CC BY
15УДК 675.016:539.612:616.594.171.2
анализ адгезивном активности клинических штаммов candida albicans, выделенных с кожи больных разных нозологических групп
Лисовская С.А. (в.н.с.)*, Халдеева Е.В. (зав. лаб.), Глушко Н.И. (с.н.с.), Паршаков В.Р. (н.с.)
Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань, Россия
©Коллектив авторов, 2015
Изучены адгезивные свойства 296 штаммов C. albicans, выделенных с кожи пациентов с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции и их отсутствием. Исследование проводили на 48 часовых культурах C. albicans, выращенных на среде Сабуро при температуре 30 оС. Адгезивные свойства выделенных штаммов C. albicans выявляли на модели для определения in vitro, основанной на взаимодействии адгезинов клеточной стенки грибов с гемоглобином. Адгезивные способности штаммов, полученных с поверхности кожи при кандидозах, коррелируют с клиническими проявленииями заболевания и уровнем обсемененности C. albicans. При исследовании штаммов C. albicans, изолированных от больных после успешно проведенного лечения, отмечали снижение уровня адгезии в 2-3 раза.
Ключевые слова: адгезия бластоспор, адгезивные свойства штаммов Candida albicans, кандидоз, патогенность
analysis of adhesive activity of clinical
strains of Candida albicans isolated from
skin of patients of different nosological groups
Lisovskaya S.A. (leading scientific collaborator), Khaldeeva E.V. (head of the laboratory), Glushko N.i. (senior scientific collaborator), Parshakov V.R. (scientific collaborator)
Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Kazan, Russia
©Collective of authors, 2015
Adhesive properties of296 strains of C. albicans isolated from patients with clinical signs of superficial Candida infection and in its absence have been investigated. The study was conducted on 48 hour cultures of C. albicans grown on Sabouraud medium at a temperature of 30 oC. Determination of adhesive properties of strains of C. albicans was carried out using the in vitro model based on the interaction of adhesins of cell wall of fungi with hemoglobin. The adhesive ability of strains isolated from the surface of the skin with candidosis correlate with clinical symptoms of the disease and the level of dissemination by C. albicans. It was shown the decrease of the adhesion level in 2-3 times for the strains of C. albicans isolated from patients after a successful therapy.
Key words: adhesive properties of strains Candida albicans, blastospores adhesion, candidosis, pathogenity
* Контактное лицо: Лисовская Светлана Анатольевна, тел.: +7(843)2365659
ВВЕДЕНИЕ
C. albicans обитает повсеместно, включая природные субстраты, также она является комменсалом многих теплокровных животных, в том числе - человека. Носительство C. albicans на коже наблюдают более, чем у 30-50% населения. Наибольший процент колонизации кожи грибами возникает за счет кишечной популяции C. albicans, но нередко заражение происходит и экзогенным путем [Реброва Р.Н. Грибы рода Candida при заболеваниях негрибковой этиологии. - М., 1989].
Считают, что основные звенья в патогенезе возникновения кандидоза кожи: генетическая предрасположенность человека, нарушение барьерной функции кожи, нейровегетативные расстройства, нарушение обмена веществ, длительный прием антибиотиков, сахарный диабет и т.д [1; Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. - М., 2000]. Однако, несмотря на это, все чаще появляются подтверждения существования патогенных штаммов C. albicans, способных вызывать кандидозную инфекцию и отличающихся по ряду биохимических и биологических свойств от грибов этого же вида, выделенных от практически здоровых лиц. В связи с этим изучение факторов патогенности грибов особенно важно в плане характеристики штаммов. Выявление определенных патогенных свойств штаммов помогает сделать правильный вывод о грибах как этиологическом факторе заболевания [Сергеев А.Ю., Сергеев Ю.В. Кандидоз. Природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника и лечение. - М., 2001].
