашения люминесценции в виде темных пятен серо-болотного цвета, у пациентов с выраженной складчатостью - «глубокие» тени по периферии складок, что указывает на вовлечение в воспалительный процесс перипликальных тканей.
Поскольку C. albicans были основными представителями микотической инфекции и обнаруживались при различной клинической картине грибкового поражения, нами были проведены исследования патогенного потенциала данных штаммов. Результаты изучения клинических штаммов C. albicans показали отличия в степени патогенности среди клинических штаммов двух групп.
Так, в исследуемой группе показатели адгезивной активности составили в среднем 26%, тогда как в группе сравнения - 15%. Максимальный уровень адгезии изолятов C. albicans, выделеных от больных, достигал 36%, тогда как штаммы, изолированные от пациентов в отсутствии клинических проявлений, имели уровень адгезии от 12,6% до 18% (табл. 1). Таким образом, уровень адгезивной активности штаммов, выявленных от лиц с диагнозом «кандидозный глоссит», в 1,5-2 раза превышал уровень адгезии штаммов, выделенных у пациентов группы сравнения.
Таблица 1
Адгезивная активность штаммов C. albicans исследуемой
группы, выделенных от больных с клинически доказанном хроническим кандидозным глосситом, и группы сравнения.
Группа штаммов Количество штаммов Адгезивная активность штаммов С. albicans, (%)
Исследуемая 32 26±5,3(18-36)
Сравнения 30 15±1,5 (12,6-18)
Контроль 1* 3,1±0,01 (3,0-3,14)
Примечание: * - контроль (отрицательный), непатогенный музейный штамм №4 из коллекции музея ЦКВИ (г. Москва), в 10 повторах, различия в средних значениях между группами и контролем достоверны, р<0,05
Изучение способности формирования ростковых трубок и псевдомицелия клетками гриба показало, что все штаммы C.albicans способны образовывать фила-менты. Однако три штамма, выделенные от больных с гиперпластической формой кандидозного глоссита, более активно формировали ростковые трубки уже в течение первого часа постановки пробы, тогда как штаммы, изолированные от пациентов группы сравнения, - лишь через 2-2,5 часа. Максимальное количество ростковых трубок в 10 полях зрения при увеличении 10х40 под микроскопом, после часа инкубации, у штаммов, выявленных от пациентов, составило 67% от общего количества клеток, тогда как у штаммов, выделенных от лиц группы сравнения, - менее 9%.
Согласно литературным источникам, процесс адгезии клеток на субстрат не всегда приводит к образованию биопленки, хотя и является начальной стадией в цикле ее формирования, а переход клеток грибов от планктонного существования к биопленочному, предположительно, инициируется сигналами, поступающими из окружающей среды, и здесь, возможно, играет важную роль длительная иммуносупрессия, соматическая патология, нерациональное применение антимикробных и гормональных препаратов, различные виды имплантов и протезов [6].
В связи с этим следующей задачей была оценка степени формирования биопленок данными штаммами.
Во время исследования установлено, что все штаммы C. albicans, включая штаммы группы сравнения, формируют биопленку. Однако замечено, что для штаммов, выделеных от пациентов с хроническим кан-дидозным глосситом, характерно повышенное пленко-образование, по сравнению со штаммами, изолиро-
ванными от лиц группы сравнения (средние значения пленкообразования составили 0,164 и 0,087 оптических единиц соответственно) (табл. 2).
Таблица 2
Пленкообразование клиническими штаммами C. albicans,
выделенными от пациентов двух групп
Локализация штамма Штаммы С. albicans, выделенные от больных с клинически доказанном хроническим кандидозным глосситом Штаммы С. albicans, выделенные от пациентов, не отягощенных заболеваниями языка, обратившимися с целью плановой санации ротовой полости
N Количество сформированной биопленки N Количество сформированной биопленки
Слизистая оболочка поверхности языка 32 0,164 + 1,2 (0,3680,154) 30 0,087 + 0,002 (0,0640,098)
Примечание: Даны значения 063] (за вычетом фона) поглащения красителя в лунках микропанели.
Максимальные значения для исследуемой группы составили 0,368 оптических единиц, а для группы сравнения - 0,098. В то же время в изучаемой группе выявили штаммы, количественные значения пленкообразования которых не привышали 0,154 оптических единиц.
