CC BY
17
С Н. Д. ТЕМЕЖНИКОВЛ, 20Ю УДК *М.777Л7»ЛГ7.»1-07*
Н. Д. Темежникова
ВЫЯВЛЕНИЕ ЛЕГИОНЕЛЛ В ВОДЕ И ДРУГИХ ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
ФГУЗ Причерноморская противочумная станция Роспотребнадзора, Новороссийск
Легиоиеллы и легионеллез
Лсгионсллы, согласно определителю бактерий Берд-жи [10], являются группой грамотрицательных микроаэ-рофильных палочек и кокков, относящихся к единственному роду Legionella семейства Legionellaceae. В настоящее время известно около 50 видов легионелл, преимущественно выделенных из окружающей среды и искусственных водных систем, однако патогенными для человека являются лишь некоторые виды. Легионеллы являются этиологическими агентами ряда острых инфекционных заболеваний, поражающих преимущественно органы дыхательной системы. Наиболее широко распространенными нозологическими формами легионеллеза являются болезнь легионеров (легионеллезная пневмония) и лихорадка Понтиак. Более 80% случаев всех заболеваний вызываются штаммами серогруппы 1-го вида Legionella pneumophila (типовой штамм Philadelphia I) [9, 34]. Другие легионеллы, в частности L. micdadei, L. long-beachae, L. dumofii, L. bozemanii, L. oakridgensis, вызывают заболевания крайне редко и чаще поражают людей с ослабленной иммунной системой, обычно на фоне им-муносупрессивной терапии.
В природных условиях легионеллы широко распространены в пресноводных водоемах и, будучи факультативными внутриклеточными паразитами, проходят часть жизненного цикла, паразитируя в амебах и других простейших, не представляя серьезной опасности для человека. Размножение легионелл наиболее активно идет в теплой воде при температуре от 25 до 45°С.
Легионеллы активно колонизируют искусственные водные системы — системы промышленного охлаждения и кондиционирования, градирни, компрессорные устройства, бассейны, фонтаны, медицинское оборудование и др., условия для размножения легионелл в которых более благоприятны, чем в естественных. Это приводит к накоплению в них возбудителя в высокой концентрации. Особенно важно отметить способность легионелл к образованию в совокупности с другими микроорганизмами и простейшими биопленок, в которых легионеллы более устойчивы к действию дезинфицирующих веществ. В состав естественных биопленок помимо легионелл входят бактерии рода Pseudomonas, Klebsiella, Aci-netobacter и др. Важная роль в персистенции легионелл в биопленках принадлежит амебам, в которых происходит размножение легионелл [17, 22, 28].
Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю вследствие ингаляции микробного аэрозоля либо аспирации контаминированной воды попадать в нижнюю часть респираторного тракта и легкие человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых вирулентные штаммы возбудителя активно размножаются [12, 30, 31]. В условиях стационара такой путь заражения чаще всего обусловлен возрастанием восприимчивости к легионеллезу лиц со сниженной иммунологической реактивностью на фоне сопутствующих заболеваний и/или иммунодепрессив-ной терапии.
Эпидемические вспышки и спорадические случаи болезни легионеров преимущественно выявляют в местах общественного назначения: у посетителей и персонала гостиниц, торговых, спортивных и выставочных комплексов, обслуживающего персонала промышленных
предприятий, пациентов и персонала больниц, санаториев и домов отдыха, экипажей и пассажиров торговых судов. Фактором передачи служит водный мелкодисперсный аэрозоль, содержащий возбудитель и генерируемый системами водных коммуникаций.
Легионеллез выявляют повсеместно. По данным российских авторов [7,8], легионеллез составляет 5% от всех острых пневмоний среди взрослого населения Москвы, что совпадает с результатами американских исследователей: частота легионеллеза среди острых пневмоний — 2— 5%, среди атипичных пневмоний неясной этиологии — 15-20% [29].
Особое значение в последние годы уделяется случаям болезни легионеров, возникающим во время поездок, путешествий и диагностируемым по возвращению из них. Большинство таких случаев приходится на летние и осенние месяцы, инкубационный период составляет от 2 до 10 дней. Более 30% случаев спорадического легионелл еза, многочисленные эпидемические вспышки в гостиницах, на круизных судах послужили причиной создания международной системы эпидемиологического надзора за случаями легионелл еза, связанного с поездками (EWGLINET).
