CC BY
29УДК 579.61:576.52:615.282:615.015.0
ОЦЕНКА СПОСОБНОСТИ К ФОРМИРОВАНИЮ БИОПЛЕНОК КЛИНИЧЕСКИМИ ШТАММАМИ CANDIDA ALBICANS, ВЫДЕЛЕННЫМИ ПРИ ОСТРЫХ И ХРОНИЧЕСКИХ ФОРМАХ КАНДИДОЗА КОЖИ И СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК
Лисовская С.А. (в.н.с.)*, Халдеева Е.В. (зав. лаб.), Глушко Н.И. (с.н.с.), Паршаков В.Р. (н.с.)
Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань, Россия
©Коллектив авторов, 2017
Изучены адгезивная активность и способность к образованию биопленок 38 штаммов C. аШсапз, выделенных от пациентов с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции различной локализации (слизистых оболочек и кожных покровов). Исследование проводили на 48 часовых культурах C. albicans, выращенных на среде Сабуро при температуре 30 оС. Наибольший уровень адгезии отмечали у штаммов, выделенных при остром течении кандидоза. Максимальный средний уровень способности к образованию биопленок выявили у штаммов, полученных от больных с хроническими формами кандидоза. При этом способность образовывать биопленки была обнаружена у 100% клинических штаммов.
Ключевые слова: адгезия бластоспор, биопленки, кандидоз, Candida albicans, патогенность
EVALUATION OF BIOFILM FORMATION ABILITY OF CLINICAL STRAINS OF CANDIDA ALBICANS ISOLATED AT THE ACUTE AND CHRONIC FORMS OF CANDIDOSIS OF THE SKIN AND MUCOUS MEMBRANES
Lisovskaya S.A. (leading scientific collaborator), Khaldeeva E.V. (head of the laboratory), Glushko N.I. (senior scientific collaborator), Parshakov V.R. (scientific collaborator)
Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Kazan, Russia
©Collective of authors, 2017
Adhesive properties and ability of biofilm formation of 38 strains of C. albicans isolated from patients with clinical signs of superficial Candida infection of different localization (mucous and skin) have been investigated. The study was conducted on 48 hour cultures of C. albicans grown on Sabouraud medium at a temperature of 30 oC.
The highest level of adhesion was observed for strains isolated from patients with acute course of candidosis. The maximum average level of ability of biofilm formation was observed in strains isolated from patients with chronic forms of candidosis. The ability to form biofilms was detected in 100% of clinical strains.
Key words: biofilm, blastospores adhesion, Candida albicans, candidosis, pathogenicity
* Контактное лицо: Лисовская Светлана Анатольевна, Тел.: +7(843)2365659
ВВЕДЕНИЕ
Инфекции, вызванные грибами рода Candida, стали существенной проблемой в течение последних лет. За минувшие десятилетия в мире заметно возросло количество пациентов, страдающих как острыми, так и хроническими, рецидивирующими формами кан-дидоза. При этом C. albicans занимают ведущее место среди возбудителей поверхностных хронических форм заболеваний. На долю кандидозов приходится до 37% всех инфекционных болезней и до 86% - грибковых заболеваний человека [1, 2]. Согласно данным Глобального фонда по борьбе с грибковыми инфекциями (Global Action Fund for Fungal Infections, GAFFI), в мире ежегодно инвазивный кандидоз (ИК) поражает
более 750 000 человек и у 350 000 - является причиной
смерти [3]. В России заболеваемость кандидемией составляет 8,29 случаев на 100 000 населения [4].
При анализе результатов микробиологических посевов биоматериала от больных, обратившихся в лабораторию микологии Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии в период с 2010 по 2015 гг., выявили, что C. albicans занимали первое место среди патогенов, наиболее часто выделяемых с различных анатомических локусов пациентов, находящихся на амбулаторном лечении.
