CC BY
2
С А. Г. БОЙЦОВ. О. Н. ЛАСТОВКА. 2003 УДК 614.777:579.842.141-078
А. Г. Бойцов, О. Н. Ластовка
ВЫДЕЛЕНИЕ СУБЛЕТАЛЬНО ПОВРЕЖДЕННЫХ ШТАММОВ САЛЬМОНЕЛЛ ИЗ ВОДЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОДОЕМОВ
Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И. И. Мечникова
Гибели микроорганизмов под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды может предшествовать особое состояние, обозначаемое как сублетальное повреждение. Причины возникновения таких повреждений многообразны, а главным их проявлением с практической точки зрения является временная утрата способности микроорганизмов к росту на элективных или обогатительных питательных средах, обычно используемых для их выделения. Отсутствие роста может быть причиной ошибочного заключения об отсутствии искомых микроорганизмов в исследуемом объекте (1). Во избежание этого, например, в процедуру исследования некоторых пищевых продуктов и объектов окружающей среды включают особую процедуру предобогашения — первоначальный посев исследуемого материала в неэлективную питательную среду: питательный бульон (ПБ), забуференную пептонную воду (ЗПВ) с последующим пересевом в обогатительную среду, содержащую факторы, подавляющие развитие сопутствующей микрофлоры.
Процедура предобогащения широко используется при исследовании пищевых продуктов [10] и включена в качестве обязательного элемента в ряд нормативных документов [3, 4]. Вопрос об использовании предобогащения при исследовании воды поверхностных водоемов не столь однозначен. С одной стороны, присутствие поврежденных патогенных и санитарно-показательных бактерий в воде было показано неоднократно [ 1 ], с другой стороны, информация об эффективности предобогащения при выделении сальмонелл из воды поверхностных водоемов и сточных вод противоречива. Ряд авторов считают его использование целесообразным (2, 8), другие, напротив, находят эту процедуру излишней [6, 7].
Возможными причинами разногласий в оценке целесообразности применения предобогащения при исследовании воды поверхностных водоемов могут быть расхождения в параметрах предобогащения; различия в уровнях микробного загрязнения исследуемой воды.
Известно, что параметры предобогащения включают виды используемых питательных сред, продолжительность и температуру инкубации среды, соотношение пересеваемый объем/объем обогатительной среды.
Анализ данных литературы и ряд предварительных экспериментов позволили определить два параметра предобогащения — вид обогатительной среды и соотношение пересеваемый объем/объем обогатительной среды. В настоящее время имеются убедительные свидетельства преимуществ использования в данном случае среды Раппопорта и ее модификаций [9, 12]. Это позволило нам остановить свой выбор на отечественной модификации магниевой среды, предложенной Г. П. Калиной и В. Л. Шигановой в 1972 г. и официально рекомендованной к использованию при исследовании воды поверхностных водоемов [5]. При исследовании пищевых продуктов для среды Раппопорта—Вассилиадиса оптимальным оказалось соотношение 0,1:100 (0,1 см3 проинкубированной среды предобогащения засевается в 100 см3 обогатительной среды) [II). В серии предварительных экспериментов нам удалось показать, что указанное соотношение предпочтительнее по сравнению с соотношениями 10:100 и 1:100 и при исследовании воды поверхностных водоемов. Необходимо подчеркнуть, что увеличение в части экспериментов времени инкубации восстановительной среды до 20—24 ч вело к существенному снижению результативности исследования.
В качестве сред предобогащения нами были выбраны ПБ [2] и ЗПВ [6] и опробованы три схемы исследования. Схема 1 предусматривала посев трех объемов воды по 100 мл каждый в равное количество ПБ и инкубацию при 37*С в течение 12—16 ч. Затем 0,1 мл проинкубированной среды предобогащения переносили в 100 мл магниевой среды и дальнейший ход исследования совпадал с общепринятым. Схема 2 отличалась от первой заменой ПБ 1% ЗПВ. Схема 3 предусматривала инкубацию ЗПВ при 43°С. Во всех случаях эффективность предобогащения оценивали путем сопоставления полученных результатов с результатами прямого посева трех объемов воды по 100 мл в магниевую среду удвоенной концентрации.
