CC BY
56
УДК 576.858:616-07 " '
И.С.Тартаковский, Н.Д.Темежникова, Т.И.Карпова
ЛЕГИОНЕЛЛЕЗ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф.Гамалеи РАМН, Москва
В обзоре освещены вопросы таксономии, микробиологии и экологии легионелл, представлены данные по эпидемиологии, клинике, лечению легионеллезов. Особое внимание уделено проблеме лабораторной диагностики легионеллезов.
Хотя легионеллез традиционно относят к числу недавно открытых инфекций, прошло уже более четверти века со времени первой зарегистрированной эпидемической вспышки этого заболевания в Филадельфии (США). Тогда летом 1976 г. из 4400 участников конгресса организации «Американский легион» у 221 (5 %) развилась тяжелая пневмония. Из них умерли 34 (15,4%). Этиологический агент пневмонии был выделен из легочной ткани умерших и охарактеризован спустя полгода известными американскими риккетсиологами J.E.McDade и C.C.Shepard [1, 10, 11].
В целом уровень заболеваемости легионеллезом в мире невелик, но спорадические случаи и десятки эпидемических вспышек болезни ежегодно выявляют в различных странах мира. Типичные примеры: аукцион цветов в Голландии (1999 г.), во время которого заболели 188 чел., из них 16 умерли; дельфинарий в Австралии (1999 г.) - соответственно 98 и 9; гостиничный комплекс в Норвегии (2001 г.) - 28 и 7; общественные здания в Испании (2002 г.) - 470 и 9; промышленные предприятия во Франции (2004 г.) -86 и 16 и Норвегии (2005 г:) - 55 и 10 [4, 5].
• Эпидемические вспышки и спорадические случаи легионеллеза преимущественно наблюдаются у посетителей и персонала гостиниц, больниц, учреждений, промышленных предприятий. Фактором передачи служит водный мелкодисперсный аэрозоль или вода; циркулирующая в водопроводной системе, системах охлаждения централизованных кондиционеров воздуха и других объектах. Практически все крупные эпидемические вспышки и многие спорадические случаи легионеллеза связаны с распространением мелкодисперсного аэрозоля, содержащего возбудитель и генерируемого системами водных коммуникаций.
Сочетание высокой концентрации легионелл в водной среде с источниками мелкодисперсного аэрозоля позволяет возбудителю попасть в респираторные отделы легких человека, где происходит контакт с альвеолярными макрофагами, в которых вирулентные штаммы возбудителя активно размножаются. ’
I При спорадическом легионеллезе и отдельных нозркомиальных вспышках заболевания возможна аспирация воды, контаминированной легионеллами, без> образования аэрозоля. Это обусловлено возрастанием восприимчивости к легионеллезу лиц со сниженной иммунологической реактивностью на фоне сопутствующих заболеваний, иммуносупрес-сивной терапии и др. [11, 13].
Легионеллез является типичным примером техногенных инфекций, обусловленных активным использованием в промышленности и быту циркулирующих; замкнутых водных систем, источников бактериального аэрозоля. Для микробиологов легионеллез является труднодиагностируемой инфекцией. Возможно, что относительно невысокий уровень выявляемой заболеваемости связан с несовершенством лабораторной диагностики и высокой стоимостью реагентов для эффективной диагностики легионеллеза.
Таксономия. Первый штамм легионелл, выделенный от умершего пациента во время «филадельфийской вспышки» в 1976 г., был принят за типовой штамм Legionella pneumophila в разрабатываемой классификации легионелл как нового бактериального рода. В названии нового бактериального агента увековечены первые жертвы инфекции - участники конгресса организации «Американский легион», и обозначена пневмотропность возбудителя - Legionella pneumophila. Род Legionella образует генетически родственную таксономическую структуру, а семейство Legionellaceae состоит только из одного рода и принадлежит к подтипу протеобактерий.
Общепринятая классификация семейства Legionellaceae основана на работах D.J.Brenner et ai, использовавших для определения вида легионелл гибридизацию ДНК. Штаммы легионелл относили к одному виду, если уровень гибридизации ДНК между ними при оптимальных условиях превышал 70 %. В частности, гомология штаммов L. pneumophila составляет 82-99 %. Гомология между отдельными видами легионелл колеблется от 40 до 70 %.
Для идентификации легионелл до уровня вида используется рестрикционный анализ, ДНК амплификация и секвенирование, анализ жирно-кислотно-го состава клеточной стенки, серологические методы. Большая часть из этих методов доступна лишь для специализированных референс-лабораторий. Биохимические тесты имеют крайне ограниченное значение, так как легионеллы не ферментируют углеводы. В настоящее время известны около 50 видов легионелл, для 22 из которых показана роль в инфекционной патологии человека (табл. 1) [2, 10, 11].