Колонизация организма C. albicans, в отличие от кандиданосительства, обусловлена адгезией клеток гриба к эпителию, при которой основную роль выполняют адгезины клеточной стенки. Доказано, что для этого гриб использует различные механизмы [Pendrak M.L., Klotz S.A. // FEMS Microiol. Lett. - 1995. - Vol. 129]. Физическое взаимодействие гриба с макроорганизмом связано с клеточными поверхностями. Компоненты клеточных стенок, такие как хитин, ß-глюкан и липи-ды принимают участие в способности гриба к адгезии, но основными ее медиаторами являются белки и ман-нопротеины [Pendrak M.L., Klotz S.A.// FEMS Microiol. Lett. - 1995. - Vol. 129; Olson E.J., et al.// Infect. Immun. - 1996. - Vol. 64].
Кроме того, актуальность проблемы изучения адгезивной активности C. albicans обусловлена прогрессирующим развитием заболеваний, вызываемых данным видом, вследствие воздействия факторов, снижающих специфический иммунный ответ и неспецифическую резистентность организма.
Цель нашей работы - изучение адгезивных свойств штаммов C. albicans, выделенных с кожи у лиц с клиническими признаками кандидоза кожи и их отсутствием, с помощью разработанной ранее модели адгезии с иммобилизированным гемоглобином.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В исследовании использовали штаммы C. albicans, выделенные с кожи пациентов с клиническими признаками поверхностной кандидозной инфекции, а также культуры клинически незначимых, по мнению лечащего врача или миколога, штаммов (колонизация, контаминация), и культуры, полученные от больных, прошедших курс лечения антимикотическими препаратами.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МИКОЛОГИЯ
Материалом для исследований служили 48 часовые культуры C. albicans, изолированные от пациентов и выращенные на стандартной среде Сабуро при 30 оС.
Грибы идентифицировали микроскопическими и биохимическими методами, проводили тесты на трубки прорастания и ферментацию углеводов. В работе использовали селективные хромогенные среды «CandiSelect 4» (Bio-Rad) и коммерческие тест-системы, основанные на исследовании ауксанограм-мы: «Auxacolor 2» (Bio-Rad) [Кулько А.Б. Лабораторная диагностика микозов при туберкулезе. - М., 2001; Климко Н.Н. и др. Перечень основных методов и критериев диагностики микозов. - СПб., 2001].
Адгезивные свойства выделенных штаммов C. albicans определяли на ранее разработанной авторами модели адгезии клеток гриба на нитроцеллюлозную пленку с иммобилизированным гемоглобином [2].
Полученную пленку площадью 7 см2 инкубировали при 30 оС с 3 мл суспензии клеток гриба в 0,1М фосфатном буфере в течение двух часов. Начальная оптическая плотность суспензии клеток составляла 0,10-0,15 при длине волны 540 нм. Уровень адгезии определяли по разнице начальной и конечной оптической плотности суспензии клеток, а также прямым подсчетом клеток в суспензии с помощью микроскопа Биолам Р-11 при увеличении 10х20, подсчитывали не менее 10 полей зрения.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обследовано 1860 пациентов в возрасте от 0 до 60 лет с поражением кожных покровов на наличие грибов-возбудителей.
Первую (основную) группу больных составили лица младшего и среднего возрастов с диагнозом «ато-пический дерматит» (АД). АД - это хроническое заболевание кожи, сопровождающееся сильным зудом и, как следствие, повреждением кожного покрова, что нередко приводит к осложнению грибковой инфекцией [Маланичева Т.Г. и др. //Практическая медицина. - 2003. - №1]. Установлено, что при исследовании кожных покровов у больных с АД C. albicans в посевах выявляли в 57% случаях (Рис. 1).
Candida Rhodotorula Aspergillus Penicillium Trichophyton Другие rvtiib spp spp. ipp. виды
Рис. 1. Частота встречаемости микромицетов у больных с диагнозом «атопический дерматит»
Сопровождающие атопический дерматит нарушения иммунитета могут способствовать расширенной колонизации условно-патогенной микробиотой, в том числе - C. albicans с различной степенью вирулентно-
сти [Маланичева Т.Г. и др. //Практическая медицина. - 2003. - №1]. В связи с этим, нами изучены адгезивные способности штаммов С. albicans, выделенных от больных АД, для характеристики их патогенности.