Предобогащение в ПБ (схема I) было использовано при исследовании 138 проб воды поверхностных водоемов, при этом сальмонеллы были обнаружены только при прямом посеве на магниевую среду в 10 пробах, только при использовании предобогащения в 26 пробах и двумя методами одновременно в 25 пробах. Таким образом, сальмонеллы обнаружены при использовании предобогащения в 51 случае, что достоверно больше (р = 0,95) по сравнению с посевом на магниевую среду (см. таблицу).
ЗПВ, инкубируемая при 37°С (схема 2), была использована в качестве восстановительной среды при исследовании 91 пробы воды. В этой серии исследований без предобогашения сальмонеллы удалось обнаружить в 7 пробах, с предобогашением — в 34 (различия достоверны при р = 0,90).
В случае инкубации проб в ЗПВ при 43°С (схема 3) сальмонеллы были обнаружены в 16 из 40 проб, а без предобогащения — в 5. Различия статистически недостоверны, что связано, по нашему мнению, с небольшим числом наблюдений.
При параллельном использовании нескольких из вышеуказанных схем предобогащения нам не удалось выявить существенных преимуществ ни у одной из них. Так, при исследовании 51 пробы воды параллельно по схемам 1 и 2 сальмонеллы были обнаружены соответственно в 18 и 19 случаях, а при исследовании 40 проб по схемам 2 и 3 — в 15 и 16 случаях.
Безусловный интерес представляет вопрос об эффективности предобогашения при выделении сальмонелл из воды в зависимости от исходного уровня ее контаминации сопутствующей микрофлорой, так как явление микробного антагонизма, по-видимому, в значительной степени может снизить эффективность восстановления
Эффективность использования методов предобогашения по сравнению с прямым посевом в магниевую среду
Предобогащснис в
Сальмонеллы обнаружены ПБ ЗПВ при 37*С ЗПВ при 43'С
абс. % абс. % абс. %
Только после предобогащения 26 19 20 22 9 23
Только без предобогашения 10 ' 7 7 8 5 13
Одновременно двумя методами 25 18 14 15 7 18
Не обнаружены двумя методами 77 56 50 55 9 23
Всего... 138 100 91 100 40 100
во
70 60 50 40 ЗО
го ю о
<10000 <юоооо >100000
Рис. 1. Эффективность предобогащения в зависимости от индексов ЛКП.
По оси абсцисс — индекс ЛКП (в КОЕ/дм1). Здесь и на рис. 2: по оси ординат — находка сальмонелл (в %); а — с предобогашением, б — без предобогащения.
пробы на неэлективной среде предобогащения. В связи с этим мы проанализировали эффективность предобогащения на П Б проб воды с различными индексами лак-тозопозитивных кишечных палочек (ЛКП) и уровнями общей микробной обсемененности. Полученные при этом результаты свидетельствуют о том, что количество ЛКП практически не влияет на выделение сублетально поврежденных сальмонелл (наиболее высокая эффективность предобогащения отмечена при индексах ЛКП более 10 ООО клеток на 1 дм3) (рис. 1). Высеваемость сальмонелл при увеличении общего количества бактерий до 2000 клеток на 1 см3 и более как с использованием предобогащения, так и без него оказалась одинаковой (рис. 2).
Этот факт может быть обусловлен двумя причинами: во-первых, обилие микробной флоры может свидетельствовать о минимальном уровне воздействия стресси-рующих факторов, а следовательно, и об отсутствии сублетально поврежденных сальмонелл; во-вторых, явление микробного антагонизма может негативно сказаться на процедуре предобогащения. Однако, учитывая, что и при высоких уровнях микробного загрязнения высеваемость сальмонелл с использованием предобогащения не снизилась ниже уровня прямого посева, чего скорее следовало бы ожидать в результате интенсивного подавления роста этих микроорганизмов на неэлективной среде, более обоснованным представляется первое предположение.
