CC BY
25© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
И.С.Тартаковский1, Т.И.Карпова1, О.А.Груздева2, О.В.Мариненко1, Ю.Е.Дронина1
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ПЛАНКТОННЫХ КЛЕТОК И МОДЕЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК LEGIONELLA PNEUMOPHILA В ВОДЕ
Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи, 2Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова, Москва
Цель. Изучение влияния температуры воды в диапазоне от 40°С до 70°С на жизнеспособность планктонных форм и модельных биопленок Legionella pneumophila в экспериментальных условиях. Материалы и методы. В работе использовали моновидовые биопленки легионелл, полученные в планшетах для иммуноферментного анализа в течение 96 часов при температуре 28°С, и водную суспензию выращенных на BCYE агаре клеток L.pneumophila в концентрации 103 — 105 КОЕ на литр для оценки бактерицидного действия температуры на различные формы легионелл. Результаты. Анализ действия различных температурных режимов на планктонные формы и модельные биопленки легионелл показал, что в диапазоне температуры от 50° до 60°С происходит значительное снижение количества жизнеспособных клеток легионелл. Модельные биопленки легионелл частично сохраняли жизнеспособность при температуре 60°С и лишь экспозиция при температуре 70°С приводила к гибели биопленок легионелл и планктонных форм бактерий. Показана зависимость сохранения жизнеспособности легионелл от исходной концентрации возбудителя в воде и длительности экспозиции при различной температуре. Заключение. Кратковременное прогревание при температуре не менее 70°С обладает наиболее выраженным бактерицидным действием на планктонные формы и модельные биопленки L.pneumophila в экспериментальных условиях. Данный температурный режим может быть использован в качестве одного из профилактических подходов при эксплуатации потенциально опасных водных систем и прежде всего систем горячего водоснабжения.
Журн. микробиол., 2015, № 5, С. 7—12
Ключевые слова: L.pneumophila, биопленки,температура, вода, профилактика I.S.Tartakovsky1, T.I. Karpova1, O.A.Gruzdeva2, O.V.Marinenko1, Yu.E.Dronina1
EFFECT OF TEMPERATURE ON THE VIABILITY OF PLANKTON CELLS AND MODEL LEGIONELLA PNEUMOPHILA BIOFILMS IN WATER
1Gamaleya Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology, 2Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow, Russia
Aim. Study the effect of water temperature from 40 to 70°C on viability of plankton forms and model Legionella pneumophila under experimental conditions. Materials and methods. Mono-species legionella biofilms, obtained in plates for enzyme immunoassay during 96 hours at 28°C, and water suspension of BCYE agar cultivated cells of L.pneumophila at a concentration of 103 — 105 CFU per liter were used in the study for evaluation of bactericidal effect of temperature on various legionella forms. Results. Analysis of effects of various temperature regimens on plankton forms and model legionella biofilms has shown that at a temperature range from 50 to 60°C a significant reduction of quantity of viable legionella cells occurs. Model legionella biofilms have partially conserved viability at a temperature of 60°C and only exposition to a temperature of 70°C resulted in death of legionella biofilms and plankton forms of bacteria. A dependence of viability conservation of legionella from the initial concentration of the causative agent in water and duration of exposition at varying temperature was shown. Conclusion. Short-term heating at a temperature of at least 70°C has the most pronounced bactericidal effect on plankton forms and model L.pneumophila biofilms under experimental conditions. Such temperature regimen could be used as one of the prophylaxis approaches during maintenance of especially dangerous water system and, fist of all, systems of hot water supply.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 5, P. 7-12
Key words: L.pneumophila, biofilms, temperature, water, prophylaxis ВВЕДЕНИЕ
Legionella pneumophila — естественный обитатель природных пресноводных водоемов, способный к существованию в самом широком диапазоне условий внешней среды. Экологические исследования на базе современных методов показали, что культуру Legionella spp. можно выделить из 40% пресных водоемов, а в 80% водоемов легионеллы выявляют методом ПЦР [7, 8, 12]. Известно, что в природных водоемах концентрация легионелл обычно не превышает 103 КОЕ на литр, в то время как в потенциально опасных водных системах (система горячего водоснабжения, градирни, джакузи) концентрация может возрасти до 106 — 107 КОЕ на литр, что в целом ряде случаев приводит к возникновению эпидемических вспышек и спорадических случаев легионеллезной инфекции. Так, по данным Европейской рабочей группы по легионеллезу (EWGLI) с 2002 по 2007 годы в европейских странах зарегистрировано 215 вспышек и групповых случаев легионеллеза, связанных с превышением допустимого уровня легионелл в системе горячего водоснабжения [11, 13].