С точки зрения специалистов по лабораторной диагностике, легионеллез по-прежнему является труднодиаг-ностируемой инфекцией, несмотря на внедрение современных иммунологических и молекулярно-генетических методов. Возможно, что относительно невысокий уровень заболеваемости в некоторых странах связан с несовершенством применяемых методов лабораторной диагностики, приводящих к существенному недовыявлению случаев ле-гионеллеза. Основной задачей настоящего обзора является описание методов выявления легионелл, оптимальных с точки зрения их чувствительности, специфичности и доступности для практической диагностики.
Культивирование легионелл
В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний эталоном принято считать бактериологический метод. Специфичность бактериологического метода обычно достаточно высока, однако чувствительность может быть недопустимо низкой вследствие невозможности получения качественного материала для исследования, низкой концентрации возбудителя в исходном материале либо контаминации материала другими микроорганизмами или ингибиторами роста микроорганизмов. Эти обстоятельства следует обязательно учитывать при выявлении легионелл из окружающей среды, так как их концентрация, как правило, бывает невысокой. В связи с этим перед посевом на питательные среды воду и другие образцы концентрируют, фильтруют и/или подвергают специальной обработке.
Отбор проб и предварительная подготовка материала для посева
Отбор проб воды для микробиологического анализа на контаминацию легионеллами осуществляют в объеме 0,5—10 л в соответствии с требованиями действующих ГОСТов и методических указаний Российской Федерации [1,2, 6]. Важной особенностью является необходимость нейтрализации дезинфектанта (хлор), для чего используют натрия тиосульфат (20 мг N828263 на 1 л воды). Пробы биопленок берут с помощью стерильных тампонов. Срок хранения проб в холодильнике до исследования не должен превышать 48 ч.
Порядок бактериологического исследования проб воды и биопленок на наличие легионелл и интерпретация результатов исследований.
Как правило, колонизация легионеллами водных систем характеризуется относительно низкой плотностью, составляя не более 1% общей бактериальной популяции [11, 15, 19). В связи с этим для повышения чувствительности метода образцы воды, полученные из систем водоснабжения и окружающей среды, подвергают концентрации путем фильтрации и/или центрифугирования. Для подавления роста посторонней быстрорастущей микрофлоры в селективные среды для выращивания легионелл добавляются антибиотики.
В зависимости от объема и степени загрязнения проб рекомендуется выбор одного из трех методов концентрации. Для проб объемом до 1 л, полученных из систем горячего и холодного водоснабжения, характеризующихся незначительным загрязнением, рекомендуется метод вакуумной фильтрации с последующим центрифугированием (способ 1). Образцы сильно загрязненной технической воды, особенно с большим количеством отложений, примесями масла и органических растворителей, полученные из систем промышленного охлаждения, рекомендуется концентрировать путем центрифугирования (способ 2). Образцы большого объема (от 2 до 10 л и более) рекомендуется концентрировать фильтрацией под давлением с последующим центрифугированием (способ 3). При использовании биопленок и отложений в качестве материала для исследования применяется их суспендирование в солевом буфере или дистиллированной воде (способ 4).
Следует отметить, что при возникновении вспышек легионеллеза пробы могут содержать значительно большее количество легионелл, вследствие чего в таких случаях рекомендуется параллельно с концентрированными пробами производить посев материала без концентрации. В ряде случаев это может дать положительный ре-
зультат, так как при посеве концентрированных образцов рост легионелл может маскироваться массивным ростом других микроорганизмов.
Вне зависимости от способа предварительной обработки концентрированные образцы рекомендуется хранить не менее 12 мес при температуре 6 ± 2°С для повторных исследований в случае необходимости.
Рекомендуемый порядок проведения исследования проб воды и биопленок приведен на схеме.
Способ 1. Концентрирование путем вакуумной фильтрации
Образцы воды взбалтывают и фильтруют через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, после чего фильтр стерильным пинцетом извлекают из воронки и переносят в полиэтиленовый пакет, в который предварительно наливают 10 мл солевого буфера. Бактерии смывают с фильтра путем перетирания пакета с фильтром и раствором между большим и указательным пальцами в течение не менее 30 с, после чего стерильной пипеткой переносят всю жидкость из пакета в стерильную центрифужную пробирку.
Пробирку центрифугируют при 3000 & в течение 30 мин (либо при 6000 g в течение 10 мин) при комнатной температуре, после чего стерильной пипеткой (очень осторожно, не затрагивая осадок!) удаляют супернатант, оставляя в пробирке осадок (1 мл), который суспендируют на вортексе и используют для посева.
