CC BY
832018 т 8 № 3 крымскии журнал экспериментальной и клиническои медицины
УДК 619:576.807.9
ОЦЕНКА ИНТЕНСИВНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЁНОК МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ГРИБАМИ РОДА CANDIDA
Сачивкина Н. П.1, Ленченко Е. М.2, Хайтович А. Б.3
'Кафедра микробиологии и вирусологии, Медицинский институт ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», 117198, ул. Миклухо-Маклая, 6, Москва, Россия.
2Кафедра ветеринарной медицины, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств», 125080, Волоколамское шоссе, 11, Москва, Россия.
3Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия.
Для корреспонденции: Сачивкина Надежда Павловна, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии, Медицинский институт ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», e-mail: [email protected]
For correspondence: Nadezda P. Sachivkina, PhD, Associate Professor, Department of Microbiology and Virology, Medical Institute of "People Friendship University of Russia (RUDN University)", e-mail: [email protected]
Information about authors:
Sachivkina N. P. http://orcid.org/0000-0003-1100-929X Lenchenko E. M. http://orcid.org/0000-0003-2576-2020 Khaitovich A.B. http://orcid.org/0000-0001-9126-1182
РЕЗЮМЕ
В современном мире одной из самых серьёзных проблем в лечении хронических инфекций является создание микроорганизмами биоплёнок, в которых они становятся трудно доступными для подавляющего большинства антимикробных средств. В настоящей работе исследованы структурно-функциональные особенности трёх штаммов Candida albicans, Candida tropicalis и Candida africana на способность образовывать биоплёнки. Апробирован надёжный диагностический алгоритм для количественной оценки кандидозных биоплёнок и оставшихся планктонных клеток. Определена зависимость процесса биоплёнкообразования и количества оставшихся нативных клеток от времени культивирования. Проведены морфологические исследования процесса формирования биоплёнок без нарушения архитектоники с применением сканирующего электронного микроскопа и клеточного голографического микроскопа.
Ключевые слова: Candida albicans; Candida tropicalis; Candida africana; микроскопические грибы; матрикс; сканирующая электронная микроскопия; клеточная голографическая микроскопия.
THE INTENSITY OF BIOFILM FORMATION BY MICROSCOPIC FUNGI OF THE GENUS CANDIDA
Sachivkina N. P.1, Lenchenko E. M.2, Khaitovich A. B.3
1Medical Institute of RUDN University, Moscow, Russia 2Moscow State University of Food Production, Moscow, Russia
3Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
In the modern world, one of the most serious problems in treatment of chronic infections is creation of biofilms by microorganisms, since in these films they become inaccessible for a vast majority of antimicrobial agents. In this work, we investigated the structural and functional features of three strains of Candida albicans, Candida tropicalis and Candida africana concerning their ability to form biofilms. We tested a reliable diagnostic algorithm for quantitative evaluation of Candida albicans biofilms and remaining planktonic cells. The dependence of the process of biofilm formation and the number of remaining native cells on the cultivation time was established. Morphological studies of biofilm formation process were carried out without disturbing the architectonics with use of the scanning electron microscope and the cell holographic microscope.
Key words: Candida albicans; Candida tropicalis; Candida africana; microscopic fungi; matrix; scanning electron microscopy; cell holographic microscopy.
Для продуктивного существования в организме человека и животных микроорганизмы применяют разнообразные стратегии. Одним из таких приемов служит особая структурно-
функциональная организация микробов в сообществах, которые получили название биопленок. Биопленка (англ. biofilm) - «слой клеток микроорганизмов, прикрепленных к поверхно-
сти и друг к другу, заключенных в биополимерный матрикс» [1]. Существуют другие, более подробные толкования. Например, биопленка -это «постоянно обновляющееся сообщество микробов, закрепившихся на биогенном или абиогенном субстратах и окруженных внеклеточным полимерным матриксом, который предохраняет их от вредных воздействий и является одним из факторов межклеточного взаимодействия» [2]. Другие исследователи считают, что биопленки микроорганизмов - это «образованные оседлыми микробами сообщества, характеризующиеся тем, что клетки, прикрепленные к субстрату или к поверхности друг друга, погружены в матрикс, образованный внеклеточными полимерными субстанциями; при этом микробы проявляют особый фенотип, зависящий от фазы роста и экспрессии генов» [3]. Но все ныне существующие определения сходны в том, что биопленка содержит три обязательных компонента: (1) основу или платформу, на которой локализуется биопленка, (2) совокупность микроорганизмов и (3) внеклеточный матрикс, объединяющий микроорганизмы в единую структуру (рис.1).