Тем не менее более 95 % случаев болезни легионеров ассоциированы с видом L. pneumophila. Среди других видов легионелл чаще всего заболевание вызывают, как правило, при нарушениях клеточного иммунитета и/или на коморбидном фоне виды L. micdadei, L. longbeachae, L. dumoffii и L. bozemanii.
Таксономия легионелл
Таблица 1
Вид Кол-во Связь
серогрупп с клиническими случаями
L. adelaidensis . ■ ,
L. anisa +
L. binninghamensis' +
L bozemanii 2 +
L. brunensis -
L. cherri +
L. cincinnatiensis +
L. donaldsonii +
L. dumoffii +
L. erythra 2 -
L. fairfieldensis +
L. feeleii 2 +
L. geestiana
L. gonnanii + , ;
L. gratiana ■
L. hackeliae 2 +
L. israelensis -
L. jamestownniensis '
L. jordanis +
L. lansingerisis +
L. londiniensis - 2' -
L. longbeachae 2 • ' +
L lyticQ (comb, nov.) +
L. maceachemii • +
L. micdadei +
L. moravica -
L. nauiarum -
L. oakridgensis +
L. parisiensis +
L. pneumophila 16 +++
L. quateirensis
L. quinlivanii . 2 -
L. rubriiucehs -
L. sainthelensi 2 +
L. santicrucis ’ -
L. shakespearei ~ ' ‘ '
L. spiritensis 2 - +
L. sieigenvaltii -
L. tusconensis ' +
L. wadsworihii ' +
L.. waltersii -
L. worsleiensis
Вид L. pneumophila включает 16 серогрупп, 9 видов - по 2 серогруппы, остальные виды - по одной. С L. pneumophila серогрупп 1, 4 и 6 связывают большую часть случаев болезни. Причем доминируют, штаммы серогруппы 1, с ними связаны более ’80 % случаев заболевания, 5-10 % - с серогруп-пами 4 и 6.
Эпидемиология. Механизм передачи легионел-лезной инфекции - аспирационный, путь передачи -воздушно-кацельный,. основной фактор передачи -мелкодисперсный аэрозоль. Практически все крупные эпидемические вспышки и многие спорадические случаи легионеллеза связаны с распространением мелкодисперсного аэрозоля, содержащего легио-неллы и генерируемого бытовыми, медицинскими или промышленными водными системами.
При анализе эпидемической заболеваемости показано, что болезнь легионеров (легионеллезная пневмония) развивается у 5-10 % лиц, находившихся в зоне действия контаминированного легионел-
лами аэрозоля. Лихорадка Понтиак (острое респираторное заболевание легионеллезной природы) поражает 80-100 % таких лиц.
Спорадический легионеллез выявляют, как правило, у лиц среднего и пожилого возраста на фоне действия таких факторов риска, как курение, сопутствующие заболевания, иммуносупрессивная терапия, первичные и вторичные иммунодефициты. Легионеллы вызывают "2-6 % от общего числа пневмоний и до 10-15 % так называемых атипичных пневмоний, вызываемых микоплазмами, хла-мидиями, легионеллами и коксиеллами. У детей легионеллез выявляют редко, обычно на фоне сопутствующих заболеваний.
Болезнь распространена повсеместно, наибольшее количество случаев выявлено в странах Европы и США. Так, в частности, заболеваемость легионеллезом в США оценивается как 6/100000 населения. При этом 0,5—4 % всех случаев пневмонии, требующей госпитализации, представлены бо: лезнью легионеров. Случаи легионеллеза выявляют круглогодично, но пик заболеваемости приходится на летние месяцы.
Эпидемические вспышки и спорадические случаи легионеллеза преимущественно выявляют у посетителей и персонала гостиниц, больниц, учреждений, промышленных предприятий. Как уже отмечалось, фактором передачи служит водный мелкодисперсный аэрозоль или вода, циркулирующая в, водопроводной системе, системах охлаждения централизованных кондиционеров воздуха и других водных объектах.
В последние годы особое значение придается проблеме легионеллеза, возникающего во время путешествий, диагностируемого, как правило, по возвращению из них. Более 30 % случаев спорадического легионеллеза, многочисленные эпидемические вспышки в гостиницах, нередко с летальным исходом, послужили основой создания единой международной системы эпидемиологического надзора за случаями легионеллеза, связанного с поездками.
Риск возникновения внутрибольничного легионеллеза определяется не только возможностью контаминации легионеллами систем водоснабжения, кондиционирования, медицинского оборудования, но и наличием чувствительных к инфекции лиц с нарушениями клеточного иммунитета. В отделениях онкологии или трансплантации органов при контаминации легионеллами водных систем частота легионеллеза в этиологической структуре внутрибольничных пневмоний составляет 15-20%, а летальность - 30-40 %. Помимо L. pneumophila внутрибольничную инфекцию нижних дыхательных путей часто вызывает вид L. micdadei.