Способ 2. Концентрирование путем центрифугирования
Перед началом исследования воду взбалтывают. Центрифугирование проводят в стерильных центрифужных
пробирках с закручивающимися крышками объемом 300 мл при 3000 § в течение 30 мин (либо при 6000 g в течение 10 мин) при комнатной температуре. Для обработки проб воды большего объема их разливают по нескольким пробиркам. После осторожного удаления супернатанта осадок ресуспендирует в 2 мл солевого раствора. Полученный образец используют для посева на среды.
Способ 3. Концентрирование путем фильтрации под давлением
Перед началом работы все части системы для фильтрации (трубки, клапаны и стеклянные фильтры) должны быть простерилизованы путем пропускания через систему кипящей дистиллированной воды в течение как минимум 5 мин. Затем образец воды фильтруют через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. В случае сильно загрязненных проб воды в системе перед нейлоновым фильтром рекомендуется установка дополнительного пористого стеклянного фильтра.
После завершения фильтрации нейлоновый фильтр стерильным пинцетом переносят в полиэтиленовый пакет, в который предварительно налит солевой раствор в количестве 1/100 объема исходного образца. Дальнейшую обработку проводят аналогично способу 1.
Способ 4. Подготовка к посеву образцов биопленок и отложении
Рыхлые влажные образцы биопленок и отложений необходимо тщательно перемешать и развести стерильной дистиллированной водой или солевым раствором в соотношении 1:10 либо 1:100 (необходимо записать разведение и использовать его в дальнейшем при вычислении показателя КОЕ/мл). Если образец очень плотный, его необходимо взвесить и добавить растворитель (воду или солевой раствор) в соотношении 1:10 вес/объем.
После добавления воды или солевого раствора образец необходимо перемешать многократным встряхиванием на вортексе с добавлением 1 см3 стеклянных бус для обеспечения наиболее эффективного суспендирования. Подготовленный таким образом материал можно использовать для посева с предварительной его деконтами-нацией.
Для подавления роста посторонней микрофлоры, всегда присутствующей в воде или биопленках, сконцентрированный материал подвергают деконтаминации путем обработки кислотой либо нагреванием [24]. Такая обработка может в ряде случаев привести к гибели части или всех легионелл, в связи с чем для повышения чувствительности метода проводят также посев необработанного концентрированного материала [3, 19]. Таким образом, исходный концентрат делят на три части, одну из которых обрабатывают кислотным буфером (1), другую — нагреванием (2), а третью оставляют без обработки (3).
1. Из концентрированной взвеси, полученной любым из четырех вышеописанных способов, отбирают пипеткой со стерильным наконечником 200 мкл материала и помещают в пластиковую пробирку с закручивающейся крышкой, куда добавляют 200 мкл кислотного буфера. Обработку кислотой проводят в течение 5 мин точно, после чего хорошо перемешивают содержимое пробирки, отбирают 200 мкл и производят посев на чашки с агаром СУРС.
2. Вторую пробирку с 200 мкл концентрированного материала помещают в водяную баню и выдерживают при температуре 50°С в течение 30 мин. Непосредственно после тепловой обработки образец несколько раз встряхивают, остужают, отбирают 100 мкл и производят посев.
3. Посев необработанного концентрата производят в количестве 100 мкл на чашки с агаром вУРС.
Приготовление растворов
1. Солевой буфер для элюирования бактерий с фильтров (рН 6,8).
Натрия хлорид NaCl — 120 мг, магния сульфат пяти-водный Mg2S04 • 5Н20 — 4 мг, кальция хлорид двухвод-ный СаС12 • 2Н20 — 4 мг, натрия гидрофосфат Na2HP04 — 142 мг, дигидрофосфат калия КН2Р04 — 136 мг. Все компоненты смешивают и доводят дистиллированной водой до 1 л.
2. Кислотный буфер для деконтаминации образцов.
Вначале готовят 0,4 М растворы соляной кислоты и
хлорида калия.
Для приготовления кислотного буфера смешивают 39 мл 0,4 М раствора соляной кислоты и 250 мл 0,4 М раствора КС1, после чего доводят значение рН до 2,2 путем осторожного добавления 1 М раствора калия гидроксида. Кислотный буфер хранят в плотно закрытой посуде в защищенном от света месте при комнатной температуре не более 1 мес.