Температурный фактор является важнейшим в экологии легионелл и эпидемиологии легионеллезной инфекции. Легионеллы выделяют из систем горячего водоснабжения при температуре порядка 66°С и при 70°С из природной воды, но при температуре более 70°С выделить легионеллы не удавалось [14]. Легионеллы способны выделять CO2 при 51,6°С, подтверждая активность ряда ферментных систем микроорганизма при этой температуре. Yee R.B. и Wadowsky R.M. показали, что в природе легионеллы активно размножаются при температуре от 25°С до 45°С, а оптимум лежит между 37 и 42°С [16]. Этот температурный диапазон соответствует температурному режиму эксплуатации джакузи и СПА-бассейнов. Аналогичную температуру достаточно часто выявляют в застойных участках системы горячего водоснабжения или в воде, циркулирующей в градирне [7, 13]. Дезинфекция потенциально опасных водных систем и снижение в них концентрации легионелл до безопасного для человека уровня является в настоящее время единственным реальным путем профилактики легио-неллеза [5, 6]. В этой связи, анализ устойчивости L.pneumophila к действию температурного фактора приобретает особую актуальность. Температура воды является естественным регулятором численности легионелл в потенциально опасных водных системах, способным, с одной стороны, обеспечить активное размножение легионелл до опасной для здоровья человека концентрации, а с другой — обеспечить элиминацию или значительное снижение концентрации возбудителя в системе до безопасного уровня.
В данной работе изучено влияния температуры воды в диапазоне от 40°С до 70°С на жизнеспособность планктонных форм и модельных биопленок Legionella pneumo-phila в экспериментальных условиях с целью выбора оптимального температурного режима для использования в качестве одного из профилактических подходов при эксплуатации потенциально опасных водных систем.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе были использованы штаммы Legionella pneumophila из коллекции ФНИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи (референс-штамм Philadelphia 1, выделенный из легочной ткани пациента в 1979 г., и штамм Pyshma-3, выделенный из системы горячего водоснабжения г.Верхняя Пышма в 2007 г.). Штаммы легионелл выращивали на плотной агаризованной среде буферный угольно-дрожжевой агар (БУДРАГ, BCYEa) с ростовой добавкой («Oxoid») при 37°С в течение 48 ч. Суспензию выросшей культуры легионелл вносили в объеме 1 мл во флаконы с 1 литром стерильной водопроводной
воды до конечной концентрации 103,104,105 КОЕ на литр. Для оценки действия температуры на суспензию возбудителя использовали температуру 40°, 50°, 60° и 70°С. Экспозиция культуры микроорганизмов в различной концентрации составляла, соответственно, 3, 6 и 24 часа при различной температуре.
Далее высев, количественный учет и идентификацию легионелл из воды и биопленок проводили в соответствии с [2].
Для определения количества бактерий в исследуемой пробе воды использовали формулу: Х=[(ахЪ):е]х (1:8), где: X — количество бактерий на литр в исследуемой пробе, а — количество бактерий, выросших на чашке, Ъ — объем концентрата в мл, с — объем, высеянный на чашку в мл, 8 — объем исходной пробы в литрах.
Для определения количества бактерий в исследуемой пробе брали чашку с наибольшим количеством выросших колоний.