Клиника и лечение. Известны 2 клинические формы легионеллеза - болезнь легионеров и лихорадка Понтиак [1, 7]. Ведущей клинической формой легионеллеза является собственно болезнь легионеров. Она характеризуется четко очерченной симптоматикой воспаления легочной ткани. Инкубационный период составляет обычно 2-10 дней. Высокая лихорадка сопровождается ознобом, интенсивными болями в груди. Одышка на фоне массивной пневмонической инфильтрации и вовлечения в патологиче-
ский процесс плевры появляется в первые сутки болезни и прогрессирует при неадекватном лечении.
В 20-30 % случаев развивается острая дыхательная недостаточность, требующая респираторной поддержки. В ряде случаев развивается инфекционно-токсический шок и острая почечная недостаточность. Лихорадка продолжается 12-15 дней. Симптомы поражения верхних дыхательных путей наблюдаются редко. Кашель малопродуктивный с течением времени может приобретать продуктивный характер с отделением слизисто-гнойной мокроты. У 25 % больных имеются симптомы поражения желудочно-кишечного тракта.
При лабораторном исследовании крови выявляются относительная или абсолютная лимфопения на фоне умеренного лейкоцитоза, увеличение СОЭ нередко до 60-80 мм/ч. При биохимическом исследовании крови могут обращать на себя внимание цитолиз, диспротеинемия со снижением содержания альбуминов, гипонатремия, гипофосфатемия.
При рентгенографии органов грудной полости в 60-70 % случаев уже на ранней стадии болезни легионеров визуализируются односторонние пневмонические инфильтраты. В дальнейшем отмечается прогрессирование инфильтративных изменений с вовлечением в процесс новых сегментов. Летальность при болезни легионеров составляет 8-25 %. У больных с иммунологическими нарушениями может достигать 60 %.
Другая клиническая форма легионеллеза - респираторная лихорадка впервые описана среди служащих и посетителей департамента здравоохранения в Понтиаке (США). Данный ОРЗ-подобный синдром, называемый также лихорадкой Понтиак, представлен следующей симптоматикой: 1-2-дневное повышение1 температуры тела, сухой кашель, катаральные явления в носоглотке, головные и мышечные боли. Болезнь поражает 90-100 % лиц, находящихся в зоне распространения аэрозоля, содержащего легионеллы. Инкубационный период лихорадки Понтиак составляет обычно 36-48 ч. Заболевание протекает, как правило, в нетяжелой форме и разрешается в короткие сроки (2-7 дней). Летальные исходы при лихорадке Понтиак не зарегистрированы.
' Носительство и персистенция легионелл в организме человека не описаны.
В основе антибактериальной терапии легионел-лезной пневмонии лежит применение макролидов и фторхинолонов, обладающих способностью к внутриклеточной пенетрации и аккумуляции. При относительно нетяжелом течении заболевания традиционно назначается эритромицин. При лечении тяжелых случаев используют фторхинолоны или новые макролидьг - азитромицин и кларитромицйн.
Экология. В природных условиях легионеллы обитают в| пресноводных водоемах, где они являются симбионтами сине-зеленых водорослей, паразитируют в водных и почвенных амебах и других простейших. Размножение легионелл активно идет в теплой воде в диапазоне 20—45 °С, хотя их выделяют и из холодной воды.
Высокие адаптивные способности легионелл позволяют им успешно колонизовать искусственные водоемы - системы охлаждения,' градирни, компрес-
сорные устройства, душевые установки, оборудование для респираторной терапии и др. Условия для выживания легионелл в искусственных сооружениях более благоприятны, чем в естественных, что приводит к накоплению в них возбудителей в высокой концентрации. Легионеллы активно колонизуют синтетические и резиновые поверхности водопроводного, промышленного, медицинского оборудования Л с образованием так называемых биопленок, в которых легионеллы значительно более устойчивы к действию дезинфицирующих веществ [11,13].
Профилактические мероприятия. В качестве профилактических мероприятий при эксплуатации различных водных систем кондиционирования, увлажнения воздуха, технологических производственных систем с распылением воды в виде аэрозоля рекомендуется: периодическая механическая чистка водных систем, представляющих потенциальную опасность; повышение температуры воды эксплуатируемых объектов выше 60 °С; минимизация резких перепадов температур и давления в водных системах; обеззараживание воды с помощью хлорсодержащих ¡соединений до концентрации 3,3 мг свободного хлора на литр.
На смену хлорированию и термообработке, часто негативно действующих на эксплуатацию водных систем и приборов, в последние годы ■ ¡активно внедряют дезинфектанты, не содержащие хлора или приспособления, обогащающие воду ионами серебра и меди. Методы иммунопрофилактики не разработаны [2, 4, 10].