Среды для культивирования легионелл
Питательной средой, на которой впервые успешно выделены легионеллы, был угольно-дрожжевой агар с добавками L-цистеина и пирофосфата железа [16]. В дальнейшем состав среды дополнили 1М-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновой (ACES) и а-кетоглутаровой кислотами [14]. Основными средами для бактериологической диагностики легионеллеза в настоящее время являются плотные агаризованные питательные среды на основе дрожжевого экстракта и активированного угля с добавками а-кетоглутаровой кислоты, ACES, пирофосфата железа и L-цистеина и ряда антибиотиков. Смеси для приготовления питательных сред GVPC, GVPN, ВМРА, BCYEa производятся многими зарубежными фирмами, однако могут быть приготовлены и в условиях лаборатории. В России среды для выращивания легионелл (ЛегионелБакАгар на основе гидролизата рыбной муки с L-цистеином) производятся в ГНЦ Прикладной микробиологии (Оболенск), Ростовском противочумном институте и ряде других учреждений. Выбор среды зависит главным образом от исходного материала для исследования [23].
Ниже приводятся состав и особенности приготовления сред, которые могут использоваться в практических лабораториях для культивирования легионелл.
Среда ВСУЕа-(угольно-дрожжевой агар без L-цистеина) не поддерживает рост легионелл и наряду с кровяным агаром используется как контрольная среда на этапе подтверждения выделения легионелл из исследуемого материала. Среду готовят путем последовательного растворения компонентов (экстракт дрожжевой — 10 г; уголь активированный — 2 г; калия гидроксид (КОН) — 2,8 г; железа пирофосфат растворимый — 0,25 г; ACES-буфер (N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновая кислота) — 10 г; агар — 13 г) в 980 мл дистиллированной воды, после чего объем смеси доводят до 1 л и автоклавируют 10 мин при температуре 110°С, затем охлаждают до 50°С на водяной бане и добавляют 1 г сухого кетоглутарата калия. Среду быстро разливают на чашки, слегка взбалтывая флакон для равномерного распределения активированного угля. Разлитая среда хранится в пластиковых или металлических контейнерах в холодильнике не более 2 нед.
Среда BCYEa + (угольно-дрожжевой агар с L-цистеином) содержит L-цистеин, поддерживающий рост легионелл, и является важнейшей селективной средой для их выращивания и идентификации. Приготовление среды аналогично среде BCYEa-, за исключением того, что в готовую охлажденную среду добавляют стерильный раствор L-цистеина (0,4 г L-цистеина растворяют в 10 мл
дистиллированной воды и фильтруют через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм).
Среда GVPC (агар с глицином, ванкомицином, полыми к-сином и циклогексимидом) используется для выделения культур легионелл при первичном посеве воды, биопленок и других образцов из внешней среды. Приготовление среды аналогично среде BCYEa-, за исключением того, что перед автоклавированием к смеси добавляют 80 мг циклогексимида и 3 г глицина. Смесь автоклавируют 10 мин при температуре 110"С, затем охлаждают до 50°С на водяной бане и добавляют стерильно 1 г сухого кетог-лутарата калия, а также свежеприготовленные на деио-низированной воде растворы ванкомицина (1 мг в 10 мл), полимиксина М сульфата (9,6 мг в 10 мл) и L-цис-теина (0,4 г в 10 мл), профильтрованные через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Среда GVPN отличается от среды GVPC тем, что вместо циклогексимида в ее состав входит натамицин (50 мг/л).
Посев и культивирование
Посев материала, полученного после концентрации и/или деконтаминации, производят в количестве 100 мкл путем равномерного распределения материала по поверхности агара стерильным шпателем. После посева чашки помещают в термостат (с увлажнением) и инкубируют при температуре 36'С. В ряде случаев инкубация в атмосфере с повышенным содержанием углекислого газа (2,5%) может улучшить чувствительность метода. Чашки инкубируют в течение 14 дней, при этом их рекомендуется просматривать по истечении 1, 3, 6 и 10-х суток. При отсутствии специфических колоний на 14-й день выдается отрицательный результат.
Колонии легионелл могут появиться не ранее, чем через 36 ч после посева. Массивный рост неспецифической флоры, который может появиться уже после 24 ч инкубации, маскирует колонии легионелл и свидетельствует о контаминации исходного материала. В этом случае необходимо развести исходную концентрированную взвесь в 10, 100 или 1000 раз, повторно подвергнуть термальной и кислотной обработке и снова провести посев на чашки с агаром GVPC.
