CC BY
278
УДК 616.992:579.567.7
С.А. лиСоВСКАя, Е.В. ХАлДЕЕВА
Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, 420015, г. Казань, ул. Большая Красная, д. 67
Грибы рода Fusarium как потенциально патогенные виды микроорганизмов
Яисовская Светлана Анатольевна — кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории микологии, тел. (843) 236-56-59, e-mail: S_Lisovskaya@mail.ru
Халдеева елена Владимировна — кандидат химических наук, заведующая лабораторией микологии, тел. (843) 236-56-59, e-mail: mycology-kazan@yandex.ru
Проведен анализ патогенной активности различных видов Fusarium spp. Изучены адгезивные свойства штаммов Fusarium oxysporum, Fusarium solani музейных и клинических (выделенных от больных) с помощью ранее разработанной модели на основе нитроцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином. Определена ростовая активность 5 штаммов с использованием различных сред. Установлено, что микроконидии обладают адгезивной активностью. Выявлено активное образование ростовых трубок всеми видами грибов рода Fusarium на нитроцеллюлозной пленке с иммобилизованным гемоглобином. Полученные данные позволяют предположить, что грибы рода Fusarium могут играть определенную роль в патогенезе заболевания.
Ключевые слова: Fusarium spp., микромицеты, патогенность, адгезия, микроконидии.
S.A. LISoVSKAYA, E.V.KHALDEEVA
Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Russian Agency for Consumer Supervision, 67 Bolshaya Krasnaya Str., Kazan, Russian Federation, 420015
Micromycetes of Fusarium species as potentially pathogenic microorganisms
lisovskaya SA — Cand. Biol. Sc., Leading Researcher of Mycology Laboratory, tel. (843) 236-56-59, e-mail: S_Lisovskaya@mail.ru Khaldeeva E.V. — Cand. Chem. Sc., Head of Mycology Laboratory, tel. (843) 236-56-59, e-mail: mycology-kazan@yandex.ru
Analysis of pathogenic activity of different species of Fusarium spp. was carried out. Adhesive properties of standard and clinical strains of Fusarium oxysporum, Fusarium solani were tested with the previously developed model based on nitrate cellulose film with immobilized hemoglobin. The growth activity of 5 strains was determined using various media. It was shown that microconidia demonstrated adhesive activity. All Fusarium species actively formed growth tubes on the nitrate cellulose film with immobilized hemoglobin. The obtained results make it possible to assume participation of Fusarium spp. in the disease pathogenesis. Key words: Fusarium spp., micromycetes, pathogenity, adhesion, microconidia.
Повсеместное распространение микроскопических грибов в окружающей среде обуславливает постоянный контакт человека с микромицетами. Высокий уровень антропогенных воздействий, часто способствующий накоплению в окружающей среде вредных плесеней и увеличению количества больных иммунодефицитом, наиболее восприимчивых к возбудителям вторичных микозов, может способствовать увеличению риска заражения грибковыми инфекциями. Так, в последнее время увеличивается число регистрируемых случаев вторичных микозов, вызванных видами, ранее остававшимися в тени,
относящихся к оппортунистическим — потенциально патогенным видам из-за лабильных свойств [1]. Среди них есть и достаточно выраженные патогенные формы микромицетов, виды, способные поражать ослабленные организмы, и, наконец, сапро-фиты, живущие на растительных остатках, в почве и на отмерших частях растений.
Грибы рода Fusarium обладают большим разнообразием ферментов, что позволяет им использовать в качестве субстрата различные органические соединения. Они способны, с одной стороны, длительно сохраняться и развиваться во внешней
аллергология. иммунология. пульмонологи
среде, а с другой, вызывать тяжелые формы заболеваний различных организмов. Большинство представителей грибов рода Fusarium являются фитопатогенами, однако известны Fusarium spp., паразитирующие на насекомых, а также вызывающие микозы и токсикозы человека и теплокровных животных [2, 3]. В последнее время в литературе появляется все больше сведений о клинических и эпидемиологических аспектах инфекции, вызванных Fusarium spp. [4].