До недавнего времени считали системные грибковые инфекции, в основном, уделом иммунокомпроме-тированных лиц, но теперь их значительно чаще регистрируют у осложненных больных терапевтического и хирургического профилей, что связано с рядом факторов. По данным научной литературы [5; Хазанова В.В. и др. // Стоматология. - 1996. - Т. 75, №2], основными факторами развития хронических и системных форм кандидоза являются: длительная иммуносупрессия, соматическая патология, нерациональное применение антибактериальных и гормональных препаратов, различные виды имплантатов и протезов. Кроме того, все больше появляется доказательств, что огромную роль в патогенезе кандидоза играют факторы патогенности самого гриба. Известно, что C. albicans являются главными грибковыми агентами, способными образовывать биопленки на медицинских приборах (мочевые и кровяные катетеры), искусственных протезах (в том числе стоматологических), а также на поверхности эпителиальных клеток восприимчивого организма [Хазанова В.В. и др. // Стоматология. - 1996. - Т. 75, №2]. В настоящее время считают, что более 65% всех инфекционных заболеваний обусловлены микроорганизмами, существующими в форме биоплёнок. Биоплёнки - это высокоупорядоченные сообщества, формирующиеся на биологических или искусственных поверхностях в результате адгезии, роста и размножения микроорганизмов и образования полисахаридного внеклеточного матрикса.
Способность C. albicans образовывать биопленки клинически значима, поскольку связь клеток гриба с биопленкой значительно повышает их устойчивость к традиционным противогрибковым препаратам. Грибковые биопленки не только более резистентны к антимикробным агентам, чем отдельные планктонные клетки, но и способны противостоять иммунным защитным механизмам хозяина [6, 7].
Цель нашей работы - определение способности к формированию биопленок клинических штаммов C.
ПРОБЛЕМЫ МЕДИЦИНСКОЙ МИКОЛОГИИ, 2017, Т.19, №1
albicans, выделенных от больных с различными формами кандидозов, обратившихся в лабораторию микологии Казанского НИИ эпидемиологии и микробиологии в период с 2010 по 2015 гг.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования: 38 штаммов C. albicans, выделенных от пациентов с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции различной локализации (слизистых оболочек и кожных покровов), находящихся на амбулаторном лечении, как с хроническим течением заболевания, так и в острый период.
Культуры C. albicans выращивали на стандартном бульоне Сабуро при 30 оС в течение 48 часов.
Грибы идентифицировали микроскопическими и биохимическими методами, проводили тест на образование ростковых трубок. В работе использовали селективные хромогенные среды «CandiSelect 4» (Bio-Rad) и коммерческие тест-системы, основанные на исследовании ауксанограммы: «Auxacolor 2» (Bio-Rad).
Адгезивные свойства выделенных штаммов C. albicans изучали на ранее разработанной авторами модели адгезии клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку с иммобилизированным гемоглобином [8]. Полученную пленку площадью 7 см2 инкубировали при температуре 30 оС с 3 мл суспензии клеток гриба в 0,1М фосфатном буфере в течение двух часов. Уровень адгезии определяли по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток, а также прямым подсчетом клеток в суспензии с помощью микроскопа Микмед-6 при увеличении х200, подсчитывали не менее 10 полей зрения.
Формирование биопленок C. albicans проводили по методу Ramage et al. (2001). Культуру грибов засевали в жидкую среду Сабуро и инкубировали в орбитальном шейкере (180 об/мин.) при 30 оС в течение 24 часов. Затем культуру промывали два раза стерильным фосфатным буфером и ресуспендировали в жидкой среде Сабуро с конечной плотностью 1,0-106 клеток/ мл. Суспензию клеток в количестве 100 мкл вносили в 96-луночные плоскодонные полистироловые микропанели и инкубировали в течение 48 часов при 37 оС. После образования биопленки планшеты промывали три раза стерильным фосфатным буфером. Степень или количество формирования биопленок оценивали колориметрическим способом. В лунки со сформированными биопленками добавляли 125 мкл водного раствора 1% кристаллического фиолетового и инкубировали 20 мин при 37 оС. После удаления избытка красителя и промывки лунок добавляли 95% этанол в количестве 125 мкл, оптическую плотность регистрировали на ридере с вертикальным лучом света с использованием светофильтра 620 нм.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе исследования были сформированы две основные группы: 1) 22 штамма C. albicans, выделенные от больных поверхностной формой кандидоза в острый период, и 2) 16 штаммов C. albicans, выделенные от больных хронической формой поверхностного кандидоза.