Возбудитель. Легионеллы представляют собой грамотрицательную палочку диаметром 0,5—0,7 мкм и длиной 2-5 мкм. В ряде случаев встречаются нитевидные формы длиной до 20-25 мкм. Они не образуют эндоспор, микроцист и капсул, растут в аэробных условиях. Микроорганизм подвижен за счет одного, двух или большего числа жгутиков, легионеллы не ферментируют углеводы, разжижают желатин, не образуют уреазу, не восстанавливают нитраты, результаты теста на каталазу положительны, на оксидазу - вариабельны [1, 7, 9]. >
. Легионеллы не растут на обычных питательных средах (кровяном агаре, агаре МсСопкеу и др.), что связано с потребностью возбудителя в Ь-цистеине и растворимом пирофосфате железа. Для выделения легионелл используют различные модификации буферного угольно-дрожжевого агара, содержащего Ь-цистеин, .„растворимый пирофосфат железа и а-кетоглютаровую кислоту (среда ВСУЕа).
Все виды легионелл растут во влажной атмосфере при температуре 35 °С. Рост некоторых видов стимулирует присутствие 2,5-3 % СОг. Колонии легионелл вырастают при первичном выделении в течение 3-6 сут. Молодые колонии обычно имеют вросший центр, гранулярную или блестящую поверхность. .
В ткбл. 2 приведены фенотипические характеристики 6 видов легионелл, чаще других обуславливающих клинически выраженные случаи инфекции. Для более точной идентификации вида используют серологические методы, анализ ДНК. или жирно-кислотного состава. «,
В лабораторных условиях чувствительность
Основные фенотипические признаки Legionella spp. Таблица 2
I Признак | L. pneumophila \ L. bozemanii \ L. dumoffii 1 L. micdadei | L. feeleii 1 L . longbeachae \
Рост на ВСУЕа-агаре + + . ..+ + + +
Рост на кровяном агаре или на ВСУЕа без Ь-цистеина - - - - - -
Каталаза + + + ' + + +
Восстановление нитратов ■ - ■ - - -
Ферментация углеводов - ' - - -
Гидролиз гиппурата натрия +_ - - -
Аутофлюоресценция - + + ■
Желатиназная активность + • + , - + - - +
Образование коричневого пигмента на среде, содержащей тирозин + + + - + +
Р-лактамазная активность + В + - - В В
Оксидаза В В - + В +
Примечание. «+»-положительный; «-»-отрицательный; «В» - вариабельный.
L. pneumophila к стандартным дезинфицирующим и антисептическим препаратам не отличается от большинства неспоровых форм бактерий, 3 % раствор хлорамина вызывает гибель возбудителя за 10 мин при его концентрации в суспензии 109 КОЕ/мл. Возбудитель не характеризуется устойчивостью к кислотам и не окрашивается по Циль-Нильсену. Хотя микроорганизм высокочувствителен к действию различных химических и физических агентов, требователен к температуре и pH среды культивирования, в подходящих условиях водной среды он может сохраняться достаточно долго. В природной водной среде значительно расширяется диапазон физико-химических и биологических условий существования микроорганизма. Об этом свидетельствует выделение возбудителя из 47 водоемов с различными физическими, химическими и биологическими характеристиками [10].
Легионелла - факультативный внутриклеточный паразит. В организме человека они размножаются преимущественно в альвеолярных макрофагах, полиморфно-ядерных нейтрофилах и моноцитах крови. Вследствие ингаляции микробного аэрозоля или аспирации легионеллы попадают в легкие, где и происходит их контакт с альвеолярными макрофагами.
Легионеллы активно размножаются в макрофагах, что приводит к разрушению последних и выходу большого количества бактерий в легочную ткань. Многократно повторяемый цикл взаимодействия легионелл с макрофагами легких обуславливает накопление возбудителя в высокой концентрации и развитие острого воспалительного процесса, характерного для классической болезни легионеров.
Взаимодействие легионелл с фагоцитирующей клеткой происходит в несколько этапов: контакт возбудителя с рецепторами поверхности эукариотической клетки; проникновение в фагоцит и включение механизмов, ингибирующих бактерицидное действие фагосомы; образование «репликативной вакуоли»; внутриклеточное размножение возбудителя, приводящее к гибели фагоцита.
При фагоцитозе легионеллы инициируют ряд сложных процессов, включая ингибицию «кислородного взрыва», изменение pH среды фагосомы, образование фаголизосомы, нарушение движения клеточных органелл. В результате возбудитель
трансформирует фагосому в нишу для собственной репликации [3, 5, 10].
Лабораторная диагностика. Существуют пять основных методических подходов, используемых в диагностике легионеллеза:
- выделение культуры возбудителя - золотой стандарт;
• - определение уровня антител в сыворотке крови;
- определение растворимого антигена в моче;
- выявление возбудителя в клиническом материале методом иммунофлюоресценции;
- выявление возбудителя с помощью полимеразной цепной реакции.