Биопленки легионелл получали в 96-луночных плоскодонных пластиковых планшетах для имму-ноферментного анализа в соответствии с [1]. Экспозиция биопленок легио-нелл при вышеуказанной температуре также составляла 3, 6 и 24 часа.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
Анализ действия различных температурных режимов на планктонные формы и модельные биопленки легионелл свидетельствует, что температура
§
и а
о с х
1С
с о с
ее
Й Й Й Й Й Й
Е- Е- Е- Е- Е- Е-
О О О о О О
С С С с С С
а а а а а а
Е- Е- Е- X Е- Е- Е-
5: 5: 5: 5: 5: 5:
Й Й Й
Е- Е- Е-
О О О
С С С
а а а
Е- Е- Е-
¡X 5: 5:
Й Й Й
Е- Е- Е-
О О О
С С С
а а а
Е- Е- Е-
5: 5: ¡X
Й Й Й
Е- Е- Е-
О О О
С С С
а а а
Е- Е- Е-
5: 5: ¡X
Й Й Й
Е- Е- Е-
О О О
С С С
а а а
Е- Е- Е-
5: 5:
О ООО
Я
тТСЧО"*
С
а
с а
'22
I ос
* ^у
1 ^^^ о (-ч ОП^
сЪ сЪ а Нет ° 5 о ^
** ч©
гч л
-1 *** И Ох
-1ХХ и
¡х
<3 <3 ООЧО X
С
а
Е-
ас
О ООО
е н £ ■ф а
с^з
оо^ *х*х.£
с а
^о ^ 5 Е-
УХ
с а
сЪ сЬ о сЬ сЬ о о о сЪ сЬ о сЪ сЬ о сЬ о сЬ
X X X X X X X X
гч X гч 00. 00. гч
оп ОС оп оп оп оп гч
тТ тТ тТ тТ тТ тТ тТ тТ тТ т тТ тТ
О о тТ о о ^ о о тТ о о о о о о о
о о о
X X X X X X X
оп гч оп гч ш гч
оп 00 гч ОС гч гч оп гч
ООО о г
2 2 * *х *х ■
б "
к ^
И
К £
л 5Г
С ¡г
2 а
а
о
¡г
■я-
а
о
¡г
б "
К ^ И
К &
л £
С ¡г
2 2 * *х *х ■
Г^ОО., С1
а
о
¡г
■я-
а
о
¡г
1?
£ р-
воды является естественным регулятором концентрации и жизнеспособности легионелл в целом в условиях эксперимента (табл.). Если при 40°С сохраняются благоприятные условия для сохранения жизнеспособности и наблюдается незначительное увеличение концентрации возбудителя, то в диапазоне температуры от 50° до 60°С происходит значительное снижение количества жизнеспособных клеток легионелл. В то же время, полной элиминации микроорганизмов при температуре 60°С в условиях эксперимента не происходило. Более того, модельные биопленки легионелл частично сохраняли жизнеспособность при температуре 60°С, и лишь экспозиция при температуре 70°С приводила к гибели биопленок и планктонных форм бактерий. Показана зависимость сохранения жизнеспособности легионелл от исходной концентрации возбудителя в воде и длительности экспозиции при различной температуре. Так, если при температуре 60°С и концентрации легионелл в диапазоне 103 — 104 КОЕ на литр было достаточно 6-часовой экспозиции, то при концентрации легионелл 105 КОЕ на литр полной элиминации легионелл из воды достигали лишь при 24-часовой экспозиции.
ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенные ранее исследования свидетельствуют о достаточно высоком уровне контаминации легионеллами систем горячего водоснабжения закрытого типа общественных зданий (гостиницы, больницы, торговые центры) в Московском регионе [3, 7]. В этой связи, весьма актуальным является вопрос о разработке комплекса профилактических мероприятий, позволяющих исключить размножение легионелл в этих системах до опасных для человека концентраций.
В настоящее время в отношении легионелл практически во всех европейских странах, США, Российской Федерации введены предельно допустимые концентрации микроорганизма для различных типов потенциально опасных водных систем [4, 11, 13]. Необходимо понимать, что все эти нормативы подобраны эмпирически на основании многолетнего опыта проведения профилактических мероприятий и анализа эпидемических вспышек легионеллеза в различных странах мира и охватывают некую «условную буферную зону» между концентрацией легионелл в природных и искусственных водных системах, не представляющую опасности для населения, и уровнем концентрации легионелл в потенциально опасных водных системах при вспышках болезни легионеров с установленным источником распространения возбудителя. Легионеллы являются убиквитарными микроорганизмами в водной среде. Поэтому в отличие от многих других возбудителей инфекционных заболеваний, способных к размножению в воде, полностью элиминировать легионеллы из водных объектов невозможно. Более того, существенное превышение допустимых концентраций легионелл в потенциально опасных водных системах не обязательно приводит к немедленному возникновению случаев инфекции.