Исследовали 130 штаммов С. albicans, полученных от больных четырех основных возрастных групп, характеризующихся своими особенностями иммунитета: до 3-х лет, от 3 до 12 лет, от 12 до 17 лет, от 17 до 30 лет. Все возрастные группы разделили на две основные группы - с высокой обсемененностью (К0Е>104 ед/мл) и низкой обсемененностью (К0Е<102 ед/мл).
При исследовании адгезивных свойств штаммов С. albicans установили, что, в зависимости от возраста пациента, взаимосвязь обсемененности с уровнем адгезии проявляется различным образом (табл. 1). Так, для детей до 3 лет часто, даже при очень высокой обсе-мененности (К0Е>105 ед/мл), штаммы характеризовались невысоким уровнем адгезии (<5%), тогда как для возрастных групп от 12-17 и 17-30 лет, в большинстве случаев, штаммам с низким уровнем адгезии соответствовала низкая степень обсемененности анатомической точки, а штаммам с высоким уровнем адгезии -высокая степень обсемененности.
Таблица 1.
Адгезивные свойства штаммов, выделенных с кожных покровов больных с диагнозом «атопический дерматит» различных возрастных групп
Уровень обсемененности С. albicans Возрастные группы больных Общее количество Количество штаммов при различном уровне адгезивной активности
штаммов <5% 5-12% 12-20%
КОЕ>Ю4 ед/мл дети до 3-х лет от 3 до 12 лет от 12 до 17 лет от 17 до 30 лет 18 25 20 17 12 6 3 2 4 13 7 4 2 6 10 11
КОЕ<Ю2 ед/мл дети до 3-х лет от 3 до 12 лет от 12 до 17 лет от 17 до 30 лет 6 15 12 17 4 9 8 11 1 4 3 4 1 2 1 2
По выявленным результатам адгезивной активности менее 5% отмечали, что у детей младшего возраста, и, в некоторых случаях, старшей группы больных АД, дрожжевая инфекция чаще протекает в форме неин-вазивного процесса и является следствием основного заболевания. В то же время, в старшей группе больных чаще выделяли штаммы с высоким уровнем адгезии, что служит показателем более выраженных патогенных свойств штамма и его, возможно, более активной роли в инфекционном процессе.
Вторую группу составили штаммы, изолированные от пациентов с поражением кожного покрова с диагнозом микоза и кандидоза кожи. Выделено 90 штаммов C. albicans от больных в возрасте от 10 до 54 лет с клинически подтвержденным диагнозом с выраженной клинической картиной поражения кожного покрова с высокой и низкой степенью обсемененности. При этом у 20% пациентов в возрасте от 32 до 54 лет отмечали хроническое течение кандидоза и микоза кожи.
У штаммов C. albicans, полученных от больных с диагнозом микоза и кандидоза кожи, во всех возрастных группах можно проследить устойчивую закономерность в адгезивных способностях (табл. 2). Так, при высокой степени обсемененности в посевах уровень адгезии в 90% случаях был высоким или умеренно высоким, а при низкой степени обсемененности в 80% случаях - низким.
Таблица 2.
Адгезивные свойства штаммов, выделенных с кожных покровов больных с клинически подтвержденным диагнозом микоза и кандидоза кожи различных возрастных групп
Уровеньобсе-мененности С. albicans Возрастные группы больных Общее количество штаммов Количество штаммов при различном уровне адгезивной активности
<5% 5-12»% 12-20%
КОЕ>Ю3 ед/мл от 10 до 17 лет от 17 до 32 лет от 32 до 54 лет 15 15 15 1 2 2 4 4 7 10 8 6
от 10 до 17 лет 15 12 3 0
КОЕ<Ю2 ед/мл от 17 до 32 лет 15 9 5 1
от 32 до 54 лет 15 10 5 0
Во всех случаях при диагностике кандидоза учитывали результаты комплексного обследования больного, однако наличие клинической картины оставалось одним из главных критериев. Отсутствие клинических признаков болезни и небольшое количество высеянных грибов (до 100 колоний) врачи рассматривают как кандиданосительство, а выделенные штаммы принято считать клинически незначимыми. Помимо этого, C. albicans в небольшом количестве можно обнаружить при посевах после успешно проведенной антифунгаль-ной терапии.