Опыт применения разных методов в последние годы, данные о чувствительности и специфичности различных методов (табл. 3) позволили Всемирной Организации Здравоохранения рекомендовать для лабораторной диагностики болезни легионеров три группы методов [1, 7, 9, 14, 15]. Диагноз легионеллеза в случае острой инфекции нижних дыхательных путей (клинически и рентгенологически подтвержденной пневмонии) считается установленным:
а) при выделении легионелл из отделяемого респираторного тракта или легочной ткани;
б) при 4-кратном или более нарастании титра специфических антител к L. pneumophila в реакции непрямой йммунофлюоресценции;
в) при определении специфического растворимого антигена легионелл в моче иммуноферемент-ным или иммунохроматографическим методом.
При отсутствии первой сыворотки крови, взятой в ранние сроки болезни, выявление высокого уровня антител к L. pneumophila (1:128 и выше) в одиночной сыворотке методом непрямой иммунофлюоресценции позволяет считать диагноз легионеллеза предположительно установленным. Остальные методы используются как дополнительные и имеют вспомогательное значение.
Для выделения легионелл используют материал бронхоскопии, плевральный экссудат, материал биопсии или аутопсии легкого. Плевральный экссудат, материал бронхоскопии, полученный стерильно до 7-го дня болезни в количестве 1-2 мл, помещают в стерильную пробирку, плотно закрытую резиновой пробкой, и хранят при +4 °С не более 1 сут. Ма-
терйал биопсии или аутопсии помещают в стерильные флаконы, плотно закрытые'пробками, и хранят или транспортируют при +4 °С в течение 1 сут. Длительное хранение материала (до 1 года) возможно лишь при температуре -70 °С.
Таблица 3
Сравнительная характеристика различных методов диагностики инфекции Legionella pneumophila
Метод Чувствитель-ность, % Специфичность, %
Выделение культуры из
мокроты или отделяемого респираторного 80-90 100
тракта
биоптата легкого 90-99 100
крови 10-30 100
Выявление растворимого антигена в моче 90-99 100
Выявление специфических антител в крови:
в парных сыворотках 75 ■ 95-99
в одиночной сыворотке Не известна 50-70
Выявление возбудителя иммунофлюорес-
центным методом с помощью антител: г ■ "
в мокроте или отделяемом респираторного , 25-75 95-99
тракта
в биоптате легкого 80-90 99
Выявление возбудителя в отделяемом рес- ’ 50-70 . 95-99
пираторного тракта с помощью ДНК-зонда
Выявление возбудителя в отделяемом рес- 85 . 99
пираторного тракта с помощью полимеразной цепной реакции
Для выделения легионелл из клинического материала используют буферный угольно-дрожжевой агар с а-кётоглютаровой кислотой (среда BCYEa). Данная среда является стандартной для выделения и культивирования легионелл в соответствии со стандартом ISO 1173IE. Варианты среды BCYEa производят ряд фирм-производителей: ХайМедиа, Биорад, Оксоид, Биомерье, Мерк и др. Среду также можно приготовить непосредственно в лаборатории, используя следующие компоненты: дрожжевой экстракт — 10 г, активированный уголь -2 г, L-цис-теин - 0,4 г, пирофосфат железа растворимый -0,25 г, ACES-буфер - 10 г, агар - 15-г, а-кетоглюта-ровая кислота - 0,25 г, дистиллированная вода -980 мл. Все компоненты среды, кроме L-цистеина й пирофосфата железа добавляют к 980 мл дистиллированной воды, растворяют и доводят pH до 6,95 с добавлением 1N КОН. Среду автоклавируют 15 мин при 121 °С. Затем ее-охлаждают до 50 °С в водяной бане и добавляют свежеприготовленные растворы L-цистеина (0,4 г в 10 мл дистиллированной воды) и пирофосфата железа растворимого (0,25 г в 10 мл дистиллированной воды), профильтрованные через мембранный фильтр (0,3 мкм). Среду быстро разливают на чашки, слегка взбалтывая флакон для равномерного распределения активированного угля. Разлитая среда хранится в пластиковых или металлических контейнерах в холодильнике не менее 2 недель. Чашки инкубируют при 35 °С в атмосфере 2,5 % С02при влажности около 65 % до двух недель.
Рост колоний из клинического материала наблюдается не ранее чем через 4—5 сут. Максимальное колйчество видимых колоний вырастает на 8-10-е сутки. При подозрении на рост Legionella колонии пересевают на ту же среду й на среду не под-
дёрживающую рост возбудителя - контрольную. В качестве 'контрольной среды обычно используют аналогичную среду BCYEa без добавления L-цистеина и пирофосфата железа или соответствующей ростовой добавки фирмы пройзводителя. Рост во втором пассаже на BCYEa при отсутствии роста на контрольной среде обычно достаточен для подтверждения выделения культуры рода Legionelia. Если культура растет на контрольной среде, то это не Legionelia.