Допустимые показатели для L. pneumophila в потенциально опасных водных системах были введены в Российской Федерации СанПином 3.1.2.2626-10 «Профилактика легионеллеза» и предусматривают уровень не более 103 КОЕ на литр воды для систем горячего водоснабжения; для горячей воды ЛПУ в отделениях групп риска рекомендован нулевой уровень [4].
Для борьбы с легионеллами в потенциально опасных водных системах за последние 15 — 20 лет использовали достаточно широкий спектр химических агентов и физических факторов, в том числе таких как хлор- и бром-содержащие биоциды; дезинфектанты на основе перекиси водорода; ионы серебра и меди; ультрафиолет; термический шок; озонирование и другие [6, 9]. Необходимо отметить, что использование большинства применяемых за рубежом методов профилактики в системах горячего водоснабжения возможно в условиях нецентрализованного, локального водоснабжения. Для населения крупных городов и мегаполисов Российской Федерации традиционно характерно централизованное снабжение горячей водой. В
этих условиях применение химически активных веществ, к которым относится большинство биоцидов, не представляется перспективным, тем более данные об их эффективности весьма противоречивы [10, 15].
Практически единственным методом, который можно рекомендовать для отечественных систем горячего водоснабжения закрытого типа, является термический шок, то есть кратковременное нагревание воды до температуры не менее 70°С. За рубежом термический шок применяется достаточно широко. Метод хотя и не приводит к элиминации легионелл, но обеспечивает заметное снижение концентрации возбудителя в системе [13].
Полученные в работе данные свидетельствуют, что только при повышении температуры до 70°С в условиях эксперимента имеет место полная элиминация легионелл как в воде, так и биопленках. Конечно, результаты, полученные на модельных биопленках, нельзя полностью экстраполировать на природные биопленки микроорганизмов, образующиеся в трубах систем горячего водоснабжения в условиях многолетней эксплуатации, т.к. они, скорее всего, будут отличаться более высокой устойчивостью [8, 9]. Но с учетом того, что полной элиминации легионелл из системы горячего водоснабжения не требуется в соответствии с действующим законодательством, наиболее выраженное бактерцидное действие на планктонные формы легионелл в системе и значительное снижение жизнеспособности бактериальных клеток в биопленках в условиях прогревания при 70°С не позволит концентрации легионелл превысить допустимый уровень 103 КОЕ на литр при периодическом краткосрочном прогревании воды в системе водоснабжения при данной температуре. Полученные результаты будут полезны для разработки эффективной и рациональной стратегии обеспечения микробиологической безопасности эксплуатации систем горячего водоснабжения в нашей стране.
ЛИТЕРАТУРА
1. Карпова Т.И., Дронина Ю.Е., Алексеева Н.В. и др. Формирование биопленок Legionella spp. в эксперименте. Журн.микробиол. 2008, 1: 3-7.
2. МУК 4.2.2217- 07 «Выявление бактерий Legionella pneumophila в объектах окружающей среды», 2007.
3. Садретдинова О.В., Груздева О.А., Карпова Т.И. и др. Контаминация Legionella pneumophila систем горячего водоснабжения зданий общественного назначения, в том числе лечебно-профилактических учреждений. Клин. микробиол. антимикроб. хи-миотер. 2011, 2: 163-167.
4. СП 3.1.2.2626-10 «Профилактика легионеллеза», 2010.
5. Онищенко Г.Г., Демина Ю.В., Тартаковский И.С. Современная концепция организации эпидемиологического надзора за легионеллезной инфекцией. Журн. микробиол. 2009, 5: 85-91.
6. Тартаковский И.С., Демина Ю.В. Методология и стандарты профилактики легионеллеза. Жизнь без опасности. 2010, 4: 108-120.
7. Тартаковский И.С., Груздева О.А., Галстян Г.М., Карпова Т.И. Профилактика, диагностика и лечение легионеллеза. М., 2013.