С появлением термина «биопленка» в учении об инфекции началось переосмысление механизмов возникновения, развития инфекционного процесса, а также практических подходов к профилактике и лечению. По всей видимости, связано это с тем, что микроорганизмы в составе биопленки имеют существенные отличия от тех, которые находятся в свободном, плавающем состоянии. Такие отличия могут усиливать вирулентность объединенных микроорганизмов в биопленках, а также обеспечивать развитие устойчивости к эффекторам иммунной системы макроорганизма и резистентности к антимикробным препаратам [4]. Это может приводить к хрони-зации инфекционного процесса и неэффективности антибиотико- и антимикотикотерапии.
Как дрожжевые, так и нитчатые грибы могут образовывать биопленки; однако исследования биопленок нитчатых грибов менее описаны в литературе по сравнению с дрожжами. Среди дрожжеподобных грибов (ДПГ) Candida albicans (C. albicans) является наиболее изученной моделью образования биопленки (первые сообще-
Рис. 1. Схематическое изображение фаз развития биопленок, сформированных C. albicans, C. tropicalis
и C. africana
ния стали появляться в литературе с середины 1990-х годов) и показывает, что некоторые фазы её развития аналогичны фазам развития бактериальных биопленок [5]. Процесс развития включает: А) адсорбцию дрожжевых клеток на поверхности; Б) адгезию; В) образование ба-зальных слоев дрожжевых форм с ранним развитием гифы и матрикса; Г) биопленка содержит значительное количество дрожжей, гиф, псевдо-гиф, внеклеточного матрикса и водных каналов, которые способствуют движению питательных веществ и рассеиванию клеток. Доказано, что процесс филаментации непосредственно связан
с увеличением сжимающей силы биопленок, что делает их более устойчивыми к неблагоприятным условиям интенсивного перемешивания и ультразвука. Встречаются исследования не-альбиканс кандид, таких как Candida glabrata (С. glabrata), Candida parapsilosis (С. parapsilosis) и Candida tropicalis (C. tropicalis) [6]. Относительно морфологии, биопленки C. glabrata содержали только дрожжевые клетки, С. рarapsilosis и C. tropicalis - в основном, и дрожжевые и ги-фальные формы, но это зависело от конкретного штамма. Что касается внеклеточного ма-
трикса, то его состав различался по количеству и составу углеводов, белков у трех видов ДПГ.
Цель работы - разработка и апробация надежного диагностического алгоритма для количественной оценки кандидозных биопленок и оставшихся свободно плавающими клеток. Задачами исследования являлись: подтверждение того, что исследуемый штамм кандид способен формировать биопленку; сравнение степени биопленкообразования на примере трёх культур; анализ способности формировать биопленки тремя видами ДПГ рода Candida для выявления количественным методом подсчета биопленок, которые могут быть использованы для понимания физиологии биопленок, что позволит диагностировать и управлять биопленочные процессы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В качестве тест-объектов были выбраны 3 клинических изолята дрожжеподобных грибов (ДПГ) рода Candida:
1 - C. albicans, выделенная у собак с бессимптомной формой кандидоза ротовой полости [7];
2 - C. tropicalis был получен от собаки с острым кандидозом вагинальной полости. Первые два штаммы были идентифицирован на хромоген-ной среде Hi Crome Candida Agar («HIMEDIA», Индия), которая является селективной и позволяет дифференцировать колонии наиболее часто встречающихся и клинически значимых видов, а именно: C. albicans, C. krusei, C. tropicalis и C. glabrata до вида по цвету и морфологии [7];
3 - Candida africana (C. africana), выделенная из брыжеечного лимфоузла свиньи породы Большая белая, живой массы около 100 кг, содержащихся в свиноводческом хозяйстве Пензенской области. Идентификация микроорганизма проходила с применением технологии матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации «Bruker Daltonik MALDI Biotyper» («BrukerDaltonikInc.», Германия) [8].