Подозрительные колонии просматривают на чашках с помощью бинокулярного стереомикроскопа. При просмотре в косом свете колонии легионелл имеют очень характерный вид матового стекла с перламутровым отливом. Как правило, колонии имеют ровные края, могут быть белого, серо-голубого, светло-пурпурного, реже коричневого, лимонного или ярко-красного цвета. Дополнительное подтверждение принадлежности выросших на среде GVPC колоний к роду Legionella может быть получено при выявлении их аутофлюоресценции при облучении УФ-излучением длиной волны 366 нм. При этом бело-голубая флюоресценция наблюдается у видов L. boze-manii, L. gormanii, L. dumoffii, L. anisa и ряда других, в то время как L. erythra и L. rubrulucens характеризуются ярко-красным свечением. Наиболее распространенный вид L. pneumophila свойством аутофлюоресценции не обладает, его колонии в УФ-свете имеют матовый зеленоватый или желтоватый цвет. Для изучения морфологии микроорганизмов в подозрительных колониях мазки окрашивают по Граму. Легионеллы представляют собой типичные грамотрицательные палочки, нередко с фила-ментами.
Для определения количества легионелл (КОЕ/л) в исходном образце необходимо произвести подсчет колоний на каждой из трех чашек, полученных при посеве материала, приготовленном тремя различными способами. На стандартной чашке Петри достоверно удается подсчитать не более 150 колоний. Если колоний больше, требуется развести исходный концентрированный материал 1:10 либо 1:100 и снова посеять на агар GVPC. Вы-
числение показателя КОЕ/л производят по следующей формуле
г _ N■ V 1
с ~Г s'
где С — показатель КОЕ/л в исходной пробе воды; N — количество колоний на чашке; V — объем буфера, используемого для элюирования бактерий с поверхности фильтра (либо для суспендирования материала после центрифугирования), мл; I— объем инокулята на чашку, мл; S — объем исходного образца, л.
Для вычисления показателя КОЕ/л должна использоваться та чашка, на которой выросло максимальное количество колоний. Запрещается вычислять средний показатель по трем чашкам, на которые производился посев материала, деконтаминированного различными способами. Вычисление показателя КОЕ/л для биопленок не проводят.
Для повышения специфичности бактериологической диагностики и подтверждения наличия легионелл производят пересев двух-трех колоний, выросших на среде GVPC, параллельно на питательные среды BCYEa+ и BCYEa-, первая из которых поддерживает рост легионелл (см. схему). Чашки с посевами инкубируют в термостате при 36°С в течение по меньшей мере 2 сут. При наличии роста микроорганизмов на чашке со средой ВС-YEa+ и его отсутствии на чашке со средой BCYEa- результат исследования считается положительным и выдается предварительный ответ о наличии легионелл в исследуемом образце с указанием КОЕ/л. Для подтверждения предварительных результатов полученная культура пересевается на скошенный BCYEa+ агар и пересылается в референс-лабораторию для верификации результатов бактериологическими, иммунологическими и моле-кулярно-генетическими методами и выдачи окончательного ответа. Национальная референс-лаборатория по диагностике легионеллеза в России находится в НИИЭМ им. Гамалеи (Москва).
Помимо невысокой чувствительности главным недостатком культурального метода является его длительность, так как положительный ответ может быть выдан не ранее чем через 3—5 сут, а отрицательный — обычно на 14-е сутки. Для ускоренного скрининга образцов воды из окружающей среды и искусственных водных систем в ряде зарубежных лабораторий начато внедрение новых тест-систем (Dynal Biotech, США), основанных на применении антител, сорбированных на магнитных частицах [37]. Тем не менее бактериологический метод остается одним из основных в диагностике и эпидемиологии легионеллеза, в особенности при идентификации видов легионелл, отличных от L. pneumophila.
Определение видов легионелл
Для идентификации видов рода Legionella на материале чистых культур в условиях диагностических лабораторий применяются комплексы фенотипических, серологических либо молекулярно-генетических тестов.
Фенотипические тесты. Фенотипические тесты основаны, как правило, на особенностях биохимии и метаболизма отдельных видов легионелл, в частности на наличии каталазопероксидазной и оксидазной активности, способности разжижать желатин, гидролизе гиппурата натрия и крахмала, продукции ацетона, а также на исследованиях спектров флюоресценции колоний и среды, на которой они выросли [6, 8, 18]. Легионеллы не ферментируют углеводы, разжижают желатин, не образуют уреазу, не восстанавливают нитраты, положительны в пробе на катал азу, вариабельны в пробе на оксидазу. При идентификации легионелл фенотипические тесты имеют ограниченное применение в связи со значительным сходством биохимических свойств разных видов [8].