Наиболее часто причиной заражения оппортунистическими видами грибов во внешней среде является вдыхание спор грибов, а в случае повреждения кожных покровов — занос в раны инфекции, причем часто из почвы. У человека и теплокровных животных грибы рода Fusarium наиболее часто колонизируют ногти, кожу, роговицу глаза и легкие. Fusarium spp. могут быть причиной аллергических состояний у лиц, вдыхающих загрязненный конидиями и спорами воздух, например, риниты, бронхиальная астма. Неинвазивно обитающие в пара-назальных полостях они способны провоцировать аллергические грибковые синуситы. В то же время у Fusarium spp., в отличие от многих признанных патогенных грибов, имеется необычная способность продуцировать в тканях человека особые морфологические формы: конидии и торулоидные гифы, способные проникать в кровоток и приводить к диссеминации процесса [5]. Такие одноклеточные формы легко циркулируют в кровотоке.
В настоящее время остается не ясным вопрос: могут ли грибы рода Fusarium самостоятельно вызывать микозы или они инфицируют органы человека вторично, например, на фоне заболевания неинфекционной природы. В связи с этим, целью нашей работы было изучение факторов пато-генности грибов рода Fusarium, и оценка частоты встречаемости их в микробиологических посевах, от пациентов, обратившихся в микологическую лабораторию Казанского НИИ эпидимиологии и микробиологии.
Материал и методы
В исследовании использовали клинические штаммы (Fusarium oxysporum, Fusarium solani), выделенные от пациентов, находящихся на амбулаторном лечении, и музейные штаммы, полученные из Всероссийской коллекции F. oxysporum ВКМ- F-1182 и F. solani ВКМ- F-819.
Материал для выделения изолятов грибов брали от больных с помощью стерильного ватного тампона с последующим смывом стерильной водой по периметру наиболее свежих поражений. Затем тампон помещали в пробирку с 2 мл стерильной воды. Поверхностное культивирование проводили на агари-зованных средах: стандартной среде Чапека, стандартной среде Сабуро и модифицированной среде Сабуро с добавлением гидролизат казеина. Выращивание проводили при +30±20С в течение 6-9 суток. Идентификацию выделенных штаммов грибов проводили по основным принятым микроскопическим и биохимическим критериям [6, 7].
Определение адгезивных свойств выделенных штаммов Fusarium spp. проводилось на ранее разработанной авторами модели адгезии клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку. Пленку площадью 7 см2 инкубировали при температуре 30°С с 3 мл суспензии спор гриба в 0,1М фосфатном буфере в течение 1 суток. Определение уровня адгезии проводили по разнице начальной и конечной оптиче-
ской плотности суспензии клеток при длине волны 540 нм, а также прямым подсчетом клеток в суспензии с помощью микроскопа Микмед-6 при увеличении 10x20, подсчитывали не менее 1о полей зрения.
Определение скорости роста мицелия грибов и прорастания микроконидий проводили на нитро-целлюлозной пленке с иммобилизованным гемоглобином и в его отсутствии. Густота посевной взвеси — приблизительно 100 спор на пленку. Инкубирование проводили в течение 1-4 суток при температуре 30°С. Скорость прорастания микроконидий определяли временем достижения ростовой трубкой первого ветвления и числом ростковых трубок (в процентах; на основании изучения не менее чем 100 спор).
Результаты и обсуждения
Результаты обследования пациентов, обратившихся в лабораторию микологии КНИИЭМ, показывают, что грибы рода Fusarium наиболее часто обнаруживаются в микробиологических посевах поздней весной и ранней осенью. Это связанно с хорошим ростом этих грибов во влажных условиях и распространением их конидий ветром и осадками [1]. Частота обнаружения грибов рода Fusarium в организме человека за период 2010-2015 гг. составила, по данным наших исследований, около 7% (рис. 1). Грибы рода Fusarium более чем в 95% случаев высевались у больных с кожных покровов, и менее 5% приходилось на долю слизистых носа, роговицу глаза и слухового прохода. Однако, только в восьми случаях обсемененность грибами Fusarium spp. составила более 1х104 КОЕ/мл. Причем, в пяти случаях заражения, у больных был поставлен диагноз атопический дерматит с хроническим течением заболевания и в двух случаях — микоз кожи. Длительное нарушение как общего, так и местного иммунитета, сопровождающее данные хронические заболевание кожи, способствует расширенной колонизации условно-патогенной микрофлорой, в том числе грибами рода Fusarium.
Необходимо отметить, что данные микромицеты в 96% случаев в микробиологических посевах от больных высевались совместно с другими видами грибов. Наиболее часто, в 73% случаев Fusarium spp. встречался в ассоциациях с C. albicans.