В данном опыте кандиды культивировали в жидкой питательной среде «Сабуро агар, хло-рамфеникол 2» (Biomerieux, Франция) с добавлением 1% глюкозы. В маленькую чашку Петри диаметром 40 мм вносили 2 мл среды и добавляли 1 мл суточной культуры исследуемого вида кандид в том же бульоне, содержащим 106 колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) в соответствии со стандартом мутности. Инкубацию проводили 24 и 48 ч в термостате при 37оС. После инкубации наблюдали образование биопленок на дне чашки Петри. Осторожно сливали надосадочный питательный бульон и трижды промывали физиологическим раствором по 3 мл для удаления планктонно жи-
вущих клеток. После инкубации и отмывания биопленки были окрашены 1 %-ным раствором кристаллического фиолетового в течение 5 минут при комнатной температуре, затем препараты опять трижды промывали физиологическим раствором по 3 мл [9]. Оставшийся краситель был извлечен из биопленочной массы 96 % этанолом, 3 мл которого залили в чашки и дали настояться 5 минут. Об интенсивности био-пленкообразования судили по степени окраски забранного этанола, измерения которого (оптическую плотность) проводили на спектрофотометре Lambda 950 (Perkin Elmer, США) в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны видимого света 600 нм. Результаты выражали в процентах относительно контроля по формуле абсолютного сравнения. В качестве контроля использовали 1 мл 96 % этилового спирта.
ODt - ODc
, где ODt - оптическая плотность исследуемого образца при \=600 нм;
ODc - оптическая плотность этанола 96 % при \=600 нм.
Кроме того, количественно измеряли оставшиеся планктонные не биопленочные кандиды. Надосадочный питательный бульон из предыдущего опыта и трехкратные промывочные растворы по 3 мл сливали в одну большую пробирку, тщательно перемешивали и замеряли полученный объем. У каждой культуры кандид он незначительно отличался по объему. Например, у штамма Candida albicans он был равен 10 мл. От этого объема брали 1/100 с помощью микропипетки (0,1 мл) и высевали газоном на агар Сабуро с хлорамфенико-лом (Biomerieux, Франция). Получились образцы после 24 и 48 часов инкубации. Через сутки в термостате подсчитывали количество КОЕ на чашке Петри d=7 см и умножали на 100 для подсчёта кандид в начальном растворе.
Для морфологических исследований применения настольный сканирующий электронный микроскоп Hitachi ТМ 4000 Plus (Hitachi High-Technologies Corp., Япония), который дает увеличение д о 1 0 0 0 0 0 раз, и клеточный голографический микроскоп 3D Cell Explorer (Nano Live, США), любезно предоставленные ООО «Интерлаб».
Подготовку препаратов для электронной микроскопии проводили следующим образом: на дно чашек Петри до внесения культур помещали стерильные обезжиренные покровные стекла. Образцы культивировали как обычно, а после экспозиции эти стекла с биопленками аккурат-
но извлекали пинцетом. Далее препараты фиксировали парами 25 % раствором глутарового альдегида рН=7,2 (EM Scientific Inc., Великобритания) в течение 5 часов с последующим троекратным отмыванием дистиллированной водой. Затем препарат фиксировали парами 0,5% водным раствором осмиевой кислоты (OsO4) в течение 5 мин. Для фиксации парами раствор наносили в виде капель на поверхность бумажного фильтра, помещенного на крышку чашки Петри. После такой обработки биопленки с кандидами приобретали коричневый оттенок [10]. Сканирующая электронная микроскопия проводилась при увеличении от 1000 до 10000 раз.
Для клеточного голографического микроскопа 3D Cell Explorer какая-то специальная подготовка не требуется - открытые чашки Петри с биопленками помещали в микроскоп, и он выводил картину 3D строения биопленок на экран компьютера.
Все опыты выполняли в трех повторениях, для статистического анализа результатов экспериментов применяли критерий достоверности Стьюдента - различия считали достоверными при р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как показали исследования показателей светопропускания 24- и 48-часовых био-
пленок относительно контроля согласно критериям достоверности Стьюдента, показатели 1 суточных и 2-х суточных биопленок достоверно отличались и составляли у C. albicans и C. tropicalis р= 0,001333353 и р= 0,004711406 соответственно (табл.1.)