Серологические методы. Одним из наиболее надежных и специфичных методов является серологическая идентификация выросших колоний легионелл с использованием реакции агглютинации при действии специфических антисывороток. Последние получают путем иммунизации кроликов различными видами и сероварами легионелл [33]. Наборы антисывороток для идентификации всех известных видов и сероваров легионелл методом агглютинации на предметных стеклах производятся, например Центром по контролю за инфекциями (Атланта, США), однако практическое применение данного метода ограничено из-за его сложности, дороговизны, трудностей транспортировки и хранения полного набора антисывороток.
Гораздо проще в исполнении метод латекс-агглюти-нации, в котором антитела к определенным видам и се-роварам легионелл сорбированы на пористой поверхности микроскопических латексных шариков, что позволяет легко наблюдать реакцию агглютинации. Коммерческие наборы, в которых используется данный принцип, выпускаются фирмой "Oxoid" (Великобритания) и позволяют эффективно дифференцировать 14 сероваров вида L. pneumophila, а также серовары 1 и 2 L. longbeachae, се-ровары 1 и 2 L. bozemanii и виды L. dumoflii, L. gormanii, L. jordanis, L. micdadei, L. anisa [26, 35]. Действующими в России методическими рекомендациями предусмотрено проведение тестов на определение сероваров 1 и сероваров 2—14 L. pneumophila методом латекс-агглютина-ции на предметных стеклах [6]. Разрабатываемые в настоящее время тест-системы на основе моноклональных антител позволят в будущем преодолеть проблемы, связанные с перекрестными реакциями между сероварами и различными видами легионелл [20, 21, 32].
Молекулярно-генетические методы. Молекулярно-ге-нетические методы характеризуются наиболее высокой специфичностью, однако их серьезным недостатком является требовательность к квалификации персонала, оборудованию лаборатории и высокая стоимость. Важным фактором, который необходимо учитывать в повседневной работе, является возможность ложноположи-тельных результатов за счет контаминации ампликонами либо ДНК возбудителя. В связи с этим любую ПЦР-ди-агностику необходимо проводить в строгом соответствии с действующими нормативными документами [5]. Чувствительность молекулярно-генетических методов достаточно высока, однако значительно варьируется в зависимости от концентрации возбудителя в исходном материале и способа его обработки.
Наиболее точными молекулярно-генетическими методами видоидентификации легионелл являются методы ДНК-ДНК-гибридизации (основан на анализе нуклео-тидных последовательностей исследуемого штамма в сравнении с известными сероварами и видами легионелл) и секвенирования специфических генов, например гена mip [17, 27]. Международная база данных последовательностей гена mip различных видов легионелл поддерживается Европейской рабочей группой по легионел-лезу (EWGLI) и доступна на сайте Агентства по защите здоровья Великобритании (НРА) по адресу http:// www.hpa.oig.uk/cfi/bioinformatics/ ewgli/legionellamips.htm. Следует отметить, что указанные методы доступны в основном лабораториям научно-исследовательских институтов и применяются главным образом в фундаментальных исследованиях.
Молекулярно-генетические методы диагностики ле-гионеллеза, применяемые в практической лабораторной диагностике, основаны на применении ПЦР, либо ПЦР в сочетании с другими методами (гибридизация). Принцип ПЦР позволяет добиться 100% специфичности за счет правильного выбора фрагмента ДНК для амплификации и удачного подбора прямого и обратного прайме-ров, фланкирующих выбранный участок, при этом воз-
можно создание тест-систем как для идентификации каждого вида легионелл в отдельности (видоспецифиче-ские праймеры), так и всех видов в совокупности (родос-пецифические праймеры) [4, 13].
Наиболее простым, однако наименее информативным, методом является качественное определение наличия ДНК патогена в пробах воды, которое может быть выполнено в течение нескольких часов. При этом грубые препараты ДНК (клеточные лизаты) выделяются из предварительно сконцентрированных образцов методами сорбции на пористых носителях и исследуются с использованием коммерческих тест-систем, выпускаемых в том числе российскими производителями ("ДНК-Технология", "Литех" и др.). Для учета результатов используют электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле [6].