Для исследования патогенности данных микроми-цетов нами были отобраны три клинических и два музейных штамма Fusarium spp. Группу клинических штаммов составили два штамма F. solani (№3, 4) и один штамм F. oxysporum (№5), при выделении которых учитывались клинические проявления микотического заболевания и выявление Fusarium spp. в количестве, превышающем 104 КОЕ/мл. Группу музейных штаммов составили два штамма: F. oxysporum (№1), F. solani (№2).
С целью описания морфологии колоний и характера роста культур, грибы выращивали на различных твердых средах. Наилучший рост на твердых средах на четвертый день культивирования наблюдался у клинических штаммов на модифицированной среде Сабуро с добавлением гидролизат казеина, по сравнению с общепринятой для выделения данных видов грибов средой Чапека (рис. 2). Изоляты характеризовались обильным ростом мицелия, в том числе воздушного, происходило образование большого количества репродуктивных структур: макро- и микроконидий. Музейные штаммы на данной среде достигали таких же размеров только к шестым суткам. По-видимому, это связа-
"Н
алогия. пульмонологи
Рисунок 1.
Частота встречаемости потенциально патогенных плесневых грибов в микологических посевах за период 2010-2015 гг.
Рисунок 2.
Диаметр колоний изолятов Fusarium на различных твердых средах на четвертый день культивирования
Примечание: 1 — стандартная среда Чапека; 2 — стандартная среда Сабуро; 3 — модифицированная среда Сабуро с добавлением гидролизат казеина
но с использованием различных источников азота в этих средах. В первом случае — это органический источник — казеин, для его использования в своем метаболизме грибу требуется выработка специфических ферментов, в частности, протеаз. Во втором — минеральный — нитрат натрия, он более доступен и быстрее метаболизируется мицелиальными грибами. Можно предположить, что клинические штаммы обладали набором необходимых протеаз. Известно, что секретируемые грибами протеазы участвуют в разнообразных формах патогенеза, например инвазии.
Потенциальную патогенность принято характеризовать наличием и проявлением факторов патогенности, основанных на физиологических особенностях грибковой клетки и характере ее взаимодействия с макроорганизмом, которые способствуют закреплению гриба в организме и раз-
витию заболевания. Известно, что любой инфекционный процесс начинается с адгезии возбудителя на клетках-мишенях. Адгезивность является одним из основных факторов, определяющих поведение микроорганизмов в биоценозах, и она же определяет способность гетеротрофных микроорганизмов переходить к паразитическому образу существования [8]. Поэтому, нами были изучены адгезивные свойства штаммов грибов Fusarium spp., выделенных с поверхности кожи у больных атопическим дерматитом.
В изучении адгезивной активности штаммов использовали микроконидии, несмотря на то, что в морфологическом отношении они менее дифференцированы, чем макроконидии, но играют ключевую роль в распространении вида и заселении субстрата.
Изучение выделенных микроконидий у штаммов Fusarium spp. выявило значительные отличия в их
аллергология. иммунология. пульмонологи
Таблица 1.
Адгезивная активность микроконидий штаммов Fusarium spp. < ;n = 5, p=0,95)
Исследуемые виды грибов Принадлежность штамма Средний уровень адгезии микроконидий, %
F. oxysporum (№1) F. oxysporum (№5) F. solani (№2) F. solani (№3) F. solani (№4) Музейный штамм Клинический штамм Музейный штамм Клинический штамм Клинический штамм 8,6+0,1 9,0+0,2 16,8+0,2 17,6+0,1 17,0 + 0,1
Таблица 2.
Скорость прорастания микроконидий Fusarium spp.