Для культивирования легионелл можно использовать также среду СЭЛ производства НИПЧИ (Ростов-на-Дону), легионеллбакагар производства ННПЦГП (Оболенск), а также шоколадный агар, используемый для культивирования возбудителя туляремии. Ростовые потребности легионелл и возбудителя туляремии весьма близки. Вместе с тем успех выделения штаммов легионелл из клинического материала так же, как и из образцов окружающей среды во многом зависит от pH среды. Ле-гионеллы исключительно требовательны к pH среды (6,95),’ которое удается сохранять в условиях длительного (до 2 недель) выделения возбудителя исключительно за счет такого компонента BCYEa, как ACES’ буфер, отсутствующего в других средах. Музейные штаммы легионелл не столь требовательны к pH и растут на гораздо более широком спектре питательных сред в том числе без ACES буфера. При выделении легионелл из клинического материала на средах, отличных от BCYEa, рекомендуется осуществлять дополнительный контроль среды с помощью, вирулентной культуры L. pneumophila серогруппы Philadelphia 1 (LD50 для морских свинок не более Ю5КОЕ при высеве на BCYEa). Количество колоний на проверяемой среде должно соответствовать титру контрольной вирулентной культуры, в качестве которой используется селезеночная суспензия морской свинки или суспензия, приготовленная из свежевыросшей вирулентной культуры | после высева селезеночной суспензии морской свинки на BCYEa. Ампулы с вирулентной контрольной культурой легионелл для проверки качества питательных сред могут храниться в течение
2 лет при -70 °С.
Легочная ткань часто контаминирована микрофлорой, быстрый рост которой при высеве на пита-, тельные среды нё позволяет выделить культуру легионелл. Для ингибирования роста посторонней микрофлоры в среду добавляют 4 мкг/мл цефаман-дола, 80 ЕД/мл полимиксина В и 8 мкг/мл анизоми-цина. Цефамандол можно заменить ванкомицином (0,5 мкг/мл). Следует отметить, что цефамандол в отличие от ванкомицина подавляет рост некоторых видов легионелл, не продуцирующих ß-лактамазы, включая й L. micdadei. В отличие от стандартной ростовой добавки, обязательно содержащей L-цис-тейн и пирофосфат железа, антимикробная добавка, подавляющая рост посторонней микрофлоры, может различаться по составу у различных фйрм-производителей, а также в зависимости от степени контаминации исследуемого материала.
Существуют также 2 других метода подавления роста посторонней микрофлоры в клинйческом материале при исследовании на легионеллез. Прогре-
вание в водяной бане в течение 30 мин при температуре 50 °С или 5-минутная экспозиция НС1-КС1 буфером (pH 2,2) используется для выделения легионелл из сильно контаминированных образцов.
Поскольку морфология легионелл типична для грамотрицательных бактерий, а методы окраски не являются специфичными, то окраска по Граму или Романовскому-Гимзе малоинформативна.
Возбудитель легионеллеза обладает окислительно-восстановительными ферментами оксидазой и каталазой, разжижает желатину, вызывает гидролиз гиппурата натрия. Легионеллы не ферментируют углеводы, не вызывают редукцию нитратов в нитриты, не обладают уреазной активностью (табл. 2). На практике в последние годы для идентификации выросших колоний используют латекс-агглютинацию с помощью соответствующих наборов или реакцию иммунофлюоресценции. В последние годы для быстрой идентификации выросших колоний легионелл хорошо зарекомендовали себя наборы производства «Оксоид» и «Биорад». Выпускаются несколько вариантов наборов, позволяющих выявлять колонии L. pneumophila серогруппы 1; 2-14; родоспецифический антиген, характерный для колоний других родов легионелл, что на практике вполне достаточно для быстрой идентификации возбудителя в лаборатории клинической микробиологии. Постановка реакции на стекле с суспензией предполагаемой колонии легионелл занимает не более 15 мин.
Помимо бактериологических методов, для диагностики легионеллеза широко применяют имму-носерологические. Антигенная структура легионелл представляется достаточно сложной. Специфичность серогрупп обусловлена липополисахаридным антигеном. Разработанные в настоящее время методы иммунодиагностики основаны на определении в сыворотке крови больных специфических антител или обнаружении самого антигена в моче или отделяемом респираторного тракта.
Наиболее распространенный и доступный практическим лабораториям метод лабораторной диагностики - выявление специфических антител в сыворотке крови больных методом непрямой иммунофлюоресценции. Сыворотку крови больных с подозрением на легионеллез берут в первые дни и на 14-21-й день болезни. Кровь из вены в количестве 3-5 мл помещают в стерильную пробирку, после свертывания крови сгусток отслаивается от стекла пастеровской пипеткой и помещается на 5-6 ч при комнатной температуре. Отделившуюся сыворотку отсасывают в стерильную пробирку и хранят при +4 °С.