В связи с этим, группу клинически незначимых составили штаммы C. albicans, выделенные от пациентов без клинических признаков кандидоза, в количестве менее 102 КОЕ/мл. Всего в данную группу было отнесено 43 штамма. Другая группа (31 штамм) получена от больных, прошедших курс антифунгального лечения, при отсутствии клинических проявлений.
Адгезивная активность клинически незначимых штаммов варьировала в узком диапазоне значений от 2,3% до 4,5%. При исследовании штаммов C. albicans, изолированных от больных после успешно проведенной терапии, установили снижение уровня адгезии в 2-3 раза (табл. 3).
Таблица 3.
Адгезивные свойства клинически незначимых штаммов C. albicans и штаммов, выделенных от больных до и после успешно проведенного лечения
Группы штаммов Общее количество штаммов Среднее количество C. albicans, КОЕ/мл Средний уровень адгезии, %
Штаммы C. albicans, выделенные с кожи больных до лечения 30 (2,6+0,1)х103 14,8+1,2
Штаммы C. albicans, выделенные с кожи больных после лечения 31 менее 102 6,1+0,1
Штаммы C. albicans, выделенные с кожи от пациентов без клинических признаков кандидоза 43 менее 102 3,2+0,3
Характер выявленных изменений хорошо согласуется с клиническими проявлениями заболевания и культуральными исследованиями. У больных в фазе ремиссии представительство C. albicans в составе ми-кробиоты значительно снижается, приближаясь к количеству менее 102 КОЕ/мл, что характерно для нор-мобиоты.
выводы
1. При сопоставлении результатов, полученных для штаммов, выделенных при атопическом дерматите и микозах кожи, установили, что в случае АД при имеющихся повреждениях кожного покрова симптомы кан-дидоза могут быть обусловлены менее агрессивными штаммами, чем при кандидозе кожи, что требует учета патогенетических особенностей этих заболеваний.
2. В результате анализа адгезивной активности штаммов до и после лечения отмечали значительное снижение уровня адгезии, в некоторых случаях - до уровня клинически незначимых штаммов. Можно предположить, что проведенное лечение, затрагивая основные жизненные функции грибковой клетки, нарушает при этом процесс синтеза адгезинов.
Однако грань между транзиторным кандиданоси-тельством и кандидозом остается весьма тонкой и в определенных условиях, в частности, при снижении иммунитета, может быть преодолена.
3. Поскольку в условиях значительного «прессинга» со стороны многочисленных неблагоприятных факторов внешней среды, иммунологические показатели человеческой популяции ухудшаются, санирующее лечение кандиданосителей, особенно - в группах риска при выявлении штаммов с повышенными адгезивными свойствами, представляется полезным.
4. С помощью определения адгезивных свойств штамма можно установить этиологическую роль гриба в данном заболевании, то есть выяснить - является он возбудителем заболевания или комменсалом.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Шевяков М.А., Авдеенко Ю.Л., Бурыгина Е.В., Пуговкина О.А. «Белые налеты» в пищеводе. Диагностика кандидоза, включая дифференциальную //Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15, №2. - С. 25-27.
2. Лисовская С.А., Глушко Н.И., Халдеева Е.В. Лабораторная модель для определения адгезивных свойств дрожжеподоб-ных грибов// Проблемы медицинской микологии. - 2006. - Т. 8, №3. - С. 36-39.
Поступила в редакцию журнала 07.12.2015 Рецензент: Ю.В. Борзова у®3