Виды грибов Образование ростковой трубки, время (час)
Нитроцеллюлозная пленка в отсутствии гемоглобина Нитроцеллюлозная пленка с иммобилизованным гемоглобином
3 6 18 24 3 6 18 24
F. solani №2 - - + + + - ++ + + + + +
F. oxysporum №1 - - +/- + - - + + + +
Примечание: (-) — при осмотре под микроскопом отсутствуют внешние морфологические изменения; (+) — при осмотре под микроскопом видно слабое развитие < 10%; (++) — при осмотре под микроскопом видно развитие от 25 до 50%; (+++) — при осмотре под микроскопом видно развитие > 50%
адгезивных свойствах, связанных с видовой принадлежностью штаммов. Тестирование адгезивных свойств микроконидий грибов Fusarium spp., клинических и музейных штаммов показало значительно более высокий (почти в 2 раза) уровень адгезии у вида F. solani, по сравнению с F. oxysporum (табл. 1), что позволило выявить достоверные отличия между изученными видами. Таким образом, адгезивная активность микроконидий, по-видимому, является видовым атрибутом грибов рода Fusarium. Отсутствие отличий в адгезивной активности микроконидий у штаммов одного вида, но выделенных с различных источников, можно объяснить лишь тем, что каждый отдельный вид грибов рода имеет свои определенные особенности в структуре поверхности спор, участвующих в процессе сохранения и размножения вида.
В ходе эксперимента было замечено, что при использовании в качестве лиганда белка гемоглобина, увеличивается количество ростковых трубок у микроконидий всех видов грибов Fusarium spp. Выявлено активное обрастание нитроцеллюлозной пленки с иммобилизованным гемоглобином всеми видами грибов рода Fusarium, по сравнению с ростом данных грибов на нитроцеллюлозной пленке, в отсутствии гемоглобина, где количество ростковых трубок было в 3-5 раз меньше. Время появления первой ростковой трубки для разных видов было различно. Так, у грибов F. solan/'ее появление отмечено в первые шесть часов, а полное прорастание спор завершилось на вторые сутки опыта, тогда как у штаммов F. oxysporum первые ростковые трубки появились только к концу первых суток (табл. 2).
Проведенные исследования показали наличие патогенных свойств у грибов рода Fusarium. Выявлены статистически достоверные отличия адгезивных свойств и интенсивности прорастания различных видов Fusarium. Полученные данные подтверждают наличие среди грибов рода Fusarium видов с
более выраженными патогенными свойствами, что подчеркивает значимость видовой идентификации гриба. Кроме того, в ходе исследования отмечалось проявление агрессии грибов к белкам макроорганизма.
Таким образом, на основании полученных данных, можно предположить, что грибы рода Fusarium могут играть определенную роль в патогенезе заболевания. Присутствие данных микромицетов в микробиологическом посеве необходимо учитывать врачам-клиницистам для прогнозирования микоти-ческих осложнений у больных, особенно при наличии выраженных нарушений кожного покрова, например, при атопическом дерматите.
ЛИТЕРАТУРА
1. Марфенина О.Е., Фомичева Г.М. Потенциальные патогенные мицелиальные грибы в среде обитания человека. Современные тенденции // Микология сегодня / Под ред. Ю.Т. Дьякова, Ю.В. Сергеева. — М.: Национальная академия микологии, 2007. — Т. 1. — С. 235-266.
2. Дьяков Ю.Т., Шнырева А.В., Сергеев А.Ю. Введение в генетику грибов: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. Заведений. — М.: Издательский центр «Академия», 2005. — 304 с.
3. Kantarcioglu A.S. A dark strain in the Fusarium solani species complex isolated from primary subcutaneous sporotrichioid lesions associated with traumatic inoculation via a rose bush thorn / A.S. Kantarcioglu, R.C. Summerbell, D.A. Sutton et al. // Med. Mycol. — 2009. — Vol. 30. — P. 1-7.
4. Блинов Н.П., Васильева Н.В. Основные итоги 15-го конгресса международного общества медицинских и ветеринарных микологов (ISHAM), США // Проблемы медицинской микологии. — 2003. — Т. 5, №4. — С. 45-59.
5. Аравийский Р.А., Климко Н.Н., Васильева Н.В. Диагностика микозов. — СПб: Издательский дом СПбМАПО, 2004. — 186 с.
6. Дудка И.А., Вассер С.П. Методы экспериментальной микологии. Справочник. — Киев: Наукова думка, 1982. — 550 с.
7. Саттон Д. Определитель патогенных и условнопатоген-ных грибов / Д. Саттон, А. Фотергилл, М. Ринальди. — М.: Мир, 2001. — 486 с.
8. Буркутбаева Т.Н., Фохридина Л.И., Тастанбекова Л.К. Свойства плесневых грибов, выделенных от больных с микозами ЛОР-органов // Проблемы медицинской микологии. — 2006. — Т. 8, №1. — С. 37-39.
УН
алогия. пульмонологи
