CC BY
53
УДК [579.842:616.24-002](571.63)
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ РОДА LEGIONELLA, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ ПРИМОРСКОГО КРАЯ
© 2015 г. 1,2А. В. Мартынова, 3Л. А. Балабанова, 2Е. А. Богатыренко, 2Л. С. Бузолева
1 Тихоокеанский государственный медицинский университет, 2Школа естественных наук Дальневосточного федерального университета, Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г. Б. Елякова Дальневосточного отделения РАН,
г. Владивосток
Распространение микроорганизмов рода Legionella является значимой проблемой экологии микроорганизмов, так как эти микроорганизмы, являясь широко распространенными, остаются одними из самых сложно культивируемых. В настоящее время известно около 27 видов легионелл, однако практический и значимый для здоровья человека интерес представляют данные о распространенности такого возбудителя, как Legionella pneumophilla, способного вызвать у человека целый ряд заболеваний, наиболее опасным из которых является легионеллезная пневмония.
С целью мониторинга распространения штаммов рода Legionella в природных и антропогенных экосистемах для выявления роли штаммов Legionella pneumophilla было исследовано 150 проб, полученных из природных (75 проб) и антропогенных (75 проб) экосистем с выделением штаммов рода Legionella на селективной среде. Штаммы Legionella pneumiohila идентифицировались ПЦР реакцией. В результате штаммы рода Legionella были выявлены в 37,7 % (28 проб из 75) всех проб, полученных из природных экологических ниш, и в 33,3 % (25 проб из 75) проб, полученных из антропогенных экологических ниш. Значимых различий в распространении штаммов с учетом сезонности выявлено не было. Изучение микробиоценоза природных и антропогенных экосистем позволяет считать, что штаммы рода Legionella играют в ассоциации микроорганизмов водных экосистем значительную роль.
Ключевые слова: микроорганизмы рода Legionella, легионеллезная инфекция, внебольничная пневмония, сапронозы
ECOLOGICAL CHARACTERISTIC OF LEGIONELLA GENUS STRAINS ISOLATED IN TERRITORY OF PRIMORSKY AREA
1,2А. V. Martynova, ^.А. Balabanova, 2Е. А. Bogatyrenko , 2L. S. Buzoleva
1Pacific State Medical University, 2School of Natural Sciences of Far Eastern Federal University
3G. B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry of Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences,
Vladivostok, Russia
The spread of microorganisms of Legionella genus is a significant problem of ecology of microorganisms. Being widely spread, these microorganisms remain uncultivated. The aim of our research was to reveal spreadштп of microbes of Legionella genus in natural and anthropogenic ecosystems in order to define the role of Legionella pneumophilla. Methods: we studied 150 samples received from the natural (75 samples) and anthropogenic (75 samples) ecosystems. The strains of Legionella pneumophilla were identified with PCR. Results: the strains of Legionella genus were identified in 37.7 % (28/75) of all samples obtained from the natural ecological niches and in 33.3 % (25/75) of the samples obtained from the anthropogenic ecological niches. Discussion of the results: the Legionella strains play a significant role in the association of water microorganisms.
Keywords: microorganisms of genus Legionella, Legionella infection, community-acquired pneumonia, sapronoses
Библиографическая ссылка:
Мартынова А. В., Балабанова Л. А., Богатыренко Е. А., Бузолева Л. С. Экологическая характеристика штаммов рода Legionella, выделенных на территории Приморского края // Экология человека. 2015. № 10. С. 14-17.
Martynova А. V., Balabanova L. А., Bogatyrenko Е. А., Buzoleva L. S. Ecological Characteristic of Legionella Genus Strains Isolated in Territory of Primorsky Area. Ekologiya cheloveka [Human Ecology]. 2015, 10, pp. 14-17.
Несмотря на внимание микробиологов к изучению микробиологических особенностей микроорганизмов-возбудителей инфекций дыхательных путей, микробиологические особенности таких микроорганизмов, как легионеллы, до сих пор остаются недооцененными. Одним из аспектов, определяющих некоторые «пробелы» в представлениях об их микробиологии, являются данные об экологической характеристике распространения этих микроорганизмов на территории Российской Федерации, в том числе и с учетом регионального компонента. Это связано как с объектив-
ными сложностями микробиологической диагностики легионелл, поскольку культивирование их требует специальных сред и условий, не всегда доступных в рутинной практике, так и с недостатком информации о возможности идентификации этих микроорганизмов в различных экологических нишах вообще [1—3].