Для диагностики легионеллеза методом непрямой иммунофлюоресценции можно использовать тест-системы различных производителей: Sigma, Zeus Tech., Sanofi Diagnostics Pasteur, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и др. Основным недостатком метода является ретроспективный характер диагностики, что часто не приемлемо в случае необходимости выбора тактики антибиотикотерапии тяжёлой легионеллезной пневмонии.
Для постановки реакции каплю антигена наносят на предметное стекло, высушивают на воздухе в течение 30 мин, погружают в ацетон на 15 мин и
вновь высушивают на воздухе. Сыворотку крови больного разводят в соотношении 1:16 0,15 М фосфатным буфером (pH 7,2). Далее 2-кратные разведения от 1:32 до 1:512 делают в том же фосфатном буфере. На препараты с антигеном наносят разведения сыворотки, инкубируют в течение 30 мин при 37 °С во влажной камере, промывают 5 мин фосфатным буфером и дистиллированной водой, высушивают на воздухе. Далее на препараты наносят меченную флюоресцирующим изотиоционатом кроличью сыворотку против глобулинов человека, инкубируют в течение 30 мин при 37 °С, промывают 5 мин, споласкивают дистиллированной водой и высушивают. Препарат покрывают забуференной глицериновой средой и просматривают в люминесцентном микроскопе. Титры антител определяют по интенсивности свечения образующегося иммунного комплекса по 4-балльной шкале.
Положительный диагноз ставится по не менее чем 4-кратному нарастанию титров антител в ре-конвалесцентных сыворотках, по сравнению с первой сывороткой, взятой в острый период заболевания. В случаях, когда проанализировать динамику изменения не представляется возможным, диагноз ставится по уровню специфических антител (1:128) в одиночной сыворотке (предварительный диагноз). При постановке в качестве контроля используют положительную (титр не менее 1:256) и отрицательную (титр 1:16) сыворотки крови человека. Качество антигена может быть проверено в реакции непрямой иммунофлюоресценции с разведениями сыворотки крови кролика, иммунизированного антигеном L. pneumophila.
Метод прямой иммунофлюоресценции - экс-пресс-метод, позволяющий обнаружить возбудитель в клиническом материале (материал, взятый при бронхоскопии и биопсии, плевральный экссудат) в острый период заболевания. Для диагностики используют легионеллезные диагностические люми-несцирующие препараты производства фирм Vira-med, Vircell, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и др.
К сожалению, применение данного метода связано с необходимостью проведения инвазивных манипуляций для сбора материала, так как в мокроте возбудитель легионеллеза выявляют редко. Кроме того, моноклональные антитела к видоспецифическому антигену L. pneumophila дороги для рутинной диагностики, а тест-системы на основе поликлональных антител могут давать перекрестные реакции с Pseudomonas spp., Flavobacterium spp. и Bac-teroides spp., и специфичность метода далека от идеала (табл. 3).
Поэтому на практике в последние годы метод прямой иммунофлюоресценции используется, как правило, наряду с латекс-агглютинацией, для идентификации выросших на чашках колоний легионелл.
Для постановки реакции на предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и делают тонкий мазок. Препарат подсушивают на воздухе при комнатной температуре и фиксируют в ацетоне 15 мин. На поверхность мазка, помещенного во влажную камеру, наносят каплю «рабочего разведения» легионеллезной люминесцирующей сыворотки. Препарат инкубируют при 37 °С 20 мин, промы-
Препараты и питательные среды для диагностики легионеллеза
Препараты
Производители
Буферный угольно-дрожжевой агар, содержащий Ь-цистеин, растворимый пирофосфат железа и а -кетоглютаровую кислоту (среда ВСУЕа)
Питательная среда для культивирования и выделения, возбудителя легионеллеза элективная (СЭЛ)
Питательная среда для культивирования легионелл (легионеллбакагар)
Набор для реакции непрямой иммунофлюоресценции (антиген легионелпезный, сыворотка кроличья легионелпезная)
Иммуноглобулины легионеллезные диагностические люминесцирующие
Тест-система иммуноферементная для определения легионеллезного антигена '
Определение специфического растворимого антигена легионелл в моче иммунохроматографическим методом
Наборы для идентификации легионелл методом латекс-агглютинации
Примечание. Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или ЕЫ 29000: Питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по нормативной документации, утвер!ащенной в установленном порядке. . , • ’
Фирмы ХайМедиа, Биорад, Оксоид, Биомерье, Мерк и др. - с • . Ростов-на-Дону, НИПЧИ
Оболенск, ЗАОННПЦГП .
' Sigma, Zeus Tech., Sanofi Diagnostics Pasteur, НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН и др.
Viramed, Vircell, НИИЭМ им.Н.Ф.Гамапеи РАМН и др.