8. Colbourne J.S., Dennis P. J. The ecology and survival of Legionella pneumophila. Water and Environment J.1989, 3: 345-350.
9. Declerck I.P. Biofilms:the environmental playground of Legionella pneumophila. Environ. Microbiol. 2010, 12 (3): 557-566.
10.Exner M., Kramer A., Lajoje L. et.al. Prevention and control of health care-association waterborne infections in health care facilties. Am. J. Infection Сontrol. 2005, 33 (5): 2640.
11. EWGLI Technical guidelines for investigation, control and prevention of Travel associated Legionnaires Disease. 2011, ECDC.
12. Fields B.S., Benson R.F., Besser R.E. Legionella and Legionnaires Disease:25 years of investigation. Clin. Microbiol. Rev. 2002, 15 (3): 506-526.
13. Legionella and prevention of Legionellosis. J.Bartram (ed.). WHO, 2007.
14. Sheehan K.B., Henson J., Ferris M. Legionella species diversity in an acidic biofilm community in Yellowstone National park. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71 (1): 507-511.
15. Saby S.,Vidal A., Suty H. Resistance of Legionella to disinfection in hot water distribution systems. Water Sci.Technol. 2005, 52 (8): 15-28.
16. Yee R.B., Wadowsky R.M. Multiplication of Legionella pneumophila in unsterilized tap water. Appl. Environ. Microbiol. 1982, 43: 1330-1334.
Контактная информация: Тартаковский Игорь Семенович, 123098, Москва, ул.Гамалеи, 18, р.т. (499)180-25-81
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Н.И.Брико, А.Я.Миндлина, Р.В.Полибин
УНИВЕРСАЛЬНОСТЬ ИЗМЕНЕНИЙ В ПРОЯВЛЕНИЯХ ЭПИДЕМИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА АНТРОПОНОЗНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЗА ПОСЛЕДНИЕ ДЕСЯТИЛЕТИЯ
Первый московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова
Цель. Выявление основных закономерностей антропонозных инфекций с разной степенью управляемости и факторов, определяющих их, в современных социально-демографических условиях. Материалы и методы. Проведен сравнительный ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости населения вирусным гепатитом А, шигеллезами Зонне и Флекснера, ротавирусной инфекцией, коклюшем, дифтерией, ветряной оспой, краснухой, пневмококковой инфекцией и возможных факторов риска по 47 европейским странам и территориям РФ. Максимальная глубина поиска составила 89 лет. Результаты. Показано, что для антропонозных инфекций, независимо от степени их управляемости, характерны общие эпидемиологические закономерности, проявляющиеся в наличии в многолетней динамике заболеваемости больших и малых циклов, изменении возрастной структуры заболеваемости и ее выраженной территориальной неравномерности. Установлено, что интенсивность эпидемического процесса антропонозных инфекций и особенности его проявлений во многом определяются демографической ситуацией, численностью детского населения, в том числе посещающего детские дошкольные учреждения, числом детских дошкольных учреждений и степенью их наполнения. На фоне уменьшения в возрастной структуре населения детей происходило снижение заболеваемости многими детскими инфекциями. Заключение. Универсальность изменений в проявлениях эпидемического процесса антропонозных инфекций во многом определяется особенностями демографической ситуации.
Журн. микробиол., 2015, № 5, С. 12—20
Ключевые слова: антропонозы, проявления эпидемического процесса, демографическая ситуация, антропонозы, степень управляемости инфекций
N.I.Briko, A.Ya.Mindlina, R.V.Polibin
UNIVERSALITY OF CHANGES IN EPIDEMIC PROCESS MANIFESTATIONS OF ANTHROPONOSIS INFECTIONS IN RECENT DECADES
Sechenov First Moscow State Medical University, Russia
Aim. Detection of main regularities of anthroponosis infections with various degrees of manageability and factors that determine them in contemporary social-demographic conditions. Materials and methods. A comparative retrospective epidemiologic analysis of morbidity of the population with viral hepatitis A, Sonnei and Flexneri shigellae, rotavirus infection, pertussis, diphtheria, varicella, rubella, pneumococcal infection and possible risk factors by 47 European countries and territories of Russian Federation was carried out, the maximum depth of search was