Таким образом, проблемой общебиологического направления является прежде всего отсутствие данных о распространенности микроорганизмов рода Legionella в различных экологических нишах как природного, так и антропогенного характера. Учитывая
тот факт, что в настоящее время выделяют около 27 видов легионелл, каждый из которых обладает своими видовыми экологическими особенностями, значимость идентификации среди всех легионелл такого вида, как Legionella pneumophila, является неоспоримой, так как именно этот возбудитель вызывает такие заболевания, как пневмония, понтиакская лихорадка и т. п. Распространение данного микроорганизма в составе ассоциаций других микроорганизмов в различных экологических нишах в условиях Российской Федерации остается малоизученным [4, 5].
Классическим представлением является тот факт, что легионеллы широко распространены в природных водоёмах, где они паразитируют в организме водных амёб и не представляют существенной опасности для человека. В инженерно-технических сооружениях, связанных с циркуляцией воды (поверхности труб и оборудования систем водоснабжения, градирен, систем кондиционирования и увлажнения воздуха), концентрация легионелл резко возрастает за счёт образования биоплёнок, что является ключевым фактором накопления потенциально опасных концентраций возбудителя. В сочетании с возможностью аэрогенного распространения или аспирации возбудителя возникает угроза возникновения эпидемии легионеллёза (обычно возникают в местах массового скопления людей). Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю инфекции проникать в нижнюю часть респираторного тракта и легкие человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых легионеллы активно размножаются [6—8].
Сложность количественной оценки легионелл в сочетании с высокой устойчивостью к дезпрепаратам в перечисленных водных объектах создает существенные трудности в оценке потенциальной опасности данных систем и проведении профилактических мероприятий.
Цель исследования — провести мониторинг распространения штаммов рода Legionella в природных и антропогенных экосистемах для выявления роли штаммов Legionellapneumophilla в структуре штаммов семейства Legionellaceae, выделенных в природных и техногенных (антропогенных) экосистемах.
Методы
Нами было исследовано 150 проб воды (собранных в период с октября 2011 по сентябрь 2012 года) на территории Приморского края в природных (75 проб, ключ, ручей, родник) и антропогенных (75 проб, водопровод горячего и холодного водоснабжения на территории г. Владивостока) экологических нишах. Образцы объемом 1 000 мл предварительно фильтровали на стеклянной воронке через стерильный ватно-марлевый фильтр. При проведении микробиологического анализа по 0,1 мл концентрированного, обработанного кислотным буфером и прогретого при 50 °С образца высевают на чашки со средой БУДРАГ
(BCYE, Национальный научно-производственный центр генно-инженерных препаратов, Россия) с ростовой и селективной добавкой. Образец распределялся по поверхности питательной среды шпателем или стеклянной палочкой. Чашки инкубируют при 37 °С до 10 дней во влажной атмосфере и в присутствии 2,5 % С02. Подозрительные на легионеллы колонии выявляют при стереомикроскопическом просмотре чашек или под лупой. На селективной среде колонии легионелл обычно имеют вросший центр, гранулярную или блестящую поверхность, серовато-голубоватую, иногда зеленоватую окраску. Колонии легионелл на 3—5-е сутки небольшие, диаметром 1—2 мм, плосковыпуклые, гладкие с острым краем. Для идентификации бактерий рода Legionella spp. использовали окраску мазков по Граму и посев на среду БУДРАГ без селективной и ростовой добавок, на которой колонии легионелл не вырастают. Идентифицированные подобным образом колонии относят к роду Legionella. Типичные для Legionella spp. колонии подсчитывают количественно для последующего определения количества легионелл в 1 л воды. Для биопленок, в которых возбудитель присутствует, как правило, в высоких концентрациях, проводят только качественную оценку обсемененно-сти. Для быстрой идентификации бактерии Legionella pneumophila используют латекс-агглютинацию с моновалентными и групповыми сыворотками и метод флуоресцирующих антител. В случае необходимости принадлежность выделенной культуры к виду Legionella pneumophila определяют с помощью полимеразной цепной реакции с видоспецифичными праймерами: F: 5'GTATCCGATTTTCCGGGTTT3'; R:5'TTTGATGGCAAAGCGTACTG3', P: JOE_ CAACGCCTGGCTTGTTTTTG-BHQ1 [4, 8].