При отборе в первую группу учитывали клинические проявления заболевания, диагноз и выявление C. albicans в количестве, превышающем 103 КОЕ/ мл. Вторую группу составили штаммы от пациентов с
хронической формой поверхностного кандидоза как в отсутствие ярко выраженных клинических признаков заболевания, так и в период обострения, у которых выявлено от 102 до103 КОЕ/мл C. albicans.
Все группы штаммов были разделены с учетом места обнаружения: А) штаммы из зева и ротовой полости, В) выделенные с поверхности гладкой кожи туловища и конечностей.
Способность C. albicans к адгезии - это не только один из основных вирулентных факторов, определяющих патогенность гриба, являющийся первоначальным этапом развития инфекции, но и начальная стадия в цикле формирования биопленки. Поэтому первым этапом исследования стало изучение адгезивной активности штаммов.
Наибольший процент адгезии отмечали у штаммов, выделенных с поверхностей слизистых оболочек ротовой полости, в обеих группах, в то время как штаммы, полученные с кожи и ее придатков, существенно (в 1,53 раза) уступали им в адгезии. Уровень адгезии изоля-тов C. albicans, обнаруженных на слизистых оболочках зева и ротовой полости, достигал 50%, тогда как штаммы, выявленные у больных с диагнозом «кандидоз кожи», имели уровень адгезии от 8 до 18% (Рис. 1).
Рис. 1. Уровень адгезии штаммов C. albicans первой (от больных поверхностной формой кандидоза в острый период) и второй (от пациентов с хронической формой кандидоза) групп, выделенных при клинически доказанном кандидозе различной локализации
При анализе адгезивной активности отмечали различия в уровне адгезии между двумя основными группами штаммов. Процент адгезии у штаммов, выделенных от больных с диагнозом «кандидоз», в 1,5-2 раза превышал таковой у штаммов, полученных от больных с хроническим течением заболевания, причем независимо от места локализации штаммов. Так, средний уровень адгезии штаммов, выделенных со слизистой оболочки зева, составил (45,2±0,12)% и (27,1±1,1)% соответственно (Рис. 1).
Низкий уровень адгезивных свойств штаммов, выявленных с кожи и придатков, вероятно, связан с резко отличающимися условиями жизни гриба: низкая влажность, малодоступные субстраты (кератин, коллаген). Вероятно, здесь главную роль играют другие факторы патогенности, например, комплекс внеклеточных про-теолитических ферментов, в первую очередь, секрети-руемых аспарагиновых протеиназ, обладающих способностью разрушать белки кожных покровов [Naglik J.R., Challacomber S.J. // Miccrob. Molec. Biol. Rew. - 2003. - Vol. 67]. С другой стороны, штаммы, обнаруженные в ротовой полости, постоянно обеспечиваются питательными веществами, но для закрепления в среде, где идет постоянное вымывание, высокая способность к адгезии может являться необходимым условием.
Несмотря на то, что адгезия является начальной стадией в цикле формирования биопленки, эта фиксация на первом этапе обратима и не всегда приводит к образованию биопленки. А вот переход клеток грибов от планктонного существования к биопленочному, предположительно, инициируется сигналами, поступающими из окружающей среды, и здесь, возможно, играют важную роль длительная иммуносупрессия, соматическая патология, нерациональное применение антимикробных и гормональных препаратов, различные виды имплантов и протезов [9].
Следующей задачей была оценка степени формирования биопленок данными клиническими штаммами.
Установлено, что все штаммы C. albicans формируют биопленку. Однако замечено, что для штаммов, выделенных со слизистой оболочки зева, менее характерно пленкообразование, по сравнению со штаммами, полученными с кожи (средние значения пленко-образования составили 0,077 и 0,143 соответственно) (Рис. 2).
Таблица 1.