ВЫВОДЫ
Анализ вирулентной активности штаммов, выделенных из двух групп, показал, что наличие выраженных адгезивных свойств, активное формирование псевдомицелия и повышенное пленкообразование были характерны для штаммов, изолированных от больных с диагнозом «хронический кандидозный глоссит». Причем высокие значения адгезивных свойств и гифообразования указывают, вероятно, на развитие острого патологического процесса. В то же время высокая степень пленкообразования была характерна для штаммов, выявленных от группы больных с хронической формой поверхностного кандидоза.
Кроме того, микробный пейзаж дорсальной поверхности языка у пациентов с хроническими формами кандидоза отличался разнообразием за счет представителей микобиоты, причем наиболее выраженным - при складчатости рельефа. Диагноз, поставленный только на основании клинических признаков, следует подтверждать результатами микроскопических и культуральных исследований. Особый интерес также представляет дальнейшее изучение механизмов формирования биопленки, локализованной в межсосочко-вых пространствах и складках языка как особой экологической ниши кандидозной биоты.
Полученные сведения могут быть использованы при составлении алгоритмов назначения препаратов антимикотического действия, дифференцированных в зависимости рельефа дорсальной поверхности языка.
ЛИТЕРАТУРА
1. Шумский А.В., Железняк В.А. Кандидоз полости рта. Монография. Самара, 2008: 4-8 [Shumskij A.V., Zpeleznyak V.A. Kandidoz polosti rta. Monografiya. Samara, 2008: 4-8 (In Russ)].
2. Казеко Л.А., Александрова Л.Л., Довнар А.Г. Грибковые инфекции ротовой полости (обзор лекций). Медицинский журнал. 2014; 2: 15-22 [Kazeko L.A., Aleksandrova L.L., Dovnar A.G. Gribkovye infekcii rotovoj polosti (obzor lekcij). Medicinskij zhurnal. 2014; 2: 15-22 (In Russ)].
3. Климко Н.Н., Козлова Я.И., Хостелиди С.Н. и др. Распростроненность тяжелых и хроничексих микотических заболеваний в Российской Федерации по модели LIFE program. Проблемы медицинской микологии. 2014; 16 (1): 3-8 [Klimko N.N., Kozlova YA.I., Hostelidi S.N. i dr. Rasprostronennost' tyazhelyh i hronicheksih mikoticheskih zabolevanij v Rossijskoj
Federacii po modeli LIFE program. Problemy medicinskoj mikologii. 2014; 16 (1): 3-8 (In Russ)].
4. Lisovskaya S., Khaldeeva E., Salmakova A., Kulikov S. Evaluation of the Influence of Antifungal Drugs on Growth of Candida albicans in the Biofilm. BioNanoScience. 2016; 6 (4): 588-590.
5. Межевикина Г.С., Дармограй. В.Н., Морозова С.И., Савельева Н.А. Современные аспекты этиологии и патогенеза кан-дидоза слизистой оболочки полости рта. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2012; 3: 152-157 [Mezhevikina G.S., Darmograj. V.N., Morozova S.I., Savel'eva N.A. Sovremennye aspekty ehtiologii i patogeneza kandidoza slizistoj obolochki polosti rta. Rossijskij mediko-biologicheskij vestnik imeni akademika I.P. Pavlova. 2012; 3: 152-157 (In Russ)].
6. Аравийский Р.А., Климко Н.Н., Васильева Н.В. Диагностика микозов. СПб.: Издательский дом СПбМАПО, 2004: 186 с. [Aravijskij R.A., Klimko N.N., Vasil'eva N.V. Diagnostika mikozov. SPb.: Izdatel'skij dom SPb-MAPO, 2004: 186 s. (In Russ)].
7. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В. Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожже-подобных грибов. Проблемы медицинской микологии. 2006; 8 (3): 36-39 [Lisovskaya S.A., Glushko N.I., Haldeeva E.V Laboratornaya model' dlya opredeleniya adgezivnyh svojstv drozhzhepodobnyh gribov. Problemy medicinskoj mikologii. 2006; 8 (3): 36-39 (In Russ)].
Поступила в редакцию журнала 13.08.2018 Рецензент: Т.С. Богомолова