Следует отметить, что качественную ПЦР рекомендуется использовать главным образом для предварительного скрининга образцов воды, так как высокая чувствительность реакции и широкое распространение не-культивируемых форм легионелл, не представляющих опасности для человека, не позволяет оценить уровень контаминации легионеллам объектов окружающей среды и промышленных установок.
Более перспективным, точным и специфичным методом является исследование проб с помощью количественной ПЦР в реальном времени [25, 36]. Этот метод позволяет сократить время анализа по сравнению с бактериологическим методом с 7—10 до 1—2 сут. В противоположность качественной ПЦР ПЦР в реальном времени с флюоресцентными зондами может применяться для мониторинга объектов окружающей среды и оценки степени их контаминации легионеллами. Анализ выделенной ДНК проводят в специальном амплификаторе отечественного или зарубежного производства с учетом результатов в режиме реального времени. Расчет количества ДНК легионелл в исследуемом образце проводят в соответствии с инструкцией по использованию тест-системы, окончательный результат представляют в виде числа геномных копий на 1 л воды. При положительном ответе, свидетельствующем о наличии в пробе легионелл в количестве 1 • 103 геномных копий на 1 л и выше, необходимо дальнейшее его подтверждение выделением культуры возбудителя.
Заключение
Проведение мониторинга воды и биопленок на наличие Legionella pneumophila является важнейшей составной частью санитарно-эпидемиологического мониторинга объектов окружающей среды, промышленных и общественных зданий, систем водоснабжения и кондиционирования транспортных средств, санаторно-ку-рортных и лечебных учреждений. Он позволяет определить степень их контаминации возбудителем, дать оценку качеству и эффективности обслуживания указанных систем и объектов, а также при необходимости принять неотложные меры, направленные на улучшение санитарного состояния. Такой мониторинг проводится в целях профилактики болезни легионеров и обеспечения безопасности здоровья населения Российской Федерации.
Предложенный алгоритм проведения исследований по выделению и идентификации легионелл из объектов внешней среды может быть рекомендован для использования в лабораториях учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации, осуществляющих контроль за объектами окружающей среды, а также в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности объектов окружающей среды на наличие возбудителя болезни легионеров.
Л ите ратура
1. ГОСТ 51592-2000. Вода. Общие требования к отбору проб. — М., 2000.
2. ГОСТ 51593-2000. Вода питьевая. Отбор проб. -М., 2000.
3. Красовський В. В., Шагун В. Г., Тимченко О. М., Пожил С. I. // Ann. Mechnicov's Inst. — 2005. — N 2. — P. 27-34.
4. Куличенко A. H., Кутырев В. В., Саяпина JI. В. // Тезисы к IV Всероссийской науч.-практ. конф. "Генодиагностика инфекционных заболеваний". — М., 2002. - С.
5. МУ 1.3.1888—04. Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного патогенными биологическими агентами III—IV групп патогенности: Метод, указания. — М., 2004.
6. МУК 4.2. 2217—07. Методические рекомендации по выявлению бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды. — М., 2007.
7. Прозоровский С. В., Покровский В. И., Тартаковский И. С. Болезнь легионеров (легионеллез). — М., 1984.
8. Тартаковский И. С., Синопальников А. И. // Клин, микробиол. и антимикроб, тер. — 2001. — Т. 3, № 1. -С. 4-16.
9. Bartlett С. L., Dowel IS. F, Mandell L. А. // Clin. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 31. - P. 347-382.
10. Bergey D. H., Holt J. G. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. — Baltimore, 1984. — Vol. 4.
11. Buesching W. J., Brust R. A., Ayers L. W. Ц J. Clin. Microbiol. - 1983. - Vol. 17, N 6. - P. 1153-1155.
12. Cianciotto N. P. // Int. J. Med. Microbiol. — 2001. — Vol. 291, N 5. - P. 331-343.
13. Den Boer J. W., Yzerman E. P. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 23, N 12. - P. 871-878.
14. Edelstein P. H. //J. Clin. Microbiol. - 1981. - Vol. 14, N 3. - P. 298-303.
15. Edelstein P. H., Snitzer J. В., Bridge J. A. // J. Clin. Microbiol. - 1982. - Vol. 16, N 6. - P. 1061-1065.
16. Feeley J. C., Gibson R. J., Gorman G. W. et al. I I J. Clin. Microbiol. - 1979. - Vol. 10, N 4. - P. 437-441.
17. Fields B. S., Benson R. F, Besser R. E. // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 15, N 3. - P. 506-526.