Пленкообразование клиническими штаммами C. albicans, выделенными из разных анатомических локусов больных с диагнозом «поверхностный кандидоз»
Локализация штамма Штаммы C. albicans, выделенные от больных поверхностной формой кандидоза в острый период Штаммы C. albicans, выделенные от больных хронической формой поверхностного кандидоза
N Количество сформированной биопленки N Количество сформированной биопленки
Слизистая оболочка зева и ротовой полости 12 0,057 + 0,009 (0,0480,065) 7 0,082 + 0,06 (0,0540,142)
Поверхность гладкой кожи 10 0,076 + 0,02 (0,0560,092) 9 0,182 + 0,16 (0,0790,344)
Рис. 2. Пленкообразование клиническими штаммами C. albicans различной локализации
При этом штаммы, выявленные из ротовой полости больных с хронической формой кандидоза, отличались в 1,5 раза большим количеством пленкообра-зования, по сравнению со штаммами, выделенными из ротовой полости пациентов в острый период заболевания. Для штаммов, выделенных с кожи лиц с хронической формой кандидоза кожи, установлены наибольшие значения в пленкообразовании (табл. 1).
Примечание: Даны значения D620 (за вычетом фона) поглощения красителя в лунках микропанели.
ВЫВОДЫ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1) Отсутствует прямая корреляция между адгезивной активностью штамма и пленкообразованием Candida spp.
2) Наличие выраженных адгезивных свойств штаммов служит показателем развития острого патологического процесса.
3) Высокая степень пленкообразования характерна для штаммов, выделенных от больных с хронической формой поверхностного кандидоза. Однако в этой группе отмечали и штаммы с низкой степенью пленко-образования, что подтверждает факт возможных морфологических изменений клеток грибов от дрожже-подобных форм к гифам, что обеспечивает инвазию (распространение) возбудителя в ткани и, как следствие, обострение инфекционного процесса.
Таким образом, в клинической практике при хронических инфекциях следует помнить о том, что низкий уровень обсемененности организма грибами при хронических формах заболевания может быть показателем развития биопленочных структур, являющейся одной из основных стратегий выживания микроорганизма даже в организме человека. А это предполагает как необходимость более полного изучения свойств самих штаммов, так и изменение подходов к лечению заболеваний, ассоциированных с биопленками.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Achkar J.M., Fries B.C. Candida infections of the genitourinary tract // Clin. Microbiol. Rev. - 2010. - Vol. 23. - P. 253-273.
2. Kumari V., Banerjee T., Kumar P., et al. Emergence of nonalbicans Candida among candidal vulvovaginitis cases and study of their potential virulence factors, from a tertiary care center, North India // Indian J. Pathol. Microbiol. - 2013. - Vol. 56, №2. - P. 144-147. doi: 10.4103/0377-4929.118703.
3. Васильева Н.В., Выборнова И.В., Рауш Е.Р., Богомолова Т.С. Определение чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к флуконазолу с использованием дисков различных производителей //Проблемы медицинской микологии.
- 2016. - Т. 18, №2. - С. 8-11.
Климко Н.Н. Распространенность тяжелых и хронических микотических заболеваний в Российской Федерации по модели LIFE program// Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т. 16, №1. - С. 3-8.
Афиногенова А.Г., Даровская Е.Н. Микробные биоплёнки ран: состояние вопроса // Травматология и ортопедия России. - 2011. - №3. - С. 119-125.
Шабашова Н.В. Особенности локального иммунного ответа и его дефекты при орофарингеальном кандидозе (обзор) // Проблемы медицинской микологии. - 2010. - Т. 12, №4. - С. 3- 9.
Пинегина О.Н., Рауш Е.Р., Васильева Н.В. Определение чувствительности к антимикотикам Candida spp. в составе биопленок // Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т. 16, №4. - С. 46-48.
Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В. Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожжеподоб-ных грибов // Проблемы медицинской микологии. - 2006. - Т. 8, №3. - С. 36-39.
Межевикина Г.С., Дармограй. В.Н, Морозова С.И., Савельева Н.А. Современные аспекты этиологии и патогенеза кандидоза слизистой оболочки полости рта // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова.
- 2012 г. - №3 - С. 152-157. Поступила в редакцию журнала 18.01.17 Рецензент: Е.Р. Рауш