Также достоверные отличия были между C. tropicalis и C. africana через 24 часа и через 48 часов инкубации (р= 0,001582525 и р= 0,000650998 соответственно). Единственные значения, достоверные отличия которых не доказаны, были у C. albicans и C. africana через 24 часа (р = 0,352873694). Через сутки картина между двумя штаммами поменялась. Оказалось, что штамм C. africana более способен образовывать биопленки по сравнению с C. albicans (р = 0,009248883) (рис.2).
Следует отметить, что лучшей способностью образовывать биопленки обладает культура C. africana, меньшей способностью - C. albicans, наименьшей - C. tropicalis.
В проведенных ранее исследованиях по изучению способности этих же штаммов образовывать проростковые трубки в МПБ с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота показано, что культура C. tropicalis зародышевые трубки образовывала слабо, а развитие герминативных трубок у C. albicans и C. africana было в разы интенсивнее [11].
Таблица 1
Зависимость интенсивности биопленкообразования ДПГ рода Candida от времени культивирования, полученная на основе окраски кристаллическим фиолетовым
Тест-объекты Интенсивность биопленкообразования трех повторов в % через 24 часа культи-ви-рования Средняя интенсивность биопленкообразования в % через 24 часа культивирования Интенсивность биопленкообразо-вания трех повторов в % через 48 часов культивирования Средняя интенсивность био-пленкообразова-ния в % через 48 часов культивирования
C. albicans 38,4 41,7±3,8 52,8 53,3±2,7
41,0 56,3
45,8 50,9
C. tropicalis 22,1 21,7±2,6 38,7 38,6±3,6
18,9 35,0
24,0 42,1
C. africana 38,7 43,0±3,8 64,0 64,3±3,0
44,2 67,4
46,1 61,5
При оценке количества оставшихся план- что штамм C. tropicalis обладал показателя-ктонных кандид, не вовлеченных в про- ми в несколько раз выше других ДПГ (табл.2). цесс биопленкообразования, установлено,
Рис. 2. Кинетика биопленкообразования C. albicans, C. tropicalis, C. africana. Условные обозначения: по оси Х - время от начала взаимодействия (ч.); по оси Y - интенсивность образования биопленок (%).
Таблица 2
Зависимость количества оставшихся планктонных клеток, не вовлеченных в процесс биопленкообразования, от времени культивирования
Тест-объекты КОЕ через 24 часа культивирования КОЕ через 48 часов культивирования
C. albicans 6,2±0,8 х103 4,9±1,1 х103
C. tropicalis 2,0±0,9 х104 2,8±1,0 х104
C. africana 5,6±1,0 х103 5,3±1,2 х103
Для правильного подсчёта колоний пришлось разбавлять исследуемый образец ещё в 10 раз, т.е. 0,1 мл взвеси, взятый с помощью микропипетки, сначала разводили в 10 раз, а потом высевали газоном. Достоверной разницы в опыте между C. albicans и C. africana не выявлено, а между этими культурами и C. tropicalis - установлена (р<0,05).
С помощью электронной (рис.3) и кле-точно-голографической микроскопии (рис.4) установлено, что длинные гифальные нити кандид удерживают клетки между собой и образуется плотная биопленка. Даже с помощью простого в использовании 3D клеточного го-лографического микроскопа можно убедиться, что суточная биопленка C. albicans содержит меньшее количество дрожжевых форм клеток, а больше трубкообразующих по сравнению с C. tropicalis. И хотя количественно клеток на втором препарате кажется больше, элементов матрикса в нём отмечено меньше.
ОБСУЖДЕНИЕ
Род ДПГ Candida состоит из более чем 300 видов и известен за свою способность вызывать поверхностные и системные инфекции в человеческом организме и у животных. Вид Candida albicans является наиболее распространенным и изученным. Однако список новых патогенных Candida spp. продолжает расти, даже если многие из этих видов не совсем «неизвестны», так как их до этого считали атипичными штаммами уже известных патогенов [12]. Ярким примером стало открытие Candida dubliniensis в 1995 [13], что имеет важное диагностическое значение, поскольку этот новый вид с помощью традиционных методов идентификации еще может быть ошибочно отнесен к С. albicans. Семнадцать лет назад Candida africana была предложена Tietz et al. в качестве нового вида [14], и с тех пор вызвала много споров относительно того, следует ли ее рассматривать как отдельный вид от C. albicans [15]. Наше исследование подтвердило, что эти
Рис. 3. Сканирующая электронная микроскопия поверхности суточной биопленки, сформированной
C. albicans. Увеличение х 22500, метка 10 мкм.
Рис. 4. Суточные биопленки в 3D клеточном голографическом микроскопе. Условные обозначения: а - C. albicans; б - C. tropicalis ДПГ и гифы у C. albicans видны чётко, элементы матрикса - в виде мелких
точек.