, Binax, Biotest
Binax
Оксоид, Биорад '
вают 10 мин в фосфатном буфере (pH 7,2), дистиллированной водой, высушивают на воздухе, наносят глицериновую среду, покрывают покровным стеклом и просматривают в люминесцентном микроскопе. Обнаружение изумрудно-зеленого специфического свечения не менее чем у 3-5 клеток в поле зрения микроскопа свидетельствует о присутствии в исследуемом материале L. pneumophila.
С конца 90Jx годов прошлого века для экс-пресс-диагностики легионеллеза стали использовать иммуноферментный метод, позволяющий выявлять растворимый антиген легионелл в моче в острый период заболевания (первые 10 дней). Международные испытания, проводившиеся в 1998-1999 гг. под эгидой Европейской рабочей группы по легионеллезу, показали высокую чувствительность и специфичность этого метода в обнаружении L. pneumophila серогруппы 1 в моче [2, 8]. В настоящее время в 80 % случаев первичный диагноз легионеллеза в мире ставится на основе обнаружения легионеллезного антигена в моче. При определении антигена других серогрупп L. pneumophila чувствительность и специфичность метода несколько ниже. Для других видов легионелл методика не отработана. Для диагностики иммуноферментным методом используют диагностические тест-системы фирм Biotest (Германия) и Binax (США).
Фирмой Binax разработан иммунохроматогра-фический метод для быстрого определения антигена легионелл в моче. Метод практически не уступает по специфичности и чувствительности иммунофермент-ному, не требует специального оборудования и широко используется клиническими микробиологами при диагностике тяжелых пневмоний. К достоинствам иммунохроматографического метода можно отнести и наличие аналогичной тест-системы Binax для быстрого| выявления в моче растворимого антигена пневмококка, что позволяет быстро провести дифференциальную диагностику тяжелой пневмонии.
| В полимеразной цепной реакции для диагно-' стйки легионеллеза обычно используют праймеры фрагмента mip гена или 16S rPHK L. pneumophila [12]. В ряде работ указывается на возможность перекрестных реакций с бактериями рода Pseüdomo-
nas. Необходимость инвазивных процедур для получения клинического материала для исследований также ограничивает применение данного метода, поэтому в настоящее время ПЦР для диагностики легионеллеза используется лишь как дополнительный тест. ' -
' СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ '
1. Покровский В.Иу Прозоровский С.В., Малеев
B.В., Тартаковский И.С. Этиологическая диагностика и этиотропная терапия острых пневмоний. - М.: Медицина, 1995. - 2. Тартаковский И.С., Синопальников А.И.// Клин, микробиол. антимикроб, химиотер. - 2001. - Вып. 3(1).-
C. 4-17. - 3.!,Тартаковский И.С. // Вестник РАМН. - 2001. -№11. - С. 11-14. - 4. Тартаковский И.С., Ермолаева С. А., Маракуша Б.И., Белый Ю.Ф.//Молекулярная медицина и биобезопасность: Тез. 1-й междунар. конф. - М.,' 2004.- С. 180-182. - 5. Belyi Yu. // Intern, microbial. - 1999. — N2.-P. 145-154.-6. Blystad H., Brantsater A.B., Lavoll O. // Eurosurveillance. - 2005. - N10. - P. 127-128. -7. Edelstain P.H., Meyer L.D.//Respiratory infections: diagnosis and management / Ed. Pennington E.D. - New York: Raven Press, 1994. - P. 455-484. - 8.Harrison Т., Uldum S., Alexie-Daniel S.A, Tartakovskiy I.S.//Clin. Microb. Infect.- 1998. - N 4..- P. 359-365. - 9. Harrison T.G., Taylor A.G. A laboratory manual for Legionella. - Chichester: John Wiley&Sons; Ltd., 1988.- lO.Fields B.S., Benson R.F., Besser R.E. II Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 15, N 3. -P. 506-526. - 11. Legionella / Ed. R.Marre. - Washington: ASM Press, 2002..- 12.Lindsay D.S., Abraham W., Fallon R. J. // J. Clin. Microbiol. - 1994. - Vol. 32. - P. 3068-3069. -13. Stout J;.E., Yu V.L. // N. Engl. J. Med. - 1997. -Vol.337,- P. 682-687. — 14.Water quality-detection and enumeration of Legionella. ISO 11731 (ISO 1998). - 15. WHO Recommended Surveillance Standards. - 1999.
I.S.Tartakovsky, N.D.Temezhnikova, T.I.Karpova
Legionellosis: Problems and Prospects of Laboratory Diagnosis
N.F.Gamaleya Epidemiology and Microbiology Research Institute of RAMS,
Moscow, ■
The problems of legionella taxonomy, microbiology and ecology were elucidated, in connection with data on epidemiology, clinical'symptoms and treatment of legionellosis. The most careful consideration was given to laboratory diagnosis of legionellosis.
Поступила 0i.lt.05.