В работе были применены критерии параметрической статистики (критерий Стьюдента) после проведения нормальности распределения (критерий Колмогорова — Смирнова). Для оценки качественных данных нами использованы частотные характеристики с расчетом доверительного 95 % интервала (95 % ДИ) по методу Вальда (применялся он-лайн калькулятор, разработанный Jeff Sauro http://www. measuringusability.com/wald.htm), также указывались верхние и нижние границы доверительного интервала. При проверке статистических гипотез нами был выбран критический уровень значимости а = 0,05 (p < 0,05) [1].
Результаты
Нами были исследованы образцы воды, взятые из водных экосистем, связанных с водопроявлени-ями различного характера: природными — 75 проб (ключ, ручей, родник) и антропогенными — 75 проб (водосброс ТЭЦ, трубы холодного и горячего водоснабжения, шланги душа и т. п.).
Исследуемые пробы сгруппированы в группы природных и техногенных водопроявлений. Из каждого источника было взято по 3 пробы начиная с октября
с интервалом в 3 месяца — октябрь, февраль, июнь, всего было обследовано 25 точек забора в природных и 25 точек забора в антропогенных экосистемах..
При проведении исследования штаммы рода Legionella были выявлены в 28 из 75 проб, что составило 37,7 (95 % ДИ: 28-48) % всех проб, полученных из природных экологических ниш, и в 33,3 (95 % ДИ: 23-44) % (25 из 75) проб, полученных из антропогенных экологических ниш. Значимых различий в распространении штаммов с учетом сезонности выявлено не было: в октябре в природных эконишах позитивными были 10,6 (95 % ДИ: 5-19) % (8 из 75) проб, в антропогенных - 12,0 (95 % ДИ: 6-21) % (9 из 75); в февральских пробах в природных эконишах — 12,0 % (9 из 75) и в антропогенных также 12,0 % (9 из 75), в июньских пробах в природных источниках - 10,6 (95 % ДИ: 5—19) % (8 из 75) и в антропогенных 13,3 (95 % ДИ: 7-23) % (10 из 75).
При анализе структуры микробиоценоза природных водных экосистем мы обнаружили образующиеся при культивировании классические голубовато-серые колонии, принадлежащие к роду Legionella. Кроме того, заметен сливной рост колоний, скорее всего принадлежащих к роду Acinetobacter или Pseudomonas как микроорганизмам единственных родов, которые могут расти на данной селективной среде (таблица).
Результаты бактериоскопии образцов воды, выделенных в различных водопроявлениях
Источник (место отбора проб) Legionella spp. Staphylococcus spp. Cyano-bacteria Артефакт
Ключ Широкий (Партизанский р-н) 2х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Родник в п. Лазовый (Партизанский р-н) 1х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Ручей Лазовик (Партизанский р-н) 1х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Кран холодной воды (Партизанский р-н) 5х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Водосброс с партизанской ГРЭС 1х10-6 10-6 10-!-10-6 +
Родник (г. Владивосток, пр. Красного знамени, 96) 16х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Конденсат (подземный переход в центре Владивостока) 10х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Русло р. Объяснений (Владивосток, стоки ТЭЦ-2) 5х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Стоки в озеро в р-не бух. Патрокл) 3х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Родник (Владивосток, р-н Снеговая падь) 4х10-6 10-6 10-1-10-6 +
Кран холодной воды (Владивосток) 9х10-6 10-1-10-6 -
Из представленных данных очевидно, что штаммы рода Legionella присутствуют практически во всех изучаемых образцах, что подтверждает актуальность исследуемого нами вопроса и дает возможность пред-
полагать особую экологическую роль этих микроорганизмов.
При анализе распространения штаммов Legionella pneumophila среди всех штаммов легионелл, выделенных нами, мы выяснили, что среди штаммов, выделенных в природных экологических нишах, этот возбудитель составляет 14,28 (95 % ДИ: 5-35) % (4 штамма из 28) и среди выделенных в антропогенных источниках - 16,0 (95 % ДИ: 5-35) % (4 штамма из 25).
Обсуждение результатов
Изучение микробиоценоза природных и антропогенных экосистем позволяет считать, что штаммы рода Legionella занимают в ассоциации микроорганизмов водных экосистем значительное место. Учитывая высокий удельный вес этих микроорганизмов в условиях как природного, так и антропогенного водного микробиоценоза, можно предполагать, что штаммы этих микроорганизмов играют значимую эпидемическую роль и требуют профилактических мероприятий в случае использования воды природных и техногенных экосистем для бытовых нужд.