два вида различно проявляют себя по способности образовывать биопленки, а также отличаются друг от друга и от C. tropicalis рядом фено-типических и патогенетических признаков. Разработанный нами алгоритм для количественной оценки кандидозных биопленок и оставшихся свободно плавающими клеток подтвердил свою эффективность на примере этих трёх культур.
Патологический процесс заболеваний, вызываемых ДПГ рода Candida, связан с факторами патогенности: морфологической трансформацией, адгезией, инвазией, формированием биопленок, секрецией гидролаз и т.д., которые детерминированы в геноме микроба [16].
На основании вышеописанных опытов, установлено, что у кандид при формировании биопленок существенную, а иногда и главную роль играют морфологические формы. Продуктивное трубкообразование обеспечивает хорошее развитие межклеточного матрик-са, формирование биопленок и прилипание к абиотическим поверхностям всей конструкции. Такая организация обеспечивает физиологическую и функциональную стабильность и, следовательно, выживание в экологической нише. Согласно полученным экспериментальным исследованиям штаммы C. africana и C. albicans быстрее и продуктивнее образовыва-
ли биопленки, чем C. tropicalis, что характерно для более вирулентных микроорганизмов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Формирование биопленок - особая форма организации микроорганизмов, покрывающих различные поверхности. Известно, что существование биопленок с межклеточным матрик-сом является преимуществом в защите от неблагоприятных факторов: иммунной системы, воздействия антибиотиков и др. Сведения по исследованию формирования биопленок существенно дополняет имеющиеся сведения развития чистых культур микроорганизмов на плотных питательных средах, а во многих случаях, объясняет ранее необъяснимые явления.
Предложенная методика учёта формирования биопленок Candida может быть использована для выявления одного из факторов пато-генности и определения мишеней при разработке современных методов антимикотической терапии ДПГ. Терапевтическое воздействие таких препаратов может быть направлено на механизмы первоначальной адгезии биопленки, блокирование синтеза или разрушение полимерного матрикса, нарушение межклеточного обмена информацией, а также оно может сочетаться с собственно антимикробными агентами.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов. Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.
Финансирование/ Funding. Отсутствует / The authors have not received any funding or benefits from industry or elsewhere to conduct this study.
ЛИТЕРАТУРА
1. Douglas L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends Microbiol. 2003;11:30-36. doi:10.1016/ S0966-842X(02)00002-1.
2. Yapar N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 2014;10:95-105. doi:10.2147/TCRM.S40160.
3. Сачивкина Н. П., Ленченко Е. М. Значимость формирования биопленок патогенными микроскопическими грибами. Успехи медицинской микологии. 2018; (18):62-65.
4. Tscherner M., Schwarzmïiller T., Kuchler K. Pathogenesis and antifungal drug resistance of the human fungal pathogen Candida glabrata. Pharmaceutic als.2011;(4):169-86. doi:10.3390/ph4010169.
5. Nett J. The host's reply to Candida biofilm. Pathogens. 2016;5:1-10. doi:10.3390/pathogens5010033.
6. Silva S., Henriques M., Martins A., Oliveira R., Williams D., Azeredo J. Biofilms of non-Candida albicans Candida species: quantification, structure and
matrix composition. Med Mycol. 2009;47:681-689. doi:10.3109/13693780802549594.
7. Шамукова Д. Ф., Яковлева А. М., Сачивкина Н. П. Лабораторная диагностика кандидозов собак и кошек. Успехи современного естествознания. 2014;8:63.
8. Сачивкина Н. П., Ленченко Е. М., Лисейцев А. В. Дифференциально-диагностические аспекты канди-доза свиней. Ветеринария. 2018;11:26-30.
9. Чеботарь И. В., Погорелов А. Г., Яшин В. А., Гурьев Е. Л., Ломинадзе Г. Г. Современные технологии исследования бактериальных биопленок. Современные технологии в медицине. 2013;5(1):14-20.
10. Павлова И. Б., Антонова А. Н., Ленченко Е. М. Исследование формирования биопленок патогенными бактериями. Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2016;18(2):63-70.