18. Fox K. F., Brown A. // J. Clin. Microbiol. - 1989. -Vol. 27, N 9. - P. 1952-1955.
19. Health and Safety Commission and Executive, Legionnaire's Disease. The Control of Legionella Bacteria in
Water Systems. Approved Code of Practice and Guidance. - 2000.
20. Helbig J. H., Uldum S. A., Luck P. C., Harrison T. G. // J. Med. Microbiol. - 2001. - Vol. 50, N 6. - P. 509-516.
21. Jimenez-Lucho V., Shulman M., Johnson J. // J. Clin. Microbiol. - 1994. - Vol. 32. - P. 3095-3096.
22. Kuiper M. W., Wullings B. A., Akkermans A. D. et al. // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol. 70, N 11. -P. 6826-6833.
23. Luck P. C., ¡gel L., Helbig J. H. et al. // Int. J. Hyg. Environ. Hlth. - 2004. - Vol. 207, N 6. - P. 589-593.
24. Martinelli F., Caruso A., Moschini L. et al. // Curr. Microbiol. - 2000. - Vol. 41, N 5. - P. 374-376.
25. Monis P. Т., Giglio S., Keegan A. R., Andrew Thompson R. С. Ц Trends Parasitol. - 2005. - Vol. 21, N 7. -P. 340-346.
26. Murdoch D. R. // Clin. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 36, N 1. - P. 64-69.
27. RatcliffR. M., LanserJ. A., Manning P. A., Heuzenroeder M. W. U J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36, N 6. - P. 1560-1567.
28. Rogers J., Dowsett А. В., Dennis P. J. et al. I I Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - Vol. 60, N 5. - P. 1585-1592.
29. RoigJ., Sabria M., Pedro-Botet M. L. // Curr. Opin. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 16, N 2. - P. 145-151.
30. Steinert M., Hentschel U., Hacker J. // FEMS Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 26, N 2. - P. 149-162.
31. Steinert M., Heuner K., Buchrieser C. et al. // Int. J. Med. Microbiol. — 2007.
32. Steinmetz I., Rheinheimer C., Hubnerl., Bitter-Suermann D. Ц J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol. 29, N 2. -p. 346—354.
33. Thacker IV.'L., Plikaytis В. В., Wilkinson H. W. // J. Clin. Microbiol. - 1985. - Vol. 21, N 5. - P. 779-782.
34. Tossa P., Deloge-Abarkan M., Zmirou-Navier D. et al. // BMC Publ. Hlth. - 2006. - Vol. 6. - P. 112.
35. Uzel A., Ucar F, Hames-Kocabas E. E. // APMIS. -2005. - Vol. 113, N 10. - P. 664-669.
36. Wittwer С. Т., Reed G. H., Gundry C. N. et al. // Clin. Chem. - 2003. - Vol. 49, N 6, Pt 1. - P. 853-860.
37. Yanez M. A., Carrasco-Serrano C., Barbera V. M., Catalan V. //Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - Vol. 71, N 7. - P. 3433-3441.
Поступила 10.12.07
С Н. В. ДУДЧИК, 2009 УДК 614.72:615.91-07»
Н. В. Дудчик
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОБИОТЕСТИРОВАНИЯ ПРИ ОЦЕНКЕ ТОКСИЧНОСТИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ
ГУ Республиканский научно-практический центр гигиены, Минск, Беларусь
Антропогенное химическое загрязнение окружающей среды — одна из важнейших эколого-гигиенических проблем современности. Высокий уровень химической нагрузки на среду обитания и человека отмечается прежде всего на территориях с развитой энергетической, химической, деревоперерабатывающей и другими отраслями промышленности. По мнению ряда авторов, такие регионы испытывают значительные многофакторные химические нагрузки, что приводит к ухудшению состояния окружающей среды и здоровья населения. Результаты микробиологических, почвенно-экологических, гидробиологических исследований показали критическое значение микробиоты в поддержании экологического
равновесия, обмена веществ в природе, биодеградации химических токсикантов разной природы. Показано, что биохимические, физиологические и генетические свойства про- и эукариотических микроорганизмов позволяют рассматривать их в качестве перспективных альтернативных тест-моделей при разработке системы оценки токсичности и биологического действия потенциально опасных химических веществ или их сложных смесей, а также оценки контаминации объектов окружающей среды. Преимуществами таких методов являются низкая стоимость, получение быстрого ответа на токсическое воздействие, возможность оценки большого числа проб, работа с небольшими объемами проб, портативность,