Таким образом, использование предобогащения в неэлективной питательной среде позволило в 1,4—1,6 раза повысить высеваемость сальмонелл из воды поверхностных водоемов, при этом эффективность метода мало зависит от типа среды предобогащения (ПБ или ЗПВ) и температуры инкубации. В то же время использование этого методического приема значительно увеличивает трудоемкость исследования. Поэтому его использование целесообразно, на наш взгляд, при проведении исследований по эпидемическим показаниям или же в случаях изучения воздействия комплекса физических и химиче-
80 г 10 ■
<гоо <гооо >2000
Шб
Рис. 2. Эффективность предобогащения в зависимости от общего количества бактерий.
По оси абсцисс — общее количество бактерий (в КОЕ/см1).
ских факторов на находящиеся в воде микроорганизмы и формирование при этом у них сублетальных повреждений.
Л итература
1. Бойцов А. Г. // Гиг. и сан. - 1991. - № 8. - С. 67-69.
2. Виноградова Л. А. // Методы индикации биоценоза патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов в объектах окружающей среды. — М., 1985.
- С. 42-53.
3. ГОСТ Р 50455—92. Мясо и мясные продукты. Обнаружение сальмонелл (арбитражный метод). — М., 1993.
4. ГОСТ Р 50480—93. Продукты пищевые. Метод выделения бактерий рода Salmonella. — М., 1993.
5. Методические указания по санитарно-микробиоло-гическому анализу воды поверхностных водоемов. № 2285-81. - М„ 1981.
6. Alcaide £., Martinez J. P., Garay E. // J. Appl. Bacteriol.
- 1984. - Vol. 56, № 3. - P. 365-371.
7. Alcaide E., Aznar R., Pujalate M. J., Garay E. // Zbl. Bacteriol. - 1987. - Bd 184, № 1. - S. 34-41.
8. Fricker C. R. // Ibid. - 1984. - Bd 119, №2. -S. 170-178.
9. Harvey R. W. S., Price Т. H. // J. Hyg. - 1987. -Vol. 87, № 2. - P. 219-224.
10. Mattick K. L., Jorgensen F., Legan J. D et al. //J. Food Prot. - 2001. - Vol. 64, № 10. - P. 1472-1476.
11. Tongpim S., Weumer R. R., Tammings S. K., Kam-plemacher E. H. // Int. J. Food Microbiol. — 1984. — Vol. 1, № 1. - P. 33-42.
12. Vassiliadis P., Trichopoulos D., Kalapothaki V., Serie Ch. I I J. Hyg. - 1981. - Vol. 87, № 1. - P. 35-41.
Поступила 18.04.02
Иа Ш
С КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2003 УДК 614.37:«15.46/.47)-07
В. Г. Лаппо, Н. М. Перова, Р. И. Каюмов, А. П. Еськов
ОЦЕНКА МЕСТНО-РАЗДРАЖАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ МЕДИЦИНСКИХ ИЗДЕЛИЙ IN VITRO НА СПЕРМЕ БЫКА
Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники Минздрава РФ, Москва
Оценка местно-раздражающего действия занимает важное место при токсикологических испытаниях изделий медицинского назначения. Этому виду испытаний подвергается более 80% всех медицинских изделий. В связи с этим актуален поиск новых методов, повышающих токсиколого-гигиеническую значимость испытаний, а также позволяющих снизить их продолжительность и стоимость. В настоящей работе нами исследова-
на возможность применения для оценки местно-раздражающего действия изделий медицинского назначения метода in vitro на кратковременной суспензионной культуре подвижных клеток — сперме быка. Этот метод in vitro давно и успешно используется в практике аккредитованных лабораторий для оценки общей токсичности самых разнообразных изделий [1, 5]. В последнее время были разработаны методики, позволившие применить