11. Сачивкина Н. П., Куликов Е. В. Образование герминативных трубок у кандид с высокой степенью адгезии. Успехи медицинской микологии. 2016;15:33-35.
12. Brandt M. E., Lockhart S. R. Recent taxonomic developments with Candida and other opportunistic yeasts. Curr Fungal Infect Rep. 2012;6:170-177.
13. Sullivan D. J., Westerneng T. J. Candida dubliniensis sp. nov.: phenotypic and molecular characterization of a novel species associated with oral candidosis in HIV-infected individuals. Microbiology. 1995;141:1507-1521.
14. Tietz H. J., Hopp M., Schmalreck A., Sterry W., Czaika V. Candida africana sp. nov., a new human pathogen or a variant of Candida albicans? Mycoses. 2001;44:437-445.
15. Johnson E. M. Rare and emerging Candida species. Curr Fungal Infect Rep. 2009;(3):152-159.
16. Хайтович А. Б., Гаффарова А. С. Факторы патогенности Сandida albicans и определение их генных детерминант. Таврический медико-биологический вестник. 2016;19(3):121-126.
REFERENCES
1. Douglas L. J. Candida biofilms and their role in infection. Trends Microbiol. 2003;11:30-36. doi:10.1016/ S0966-842X(02)00002-1.
2. Yapar N. Epidemiology and risk factors for invasive candidiasis. Ther Clin Risk Manag. 2014;10:95-105. doi:10.2147/TCRM.S40160.
3. Sachivkina N. P., Lenchenko E. M. Significance of biofilm formation of pathogenic microscopic fungi. Advances in medical Mycology. 2018;18:62-65. (In Russ).
4. Tscherner M., SchwarzmQller T., Kuchler K. Pathogenesis and antifungal drug resistance of the human fungal pathogen Candida glabrata. Pharmaceuticals. 2011;(4):169-186. doi:10.3390/ph4010169.
5. Nett J. The host's reply to Candida biofilm. Pathogens. 2016;5:1-10. doi:10.3390/pathogens5010033.
6. Silva S., Henriques M., Martins A., Oliveira R., Williams D., Azeredo J. Biofilms of non-Candida
albicans Candida species: quantification, structure and matrix composition. Med Mycol. 2009;47:681-689. doi:10.3109/13693780802549594.
7. Shamukova D. F., Yakovleva A. M., Sachivkina N. P. Laboratory diagnosis of candidiasis in dogs and cats. Successes of modern natural science. 2014;8:63. (In Russ).
8. Sachivkina N. P., Lenchenko E. M., Lyseizev A. V. Differential diagnostic aspects of pig candidosis. Veterinary science. 2018;11:26-30. (In Russ).
9. Chebotar I. V., Pogorelov A. G., Yashin V. A., Guryev E. L., Lominadze G. G. Modern technologies of bacterial biofilms research. Modern technologies in medicine. 2013;5(1): 14-20. (In Russ).
10. Pavlova I. B., Antonova A. N., Lenchenko E. M. Investigation of biofilm formation by pathogenic bacteria. Problems of veterinary sanitation, hygiene and ecology. 2016;18(2): 63-70. (In Russ).
11. Sachivkina N. P., Kulikov E. V. Formation of germ tubes by the Candida with a high degree of adhesion. Advances in medical Mycology. 2016;15:33-35. (In Russ).
12. Brandt M. E., Lockhart S. R. Recent taxonomic developments with Candida and other opportunistic yeasts. Curr Fungal Infect Rep. 2012;6:170-177.
13. Sullivan D. J, Westerneng T. J. Candida dubliniensis sp. nov.: phenotypic and molecular characterization of a novel species associated with oral candidosis in HIV-infected individuals. Microbiology. 1995;141:1507-1521.
14. Tietz H. J., Hopp M., Schmalreck A., Sterry W., Czaika V. Candida africana sp. nov., a new human pathogen or a variant of Candida albicans? Mycoses. 2001;44:437-445.
15. Johnson E. M. Rare and emerging Candida species. Curr Fungal Infect Rep. 2009;(3):152-159.
16. Khaitovich A.B., Gaffarova A.S. Pathogenicity factors of candida albicans and determination of their genes. Tavricheskiy Mediko-Biologicheskiy Vestnik. 2016;19(3): 121-126. (In Russ).