При этом штаммы вида Legionella pneumophilla представляют особую эпидемическую опасность, так как присутствуют относительно постоянно во всех образцах изученных водопроявлений, что требует дополнительных эпидемиологических мероприятий.
Список литературы
1. Гржибовский А. М. Доверительные интервалы для частот и долей // Экология человека. 2008. № 5. С. 57-60.
2. Тартаковский И. С. Болезнь легионеров: итоги 25-летнего изучения инфекции, проблемы и перспективы исследования // Вестник РАМН. 2001. № 11. С. 11-14.
3. Унгуряну Т. Н, Гржибовский А. М. Внутригодовая динамика загрязнения воздуха и обращаемости за медицинской помощью по поводу болезней органов дыхания // Экология человека. 2011. № 6. С. 37-42.
4. Abraham W. R. Controlling biofilms of gram-positive pathogenic bacteria // Curr. Med. Chem. 2006. Vol. 13. P. 1509-1524.
5. Atlas R. M. Legionella: from environmental habitats to disease pathology, detection and control // Environ. Microbiol. 1999. Vol. 4. P. 283-293.
6. Barbeau J., Gauthier C, Payment P. Biofilms, infectious agents, and dental unit waterlines: a review // Can. J. Microbiol. 1998. Vol. 11. P. 1019-1028.
7. Benson R. F., Fields B. S. Classification of the genus Legionella // Semin. Respir. Infect. 1998. Vol. 2. P. 90-99.
8. Bernander S, Jacobson K., Helbig J. H., et al. A hospital-associated outbreak of Legionnairs disease caused by Legionella pneumophila serogroup 1 is characterized by stable genetic fingerprinting but variable monoclonal antibody patterns // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 6. P. 2503-2508.
9. Berry D., Xi C., Raskin L. Microbial ecology of drinking water distribution systems // Curr. Opin. Biotechnol. 2006. Vol. 3. P. 297-302.
References
1. Grjibovski A. M. Confidence intervals for proportions. Ekologiya cheloveka [Human Ecology]. 2008, 5, pp. 57-60. [in Russian]
2. Tartakovskii I. S. Legionellosis: results of 25-years study of infection. The problems and study perspective. Vestnik Rossiiskoi Akademii Meditsinskikh Nauk [Newsletter of Russian Academy of Medical Sciences]. 2001, 1 1, pp. 1114. [in Russian]
3. Unguryanu T. N., Grjibovski A. M. Seasonal Variation in Air Pollution and Its Association with Hospital Admissions for Respiratory Diseases. Ekologiya cheloveka [Human Ecology]. 2011, 6, pp. 37-42. [in Russian]
4. Abraham W R. Controlling biofilms of gram-positive pathogenic bacteria. Curr. Med. Chem. 2006, 13, pp. 1509-1524.
5. Atlas R. M. Legionella: from environmental habitats to disease pathology, detection and control. Environ. Microbiol. 1999, 4, pp. 283-293.
6. Barbeau J., Gauthier C., Payment P. Biofilms, infectious agents, and dental unit waterlines: a review. Can. J. Microbiol. 1998, 1 1, pp. 1019-1028.
7. Benson R. F., Fields B. S. Classification of the genus Legionella. Semin. Respir. Infect. 1998, 2, pp. 90-99.
8. Bernander S., Jacobson K., Helbig J. H., et al. A hospital-associated outbreak of Legionnairs disease caused by Legionella pneumophila serogroup 1 is characterized by stable genetic fingerprinting but variable monoclonal antibody patterns. J. Clin. Microbiol. 2003, 6, pp. 25032508.
9. Berry D., Xi C., Raskin L. Microbial ecology of drinking water distribution systems. Curr. Opin. Biotechnol. 2006, 3, pp. 297-302.
Контактная информация:
Мартынова Алина Викторовна — доктор медицинских наук, доцент, профессор кафедры эпидемиологии и военной эпидемиологии ГБОУ ВПО «Тихоокеанский государственный медицинский университет»; профессор кафедры биохимии, микробиологии и биотехнологии Дальневосточного федерального университета
Адрес: 590002, г. Владивосток, пр. Острякова, д. 2
E-mail: clinmicro@yandex.ru
